邓增钦[1]2014年在《格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌铁吸收调控蛋白Fur和马动脉炎病毒解旋酶nsp10的结构与功能研究》文中提出铁对许多基本的生物反应过程都是必需的,例如DNA的合成、呼吸作用、叁羧酸循环等。虽然铁对生命过程是必需的,但是细胞内的铁浓度过高会引发Haber-Weiss反应而产生高活性的自由基,从而对细胞产生毒害作用。大部分细菌通过铁吸收调控蛋白(Ferric uptake regulator,Fur)来精细地调控细胞中的铁浓度。最近在格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense) MSR-1中发现并鉴定了fur基因。MSR-1 Fur直接调控参与铁转运和细胞氧代谢的关键基因的表达,同时在磁小体的合成中起重要作用。MSR-1 fur也能够回补E. coli的fur基因缺失的表型。本实验室解析了未被金属离子激活的MSR-1 Fur (apo-Fur)的结构,其由N端的DNA结合结构域(DBD)和C端的二聚化结构域(DD),以及连接两个结构域的铰链区(Hinge)组成。在晶体结构中,MSR-1 apo-Fur形成不依赖于金属离子的二聚体。在以上研究结果的基础上,本研究利用凝胶过滤层析和分析超速离心实验证明,溶液中MSR-1 apo-Fur也是形成不依赖于金属离子的二聚体。利用DNase Ⅰ足迹法证明MSR-1 Fur能够特异性地识别二价铁转运系统基因feoABl的启动子上一段25 bp的序列(feoAB1 operator),同时EMSA实验证明MSR-1 Fur只有在Fe2+存在的条件下才能结合feoABl operator和E. coli Fur box。本研究进一步解析了金属离子激活的MSR-1 Fur (holo-Fur)的结构,发现MSR-1 Fur含有两个金属离子结合位点,分别是位于DBD和DD之间的S1和位于DD内部的S2。两个位点都形成六配位的八面体,其中S1位点对于金属离子的结合能力强于S2。虽然在体外S2对DNA的结合不是必需的,但是在体内这两个金属离子结合位点对于MSR-1 Fur的功能都是必需的。金属离子结合MSR-1 Fur后诱导Fur发生构象变化,使DBD上识别DNA的α螺旋处于合适的位置,从而使MSR-1 Fur获得了结合DNA的能力。为了解释Fur识别DNA的分子机制,本研究还分别解析了MSR-1 Fur与feoABl operator以及MSR-1 Fur与E. coli Fur box的蛋白-DNA复合物结构,并结合生化分析和体内实验证明：MSR-1 Fur主要利用Arg57来特异性地识别碱基G,同时Lys15插入到一段宽度变窄、表面负电荷加强的DNA小沟中,形成增强的电荷作用；计算模拟发现这段DNA小沟的变窄是由DNA序列的内在性质决定的,即Lys15特异性地识别DNA小沟构象。通过与其它细菌的Fur结构比较发现,DBD上参与DNA互作的关键氨基酸残基很保守,并且空间结构上的位置相同,预示细菌中Fur识别DNA的机制很保守。以上研究结果为阐明细菌中Fur是如何被金属离子激活以及激活后的Fur是怎样特异性地识别目的DNA的分子机制提供了结构生物学证据。解旋酶是一类能够利用水解ATP产生的能量,沿着核酸移动并解开DNA或者RNA双链的酶,是生物体内分布最广的一类酶,在许多生物过程中起重要作用。所有的细胞生物和很多病毒都编码解旋酶。根据解旋酶的一级序列特征将其分为六个超家族(SFI-SF6)。目前对于SF1解旋酶的理解主要来自对细胞生物解旋酶的结构和功能研究。解旋酶是尼多病毒进化上最保守的两个非结构蛋白之一,对马动脉炎病毒(Equine arteritis virus, EAV)解旋酶nsp10的研究发现其属于SF1超家族。EAV nsp10对于病毒的基因组RNA和亚基因组RNA的合成是必需的,其N端含有独特的锌结合结构域ZBD (zinc binding domain),是尼多病毒所独有的,不存在于其它RNA病毒中。