一、糖皮质激素在免疫-炎症中作用机制的研究进展（论文文献综述）
司东旭[1]（2021）在《肺脾为核心脏腑整体辨证支气管哮喘慢性持续期免疫调控研究》文中研究表明目的基于前期支气管哮喘慢性持续期（Chronic duration of bronchial asthma,CDBA）中医干预方案研究成果,温润方组（Wenrunformulagroup,WRFG）良好控制率75.44%,明显优于常规辨证组（Routine syndrome differentiation group,RSDG）良好控制率 48.33%。本研究进一步通过分子生物学研究,证明“肺脾为核心脏腑整体辨证”的中医干预思路充分反映了中医治疗CDBA的优势与特色。构建基于“肺脾为核心脏腑整体辨证”CDBA免疫调控的生物学依据。方法本研究工作主要依托课题——支气管哮喘慢性持续期中医干预方案,分别在山东中医药大学附属医院、安徽中医药大学第一附属医院、北京中医药大学东直门医院、中国中医科学院西苑医院等四个研究中心,开展同时期、多中心、随机、对照、三盲的临床实用性随机对照优效设计研究。应用“肺脾为核心脏腑整体辨证”观指导思想下形成的“温润辛金培本”原理系列方药（简称温润方）为中医干预方案。共纳入符合研究要求病例128例,将入组病例随机分为WRFG和RSDG。为进一步观察两组治疗前血清免疫球蛋白、白介素谱系分布特点,以及治疗后血清免疫球蛋白、白介素谱系变化趋势,对符合要求的入组患者进行了二次筛选。同时,招募健康人群作为健康对照组（Healthy group,HG）,并收集受试者血清标本。采用ELISA竞争检测方法进行血清标本检测,开展“肺脾为核心脏腑整体辨证”治疗CDBA调节血清免疫球蛋白及血清白介素水平的免疫调控研究。结果1病例信息分析本研究根据现有各组血清病例数,结合纳入排除标准,确定纳入WRFG24例,RSDG 14例、HG 14例。WRFG与RSDG两组患者治疗前中医单项症状体征积分及中医症状体征总积分比较中,只有腰膝酸软1（1,2）（WRFG）、0（0,1）（RSDG）,具有统计学差异。其他单项中医症状体征及中医症状体征总积分均无统计学差异;WRFG与RSDG两组患者治疗后中医单项症状体征积分及中医症状体征总积分比较中,均无统计学差异;WRFG组患者疗前疗后中医单项症状体征积分及中医症状体征总积分比较中,喘息、乏力、口干、心悸、头晕、畏寒肢冷、腰膝酸软、咳嗽、咳嗽性质、咳痰不爽、总分具有统计学差异。其他单项中医症状体征均有下降趋势,但无统计学差异;RSDG组患者疗前疗后中医单项症状体征积分及中医症状体征总积分比较中,气短、乏力、口干、畏寒肢冷、咳嗽、咳嗽性质、总分具有统计学差异。其他单项中医症状体征多有下降趋势,但无统计学差异;WRFG与RSDG中医单项症状体征积分及中医症状体征总积分差值比较中,WRFG在喘息、口苦、口干、心悸、纳呆、腹胀、口渴喜饮、大便不调、夜尿频、头晕、腰膝酸软、总分等方面较RSDG症状积分降低,但均无统计学差异;WRFG与RSDG疗前疗后肺功能比较,两组患者在FEV1%FVC、PEF%等方面无统计学差异。2血清免疫球蛋白2.1治疗前组间比较WRFG血清IgA、IgG水平较RSDG和HG低,具有统计学差异。WRFG血清IgE水平较RSDG无统计学差异,较HG低,具有统计学差异。RSDG血清IgA、IgG、IgE水平较HG无统计学差异。2.2治疗后组间比较WRFG血清IgA、IgG水平较RSDG和HG无统计学差异。WRFG血清IgE水平较RSDG高,具有统计学差异,较HG无统计学差异。RSDG血清IgA、IgG、IgE水平较HG无统计学差异。3血清促炎白介素3.1治疗前组间比较WRFG 血清 IL-1β、IL-2、IL-5、IL-7、IL-8、IL-13、IL-20、IL-25、IL-36y 水平较RSDG、HG 低,具有统计学差异。