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含腈水合酶重组大肠杆菌的固定化

2020-12-02阅读(229)

含腈水合酶重组大肠杆菌的固定化

论文摘要

含腈水合酶的细胞能够催化腈水合反应生产酰胺,具有重要的工业用途。但游离细胞在催化过程中容易失活,破裂的细胞影响产品的分离纯化。固定化细胞技术能有效的解决这些问题。但目前已报道的含腈水合酶固定化细胞稳定性普遍较低,或固定化过程中存在一定的毒性,对细胞伤害较大。为解决上述问题,本研究开展含腈水合酶重组大肠杆菌的固定化研究,选择3-氰基吡啶水合生成烟酰胺作为模型反应,主要结果如下:（1）比较了海藻酸钙、聚丙烯酰胺、卡拉胶、琼脂和DA-F127水凝胶等固定化方法,考察固定化过程的酶活回收率和固定化细胞的批次反应情况。筛选得到两种效果较好的固定化方法,即海藻酸钙固定化法和DA-F127水凝胶固定化法。其中海藻酸钙固定化细胞的酶活回收率达到48.08%,DA-F127水凝胶固定化细胞的酶活回收率达到61.28%。两种固定化细胞均可重复使用3个批次以上,酶活损失较小。（2）对海藻酸钙法进行固定化条件优化。确定固定化的最佳条件为:海藻酸钠浓度为3%,氯化钙浓度为3%,细胞添加量为17.5mg/g载体,优化后海藻酸钙固定化细胞的酶活回收率达到56.73%。确定了固定化细胞最适反应pH为7.0,最适反应温度为18℃。研究了固定化细胞催化生产烟酰胺的反应工艺,确定了最优条件,最优条件下的海藻酸钙固定化细胞可催化150 g/L的3-氰基吡啶完成6个批次的转化,与游离细胞催化过程相比,单位质量菌体的烟酰胺产量提高了 4.91倍。（3）对DA-F127水凝胶法进行固定化条件优化,确定固定化的最佳条件为:DA-F127浓度为15%,UV光照射距离为20 cm、光照时间6 min,菌体包埋量为20 mg/g载体,优化后的固定化细胞酶活回收率为89.74%。确定了固定化细胞最适反应pH为7.0,最适反应温度为18℃对DA-F127固定化细胞催化生产烟酰胺进行初步研究,最优条件下的DA-F127固定化细胞可催化150 g/L的3-氰基吡啶完成至少9个批次的转化。与游离细胞催化过程相比,单位质量菌体的烟酰胺产量提高了 12倍。

论文目录

  • 致谢
  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 烟酰胺
  •     1.1.1 烟酰胺简介
  •     1.1.2 烟酰胺的合成方法
  •     1.1.3 国内外烟酰胺的生产消费概况
  •   1.2 腈水合酶简介
  •     1.2.1 腈水合酶的来源和结构
  •     1.2.2 腈水合酶的催化机理
  •     1.2.3 腈水合酶的性质
  •     1.2.4 腈水合酶的应用
  •   1.3 腈水合酶固定化技术概况
  •     1.3.1 腈水合酶固定化方法
  •     1.3.2 含腈水合酶细胞固定化方法
  •     1.3.3 其他用于固定化细胞的材料
  •   1.4 研究思路和研究内容
  • 第二章 固定化方法的筛选
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验设备与材料
  •     2.2.1 主要试剂
  •     2.2.2 主要仪器
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 样品准备
  •     2.3.2 酶活的相关数据测定
  •     2.3.3 固定化腈水合酶材料筛选
  •     2.3.4 固定化细胞包埋材料筛选
  •     2.3.5 固定化材料的重复批次实验
  •   2.4 结果与讨论
  •     2.4.1 腈水合酶的固定化
  •     2.4.2 含腈水合酶细胞的固定化
  •   2.5 本章小结
  • 第三章 海藻酸钙包埋法
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验设备与材料
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 反应体系缓冲液的配制
  •     3.3.2 海藻酸钙包埋法固定化条件优化
  •     3.3.3 海藻酸钙固定化细胞催化特性
  •     3.3.4 海藻酸钙固定化细胞的重复批次实验
  •     3.3.5 催化反应在去离子水与缓冲液体系中的比较
  •     3.3.6 最适底物浓度
  •     3.3.7 底物分批补料
  •     3.3.8 酶活添加量
  •     3.3.9 海藻酸钙固定化细胞批次反应催化烟酰胺
  •     3.3.10 海藻酸钙固定化细胞的储存稳定性
  •   3.4 实验结果
  •     3.4.1 海藻酸钙包埋固定化条件优化
  •     3.4.2 海藻酸钙固定化细胞催化特性
  •     3.4.3 海藻酸钙固定化细胞催化合成烟酰胺工艺
  •     3.4.4 海藻酸钙固定化细胞的稳定性
  •   3.5 本章小结
  • 第四章 DA-F127水凝胶包埋法
  •   4.1 引言
  •   4.2 实验设备与材料
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 反应体系缓冲液的配制
  •     4.3.2 DA-F127包埋条件的优化
  •     4.3.3 DA-F127固定化细胞催化特性
  •     4.3.4 固定化细胞的重复批次实验
  •     4.3.5 催化反应在去离子水与缓冲液体系中的比较
  •     4.3.6 DA-F127固定化细胞批次反应催化烟酰胺
  •     4.3.7 DA-F127固定化细胞的储存稳定性
  •   4.4 实验结果
  •     4.4.1 DA-F127水凝胶包埋条件优化
  •     4.4.2 DA-F127固定化细胞催化特性
  •     4.4.3 DA-F127固定化细胞批次反应催化烟酰胺
  •     4.4.4 DA-F127固定化细胞的储存稳定性
  •   4.5 本章小结
  • 第五章 结论与展望
  •   5.1 结论
  •   5.2 展望
  • 参考文献
  • 作者简介

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 张颖

    导师: 吴坚平,杨立荣,徐刚

    关键词: 固定化细胞,海藻酸钙,烟酰胺

    来源: 浙江大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 浙江大学

    分类号: Q814.2

    DOI: 10.27461/d.cnki.gzjdx.2019.000725

    总页数: 76

    文件大小: 4340K

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