本研究通过体外生物化学的方法证明,大肠杆菌表达的重组EAV nsp10Δ(氨基酸残基第1-402位)依然具有和全长蛋白一样的ATP水解酶和解旋酶的活力；同时解析了nsp10Δ单体及其与poly(dT)的复合物结构。EAV nsp10Δ主要由N端的ZBD、C端的解旋酶核心区域1A和2A(HEL1)以及连接两者的1B结构域构成。ZBD螯合叁个锌离子,由RING-like模块和treble-clef锌指结构组成。结构和生化分析证明EAV nsp10对核酸的结合无序列依赖性,nsp10的酶活力依赖于ZBD和HEL1之间的相互作用网络。之前的研究中鉴定的一些ZBD位置上的突变,都是由于直接或间接地破坏了ZBD和HEL1之间的相互作用而使EAV nsp10的酶活力丧失。为了研究马动脉炎病毒属的解旋酶结构的保守性,本研究还解析了该属的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)的解旋酶nsp10的结构。比较两者的结构发现,动脉炎病毒解旋酶的叁维结构非常保守。通过对比目前解析的SF1解旋酶发现,EAVnsp10和人解旋酶Upfl的结构最相似。Upfl在细胞中的一个主要功能是参与无意义介导的mRNA质量控制,鉴于尼多病毒的具有很大的复制酶阅读框ORF1ab (9.5kb-21kb),本研究推测尼多病毒的解旋酶可能具有控制病毒mRNA质量的功能。综上所述,本论文的第二部分第一次解析了尼多病毒中一种主要的酶以及药物靶标(马动脉炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒解旋酶nsp10)的叁维结构。鉴于尼多病毒解旋酶序列的保守性,本研究解析的EAV nsp10和PRRSV nsp10的结构有利于将来研究其它尼多病毒(如冠状病毒)的解旋酶的结构和功能。EAV nsp10和Upfl的结构相似性将病毒和细胞解旋酶的研究联系起来,有助于理解这类重要的酶的进化和功能。
李峰[2]2004年在《格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌（Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1）磁小体合成相关基因的克隆及其功能分析》文中进行了进一步梳理格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1)为趋磁螺菌属(Magnetospirillum)的模式菌株，能够在胞内合成大小约为42am的磁小体(Magnetosome)。实验之初，该菌尚不能在平板上形成菌落，其遗传操作体系尚未建立，难以从分子水平研究其磁小体合成机制。本实验初步建立了该菌简便有效的遗传操作体系。此体系包括：以平板封膜培养技术获得单菌落，在选择性培养液中进行遗传因子接合转移，以液体培养和磁铁吸附技术筛选突变子。并利用此体系，通过接合转座诱变技术，获得了2个磁小体缺失突变株：NM4、NM21。Southern杂交验证磁小体缺失突变确为Tn5插入所致。 以Tn5为标签，用锚定PCR法克隆出突变株NM4的Tn5侧翼序列。并以此侧翼序列为标签继续用锚定PCR法向两边延伸，克隆出一个5045bp的DNA片段。该片段由6个ORF组成，Tn5插入在3621 bp-3622bP间，位于ORF4起始密码子下游的84bp处，ORF4因Tn5插入失活，通过功能互补实验证明该片段与磁小体合成相关。通过对ORF4编码蛋白同源比较和功能分析，推测ORF4编码蛋白可能的功能有两种：具ATPase活性，在磁小体合成过程中为铁转运提供能量；或参与磁小体合成启动过程中的信号转导。 用锚定PCR法从NM21中克隆出Tn5侧翼序列，得到一个大小为3073bp的DNA片段，此片段由3个ORF组成，与M.magnetotacticum MS-1的对应片段具有89％的同源性。Tn5插入位点在1428bp—1429bp之间，在ORF1起始密码子下游459bp处。ORF1与ORF2仅间隔29bp，可能组成一个操纵子。ORF2与ORF3有14bp的重复。经疏水性和跨膜区分析，ORF1编码的蛋白含有5个疏水区、4个跨膜区，应为跨膜蛋白。功能互补实验证明其与磁小体合成相关。经同源比较和保守性结构域分析，推测ORF1编码的蛋白具有Fe~(2+)转运功能，在磁小体合成过程中将细胞质中Fe~(2+)转运到磁小体囊泡中，合成磁小体的同时去除Fe~(2+)对细胞的毒害作用。