WRFG 血清 IL-3、IL-4、IL-6、IL-9、IL-33 水平较RSDG无统计学差异,较HG低,具有统计学差异。RSDG 血清 IL-1β、IL-7、IL-8、IL-9、IL-13、IL-20、IL-25、IL-33、IL-36γ 水平较HG无统计学差异。RSDG血清IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6水平较HG低,具有统计学差异。3.2治疗后组间比较WRFG 血清 IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-33、IL-36γ 水平较 RSDG 无统计学差异,较HG低,具有统计学差异。WRFG血清IL-2、IL-3、IL-8、IL-13、IL-20、IL-25水平较RSDG、HG无统计学差异。RSDG 血清 IL-1β、IL-3、IL-7、IL-8、IL-13、IL-20、IL-33 水平较 HG 无统计学差异。RSDG 血清 IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-25、IL-36γ 水平较 HG 低,具有统计学差异。4血清抗炎白介素4.1治疗前组间比较WRFG 血清 IL-10、IL-21、IL-27、IL-28A、IL-35 水平较 RSDG、HG 低,具有统计学差异;WRFG血清IL-29水平较RSDG低,具有统计学差异,较HG无统计学差异;血清IL-12、IL-37水平较RSDG无统计学差异,较HG低,具有统计学差异。RSDG 血清 IL-10、IL-12、IL-21、IL-27、IL-28A、IL-29、IL-35、IL-37 水平较 HG无统计学差异。4.2治疗后组间比较WRFG血清IL-10、IL-12、IL-21水平较RSDG无统计学差异,较HG低,具有统计学差异;WRFG血清IL-27、IL-29、IL-35、IL-37水平较RSDG、HG无统计学差异;WRFG血清IL-28A水平较RSDG低,具有统计学差异,较HG无统计学差异。RSDG 血清 IL-10、IL-12、IL-21、IL-27、IL-28A、IL-29、IL-35、IL-37 水平较 HG无统计学差异。结论1 WRFG组在改善哮喘患者喘息、咳嗽、咳嗽性质、咳痰不爽、乏力、口干、心悸、头晕、畏寒肢冷、腰膝酸软、总分等全身症状体征方面具有明显的优势。体现了WRFG“肺脾为核心脏腑整体辨证”,整体诊治CDBA的优势与特色。2 WRFG治疗后血清免疫球蛋白、血清促炎和抗炎白介素水平升高并接近健康人水平,可能与温润方减轻了哮喘患者气道慢性炎症这一基础病理损害,使哮喘患者气道炎症局部对较高的血清促炎白介素水平耐受性增强,提高了气道对损伤因子的免疫防御及修复能力有关。3 CDBA具有多种免疫细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症病理变化基础,炎症、免疫参与了疾病宏观表现的微观病理变化。反之,不同的微观炎症免疫调控失衡状态影响着宏观中医哮喘的病机演变。CDBA存在着“肺脾为核心多脏虚”的关键病机共性规律。“肺脾为核心脏腑整体辨证”是在全面客观认识CDBA脏腑关系与病机演变规律基础上对中医整体观念、脏腑辨证的继承、发展、应用,强调以“肺脾为核心”的整体观揭示哮喘发病机制。
任非非[2]（2021）在《基于AMPK/SIRT1/PGC-1α通路研究醒脾解郁方对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响》文中研究表明目的:观察AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路介导的线粒体生物合成对抑郁大鼠海马神经元突触可塑性的影响及醒脾解郁方干预效应。方法:实验研究分为四部分。第一部分:140只雄性SD大鼠随机分为空白组（CON）、模型组（MOD）、醒脾解郁方组（XPJYF）、草酸艾司西酞普兰组（EOT）、醒脾解郁方联合草酸艾司西酞普兰组（XPJYF+EOT）。每组根据应激时间各分为3w、6w组。除CON外,其余各组采用慢性束缚应激（CRS）造模,共21d。各组造模的同时给予相应药物干预。造模前及造模第3 w、6 w时进行行为学观察。造模3 w时评价脾虚程度,结合行为学实验,评价模型成功与否。取材后以HE染色和尼氏染色观察海马CA1区神经元病理变化及XPJYF干预效应。第二部分:大鼠分组及干预同研究一。取材后观察海马CA1区神经元突触及线粒体超微结构;分析线粒体及神经元突触体视学指标;高尔基染色观察神经元轴树突分支变化;提取海马突触体,免疫荧光染色观察突触重塑蛋白表达;Western blot检测线粒体合成蛋白含量;检测海马线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ～Ⅳ及线粒体酶活性。第三部分:制备XPJYF低、中、高剂量组含药血清;体外分离、培养原代海马神经元细胞并鉴定;采用CCK8法进行XPJYF细胞毒性实验;建立皮质酮（CORT）诱导海马神经元损伤模型,分为 CON、CORT、CORT+X（H）、（M）、（L）、CORT+E、CORT+E+X（H）、（M）、（L）共9组。以细胞免疫荧光观察SYN、PSD-95表达及海马神经元线粒体成像;Western blot检测线粒体生物合成及突触重塑蛋白表达;ELISA及RT-PCR检测5-HT、DA及其受体情况。第四部分:大鼠分组及干预同研究一。取材后以免疫荧光三标染色观察海马CA1区NeuN/CD31/GFAP表达;RT-PCR检测海马AMPK/SIRT1/PGC-1α通路基因表达;免疫组化及 Western blot 检测 NeuN、GFAP、VEGF、Collagen Ⅳ蛋白表达。结果:1.第一部分1.1宏观表征:造模前大鼠状态良好,反应灵敏,活动自如。造模3 w后,反应降低,神态倦怠,活动减少,毛发干枯或发黄,粪便逐渐变稀,至6 w时表现更明显,各用药组较模型组有改善。1.2体质量变化:模型各组大鼠体重较空白组降低（P<0.01）。与模型组比较,各用药组体重增加（P<0.01,P<0.05）。与中药组比较,西药3 w、联合各组体重增加（P<0.01,P<0.05）,西药6 w组降低（P<0.05）。联合各组体重较西药组增加（P<0.01,P<0.05）。1.3行为学:模型各组糖水偏好率（SPT）较空白组降低（P<0.01）,强迫游泳不动时间（FST）延长（P<0.01）。与模型组比较,西药、联合各3 w及各用药6w组SPT升高,FST缩短（P<0.01,P<0.05）。联合各组SPT较中药、西药组升高（P<0.01,P<0.05）,FST缩短（P<0.01,P<0.05）。与同组别基线比较,各组各时间点SPT降低（P<0.01）,模型各组及中药、西药各6 w组FST延长（P<0.01,P<0.05）。1.4血清淀粉酶、尿D-木糖排泄率比较:造模3 w后血清淀粉酶和尿D-木糖排泄率均降低（P<0.01）,至造模6周时更低（P<0.01）。1.5海马CA1区病理改变:HE染色:空白组海马CA1区神经元数量、分布、形态均无异常,圆形胞核清晰居中。模型3w组神经元数量减少,排列及形态不规则,细胞大小不一,部分呈三角形,细胞核深染、固缩,核仁显示不清;至6w时损伤进一步加重。各用药组有不同程度改善,以中药6 w组和联合组较为明显。尼氏染色:空白组海马CA1区神经元正常分布,胞质内可见丰富的尼氏小体,近胞核处呈“虎斑样”,远端呈细颗粒样,核仁清晰。模型3 w组细胞排列散乱,胞质内尼氏小体减少。