张云鹏[3]2017年在《磁螺菌Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1中OxyR同源蛋白的功能分析》文中进行了进一步梳理趋磁细菌是能在胞内合成特殊细胞器—磁小体,并沿磁力线排列和运动细菌的总称。磁小体由四氧化叁铁或四硫化叁铁纳米磁颗粒及其外包被的生物膜组成,粒径分布在30～120 nm之间。由于趋磁细菌细胞结构和基因组构成简单,是研究生物矿化的模式生物。目前趋磁细菌的研究主要集中于磁小体合成机制,尤其是磁小体岛基因的研究,岛外基因功能及调控机制的研究较少。前期的实验证据表明磁小体的合成与氧化还原密切相关。本工作以格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1)为材料,研究两个oxyR同源基因的功能及调控机制。实验室在前期工作中已经构建了基因oxyR-Like的缺失突变和互补菌株,通过对其一系列表型的测定,发现其磁小体合成严重受阻,并利用表达谱测定了突变株中基因的总体表达情况,但OxyR-Like的调控机制并没有被阐明。本文利用凝胶阻滞(EMSA)和DNaseI足迹实验深入的研究了 OxyR-Like的调控机制。结果表明,OxyR-Like可以结合MGMSRv-2_0006基因,pdhA基因簇以及mcpA基因的启动子区。利用DNaseI足迹实验找到了 OxyR-Like结合的DNA保守序列5'-ATN{3}AN{5}TTATCA-3'。利用qRT-PCR检测,发现突变株中所有与叁羧酸循环相关的基因表达量均下调,暗示在突变株中能量代谢受到抑制。oxyR-4250基因是MSR-1中另外一个oxyR同源基因。本文构建了 oxyR-4250的缺失突变株和互补菌株,并对其表型进行了测定。结果表明,oxyR-4250缺失突变株生长缓慢,完全失去磁感应能力,且铁吸收能力相比野生型菌株下降五倍。通过透射电镜对突变株进行观察,发现在突变株中磁小体数量变少,粒径变小,并且不再成链排列。EMSA实验结果表明,OxyR-4250可以调控ahpC和sodB基因的表达,证明OxyR-4250在MSR-1中可以调控抗氧化基因的表达。但在MSR-1中OxyR-4250并不调控katE,katG等在大肠杆菌中受OxyR调控的基因,说明在MSR-1中其他抗氧化调控机制的存在。通过在EMSA结合体系中加入还原剂,证明了 OxyR-4250可以响应环境中的氧化还原信号,从而改变其DNA结合能力。但EMSA实验并未发现OxyR-4250可以结合磁小体岛基因簇的启动子区,说明OxyR-4250不能直接调控磁小体的合成。DNase I足迹实验证明OxyR-4250结合DNA的保守序列为5'-TCGATTTNTNTNANNANNANAACTCNT-3'。定点突变后的 EMSA 实验结果证明 OxyR-4250蛋白中212Cys在其结合DNA过程中起关键作用。综上所述,本论文首次阐明了磁螺菌MSR-1中两个oxyR同源基因的功能,明确了 OxyR-Like 调控能量代谢相关的基因并与磁小体合成相关;明确了 OxyR-4250 在 MSR-1 中不同于大肠杆菌中的抗氧化调控机制,为胞内氧化还原的调控与磁小体形成直接相关提供了证据。
佚名[4]2009年在《Cloning and functional analysis of the sequences flanking mini-Tn5 in the magnetosome-deleted mutant NM21 of Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1》文中研究表明格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌（Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1）磁小体合成相关基因的克隆及其功能分析