至6w时,损伤加重,细胞皱缩明显,部分细胞尼氏体减少,并可见中央性染色质溶解现象。各用药组损伤逐渐恢复,以西药3 w组及中药6 w组明显。2.第二部分2.1神经元超微结构:正常组神经元突起较多,线粒体正常,突触结构完整,突触小泡较多。造模3 w后,线粒体肿胀,嵴断裂,突触小泡数量减少。至造模6 w,损伤加重,突触间隙显示不清,突触小泡减少,聚集分布,线粒体膜破坏,嵴断裂,基质空泡样变。各用药组上述损伤减轻。2.2线粒体体视学:模型各组Vvm较空白组升高（P<0.01）,NM、δ、δm降低（P<0.01）。与模型组比较,各给药组Vvm降低（P<0.01,P<0.05）,各6 w组NM升高（P<0.01）,中药、联合各组及西药6 w组δ、δm升高（P<0.01,P<0.05）。较中药组,西药6 w组δ、联合6 w组Vvm降低（P<0.01）,联合各组δm升高（P<0.01,P<0.05）。2.3突触体视学:模型各组数密度（Nv）、面密度（Sv）、突触小泡面数密度（NS）均较空白组降低（P<0.01）。中药、联合各6 w组Nv、Sv、Ns较模型组升高（P<0.01,P<0.05）。2.4高尔基染色:模型各组Sholl交点数及树突棘较空白组减少（P<0.01）。中药、联合各组Sholl交点数较模型组增多（P<0.01,P<0.05）,中药、西药各6 w组及联合各组树突棘密度升高（P<0.01,P<0.05）,且联合6 w组较中药、西药各6w组升高（P<0.05）。2.5突触体突触重塑蛋白:与空白组比较,模型3 w组GAP-43、PSD-95增加（P<0.01）,6w组降低（P<0.05）,各组SYN、syntaxin 1均降低（P<0.01）。与模型组比较,中药、联合各组及西药3 w组GAP-43、PSD-95增加（P<0.01,P<0.05）,中药、联合各组SYN升高（P<0.01）,中药、西药及联合各6 w组syntaxin 1升高（P<0.01,P<0.05）。与中药组比较,西药6 w组SYN降低（P<0.05）,联合6 w组GAP-43增加（P<0.01）。2.6线粒体生物合成蛋白:模型各组SIRT1、PGC-1α、AMPK-α1、Tfam、NRF1较空白组均降低（P<0.01）。与模型组比较,西药3 w组SIRT1和AMPK-α1、联合各组SIRT1、PGC-1α、Tfam升高（P<0.01,P<0.05）。与中药组比较,联合3 w组AMPK-α1、6w组PGC-1α表达升高（P<0.01）。3.第三部分3.1细胞毒性实验:经免疫荧光鉴定,培养的海马神经元符合神经元细胞特征。经CCK8实验,确定醒脾解郁方含药血清浓度为高剂量组10%、中剂量组10%和低剂量组20%,作用时间确定为24h。3.2线粒体生物合成蛋白表达:与CON组比较,CORT组、CORT+E组SIRT1、PGC-1α、NRF1、Tfam 降低（P<0.01）。与 CORT 组比较,CORT+X 的 H、M 组 SIRT1、NRF1、Tfam 升高（P<0.01）,CORT+E 组 SIRT1 降低（P<0.05）,CORT+X（H）组PGC-1α 升高（P<0.01）。与 CORT+E 组比较,CORT+E+X（H）组 PGC-1α、Tfam 升高（P<0.05）,CORT+E+X（M）组 NRF1、Tfam 升高（P<0.01）。3.3突触重塑蛋白表达:与CON组比较,CORT组、CORT+E组GAP-43、SYN、PSD-95 降低（P<0.01）。与 CORT 组比较,CORT+X 的 H、M 各组 GAP-43、SYN 升高（P<0.01）,CORT+X（H）组 PSD-95 升高（P<0.01）。与 CORT+E 组比较,CORT+E+XPJYF 的 H、M、L 组 GAP-43、SYN、PSD-95 升高（P<0.01,P<0.05）。