吴纱[5]2016年在《趋磁螺菌Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1中mamZ基因功能分析》文中研究说明趋磁细菌可在胞内合成纳米级磁小体,为探讨磁小体合成机制,本室前期以趋磁螺菌Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1菌株为材料,采用Tn5随机突变技术,获得了一株无磁性的突变株,经分析发现Tn5插入在基因组mamXY操纵元的mamZ基因序列,本实验拟阐明该基因在细胞生长和磁小体合成过程中作用。为探讨mamZ基因的功能,在分析了mamZ基因结构和定位的基础上,成功构建了mamZ基因的缺失突变株(△mamZ)和不同长度的mamZ基因回补菌株(CmamZ,CpmamZ,CMFS和CredFe)。对菌株的表型和生理、生化检测发现,mamZ基因突变,并不影响细胞生长,但磁响应水平以及对铁的吸收能力显着降低,电镜观察发现,突变菌株胞内的磁小体粒径变小、晶型不规则。岩石磁学分析发现,突变株胞内磁小体为超顺磁颗粒。由此证明,mamZ基因与磁小体合成相关。采用qPCR的方法,探讨mamZ基因与磁小体岛上主要基因的关系,结果发现,突变株△mamZ中mamY和ftsZ-like基因表达量上调,推测由于它们共同定位在mamXY操纵元上可能具有功能互补的作用;mamX和ftsZ-like基因在细胞生长18 h的转录水平高于12 h,可能它们与MamZ蛋白主要在磁小体成熟期发挥功能。实验还发现,在△mamZ突变株、△mamX突变株及相应的回补菌株中,mms6基因的转录水平均明显上调,说明mamZ、mamX或整个mamXY操纵元上基因与mms6之间可能存在某种互作关系。本研究不仅证明了mamZ基因在磁小体成熟期的重要作用,并再一次发现了mamXY操纵元上四个基因功能的互补现象,特别是该操纵元编码四个蛋白与Mms6之间存在某种关联的事实值得进一步验证。
韩秀英, 郭瑞雪, 邵美丽, 周磊, 李峰[6]2013年在《响应面分析法优化磁螺菌(M.gryphiswaldense MSR-1)的培养条件》文中进行了进一步梳理[目的]为了得到磁螺菌Magnetospirillum.gryphiswaldense MSR-1的最佳培养条件。[方法]通过单因素试验分析,确定最适于磁螺菌M.gryphiswaldense MSR-1生长的碳源和氮源分别是乳酸钠和氯化铵,综合考虑pH、乳酸钠和氯化铵3个因素对MSR-1生长的影响,用Design-Expert.8.05b软件的Box-Behnken进行响应面分析,优化MSR-1的培养条件,得到了菌体生长模型,同时取得模型最优值时各因素的水平。[结果]当乳酸钠浓度为3.17 g/L,氯化铵浓度为0.43 g/L,pH为6.98时,理论预测的OD600值为0.797,并在该条件下进行了3次重复验证试验,OD600的平均值为0.792,与理论值基本吻合。[结论]在菌体生长过程中,氯化铵和pH及乳酸钠和pH对菌体的交互作用显着,乳酸钠和氯化铵对菌体生长的交互作用不显着。菌体生长模型达到显着水平,可以对磁螺菌M.gryphiswaldense MSR-1在不同条件下的生长情况进行分析与预测。
佚名[7]2010年在《Functional analysis of hydrogenases and their effects on cell growth and magnetosome synthesis in Magnetospirillum gryphiswaldense》文中研究说明格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌（Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1）磁小体合成相关基因的克隆及其功能分析
霍转转[8]2014年在《趋磁螺菌群体磁性检测仪的研发》文中提出摘要：趋磁螺菌因其能形成磁小体而具有趋磁特性,本文致力于自行设计并组装一种趋磁螺菌群体磁性检测仪,并以趋磁螺菌Magneto spirillum gryphiswaldense MSR-1为测试对象,利用该检测仪半定量检测其群体磁性,以解决趋磁螺菌群体的胞内磁小体形成情况难以表征的困难,为趋磁细菌的磁性表征提供方便、快捷、灵敏的检测手段。首先,本文基于光散射原理自行构建了趋磁螺菌群体磁性检测仪,包括磁系统和光电检测系统。磁系统由永磁体、硅钢片和纯铁片组成,产生42mT匀强磁场；光电检测系统由可充电蓄电池、发光二极管、硅光电池、精密万用表、支架等构成,分别检测趋磁螺菌在匀强磁场与光线平行和垂直时的光散射值。所构建匀强磁场用MATLAB偏微分方程工具箱和ANSYS软件建模并分析后,结果均显示该磁场为匀强磁场,且磁感应强度的实际值与模拟值无显着性差异,具有一致性；光电检测系统具有良好的稳定性和灵敏性。然后,对Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1的培养条件进行了优化研究,以期在具有较高生物量的同时可获得高产量磁小体。分别探索了接种浓度、装瓶量、补充铁源、Zn2+等因素对该菌生长及磁小体形成的影响。结果表明,初始接种浓度为1×106个/mL时延滞期较短且稳定期较长,较为适宜；不充氮气仅通过装瓶量控制氧浓度不能满足该菌生长的需要；在对数期中期补充铁源可以有效增加磁小体产量,平均每个菌体增加4.3个磁小体；补充Zn2+不但不能提高最大生物量和磁小体产量,却扰乱磁小体链状。最后,本文利用以上检测仪检测MSR-1群体磁性,以验证仪器性能。制备梯度样品,使含磁小体菌体占总菌体百分比分别为0%,20%,40%,60%,80%,100%,并测其在平行与垂直磁场下的光散射值,分别记为OD//和OD⊥,定义磁性物理量：Cmag=(OD///OD(?))-1。结果显示,含磁小体菌体百分比与Cmag呈线性相关,一元回归方程为y=2.2029x+0.0519,R2=0.9383；经F检验,回归方程线性在0.01水平上具有显着性；t检验的P值0.001460028<0.0015,说明其回归系数置信度达99.85%以上
姜伟, 孙建波, 李颖, 潘一峰, 张阳德[9]2005年在《环境条件对磁螺菌生长的影响(英文)》文中研究说明目的了解碳源种类及浓度、氧、还原剂等条件对磁螺菌(Magnetospirillumgryphiswaldense)生长的影响;建立深层培养磁螺菌及磁小体的技术。方法在60ml血清瓶中,将供试菌株在不同种类和浓度的碳源培养基,不同氧浓度等条件下培养,测定OD600nm;在5L自动控制发酵罐(L.E.MarubishiCo.Tokyo,Japan)中,控制pH、温度及转速分别为7.2、30℃、400r/min,通气量为1.0L/min￣1.2L/min,氧浓度为0.5%￣0.7%的条件下,以乙酸钠-苹果酸培养基和乳酸钠培养基深层培养供试菌株,测定OD600nm。用高效液相色谱等分析培养过程中碳氮源变化规律;用电子显微镜观察磁小体的合成。结果碳源的种类及浓度是影响该菌生长和磁小体合成的重要因素之一;在乙酸钠-苹果酸培养基和乳酸钠培养基中深层培养25h的细胞密度分别为0.7和1.7OD600nm。结论乳酸钠培养基是适合于磁螺菌快速生长的最佳培养基。建立了深层培养磁螺菌及磁小体的技术和方法,该方法的建立对于大量获得细菌磁小体而进行应用开发具有重要意义。
杨靖[10]2014年在《两种磁螺菌生理特征及mamXY操纵元在MSR-1菌株磁小体合成中的功能》文中进行了进一步梳理趋磁细菌在自然界广泛存在,它们能在胞内合成链状排列的Fe3O4或者Fe3S4纳米磁性颗粒(磁小体),鉴于磁小体的特性及其潜在的应用前景,提高趋磁细菌培养水平始终是人们关注的热点问题。然而由于它们对溶氧和营养条件要求苛刻,目前只有少数几种获得纯培养,且培养水平远达不到生产要求。本研究以淡水磁螺菌Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1和海洋磁螺菌Marine magnetic spirillum QH-2为材料,探讨了二者在不同培养条件下细胞生理变化规律及其与磁小体合成的关系,分别提出了进一步提高淡水和海洋趋磁螺菌的优化培养措施。此外,针对供试菌株共有的mamXY操纵元中唯一的尚未揭示功能的mamX基因为目标,探讨了其与整个操纵元中其它基因在控制磁小体成熟过程中的功能特点。鉴于淡水趋磁螺菌MSR-1已经经过多年的人工驯化,可在发酵罐深层培养,实验中发现,培养8-20h是磁小体大量合成的阶段,此时控制溶氧在2-20ppb有利于磁小体合成。18-20h是细胞生理代谢的一个关键时间转折点,细胞消耗碳源速度加快,需通过手动补料策略添加额外补料培养基以维持细胞的正常生长。20-26h,碳源乳酸浓度应控制在0.016-0.1g/L最有利于细胞生长和磁小体的合成。20-40h是细胞生长对数期,控制溶氧在20-40ppb可确保细胞快速生长,是磁小体组装成链和成熟过程。由此揭示了细胞生理特点变化规律,提出了进一步提高培养水平的工艺路线。QH-2菌株是唯一来自海洋的可以纯培养的趋磁螺菌,本实验成功对其细胞进行了摇床培养,并优化了原培养基配方。确定了其细胞的最适碳源为琥珀酸盐,最适氮源为氯化铵,偏好柠檬酸铁作为铁源,培养温度为25-28℃。在优化条件下显着提高了QH-2细胞的培养水平：液体摇床培养48小时OD600值大于0.6,是优化前的4倍左右；代时为6h,比优化前缩短了10个小时。为该菌株的进一步驯化奠定了基础。由此可见,趋磁螺菌来源不同,培养条件各异,分析菌株的生理特点,有针对性地提出具体培养措施是最有效的选择。为完善磁小体岛mamXY操纵元的功能解析,本研究构建了MSR-1菌株mamX基因的缺失突变株和互补菌株,表型和生理、生化检测发现,突变株可正常生长,但只能形成不规则的Fe3O4超顺磁颗粒。序列分析发现MamX蛋白含有保守的类似于细胞色素c的结合血红素的Magnetochrome结构域,经体外实验证明该蛋白可以与血红素结合,推测在磁小体成熟过程中,MamX可以参于磁小体膜内的电子传递或者铁元素的氧化/还原过程。采用qPCR的方法,探讨mamXY操纵元mamY、mamX、mamZ和ftsZ-like四个基因的转录规律,证明在mamX突变株中,mamY和ftsZ-like基因显着上调,mamZ基因则下调。细菌双杂交实验证实mamXY操纵元编码的四个蛋白之间存在明显互作关系,由此采用STRING工具描绘了以FtsZ-like为节点的蛋白互作网络图,推测这四个蛋白形成蛋白质复合体参与磁小体的成熟过程。实验结果完善了对磁小体岛上mamXY操纵元整体功能的解释,为进一步揭示趋磁螺菌的生物矿化机制提供了实验证据。
参考文献：
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[4]. Cloning and functional analysis of the sequences flanking mini-Tn5 in the magnetosome-deleted mutant NM21 of Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1[J]. 佚名. Chinese Science Bulletin. 2009
[5]. 趋磁螺菌Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1中mamZ基因功能分析[D]. 吴纱. 淮北师范大学. 2016
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[9]. 环境条件对磁螺菌生长的影响(英文)[J]. 姜伟, 孙建波, 李颖, 潘一峰, 张阳德. 中国现代医学杂志. 2005
[10]. 两种磁螺菌生理特征及mamXY操纵元在MSR-1菌株磁小体合成中的功能[D]. 杨靖. 中国农业大学. 2014