3.4 5-HT、DA及其受体mRNA含量:与CON组比较,CORT组、CORT+E组5-HT、DA、5-HT1AR mRNA、DRD1 mRNA 降低（P<0.01）。与 CORT 组比较,CORT+X（H）组 5-HT、DA 升高（P<0.05）,CORT+E 组 5-HT 降低（P<0.05）,CORT+X 的 H、M组 5-HT1AR mRNA、DRD1 mRNA 升高（P<0.01）。与 CORT1+E 组比较,CORT+E+X（H）组 5-HT 升高（P<0.05）,CORT+E+XPJYF 的 H、M、L 组 5-HT1AR mRNA、DRD1 mRNA 升高（P<0.01,P<0.05）。4.第四部分4.1线粒体合成基因表达:模型各组SIRT1 mRNA、PGC-1α mRNA较空白组降低（P<0.01）。与模型组比较,各给药组 SIRT1 mRNA、PGC-1αmRNA、AMPK-α1 mRNA 均升高（P<0.01）,中药6w组、西药及联合各组NRF1 mRNA升高（P<0.01）,西药3 w组、中药及联合各组Tfam mRNA表达均升高（P<0.01,P<0.05）。与中药组比较,联合各组SIRT1 mRNA、PGC-1α mRNA、NRF1 mRNA 均升高（P<0.01）,西药 3 w 组 SIRT1 mRNA升高（P<0.01）。4.2突触微环境蛋白表达:模型各组NeuN、GFAP、VEGF较空白组降低（P<0.01）。与模型组比较,中药及联合各组NeuN、GFAP、VEGF均升高（P<0.01,P<0.05）,西药各组GFAP升高（P<0.01）,西药3 w组VEGF升高（P<0.01）。与中药组比较,西药各组GFAP 降低（P<0.05）,联合各组 GFAP 升高（P<0.01）,联合 3 w 组 VEGF 升高（P<0.05）。结论:1.慢性束缚应激3周时,动物模型符合肝郁脾虚型抑郁症标准,脑内海马CA1区神经元损伤,且随应激时间延长,损伤程度加重。中药醒脾解郁方和西药草酸艾司西酞普兰均可不同程度减轻神经元损伤,改善抑郁样行为,中药的远期保护优势较西药明显,且以两者联合应用作用更为显着;2.抑郁模型大鼠脑内海马CA1区神经元突触超微结构破坏,线粒体损伤,突触重塑功能降低,与AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路介导的线粒体生物合成减少直接相关。中药醒脾解郁方和西药草酸艾司西酞普兰均可动态调控该信号通路,促进海马神经元突触重塑,但二者作用的优势环节不同,西药在调节神经递质方面更具优势,而中药在改善线粒体功能方面更为明显,且中药的远期作用效果优于西药。3.抑郁症海马神经元突触微环境中星形胶质细胞、微血管内皮细胞及微血管基底膜损伤,与神经元突触重塑相关。中药醒脾解郁方可通过调控AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路增加线粒体生物合成,保护突触微环境,促进抑郁症神经重塑,作用较西药草酸艾司西酞普兰更具优势,且中西药联合应用效果显着。
吴俊[3]（2021）在《m6A修饰在系统性红斑狼疮发病中的作用研究》文中提出研究背景系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种复杂的慢性自身免疫性疾病,由自身免疫介导,以多种异常的自身抗体产生,多系统和多器官受累,临床表现多样化为主要疾病特点。SLE患者的预后较差,生存质量低,病死率较高,发病率攀升,多侵害育龄期女性。然而,SLE的发病机制至今尚未明确。遗传因素研究为揭示SLE的病理机制做出了巨大努力,但仍不足以解释SLE复杂的临床表现和治疗难题。近些年,表观遗传学修饰为探索SLE复杂的机制、诊断、治疗和预防提供了新思路。多种表观遗传机制在SLE中发生,如DNA甲基化修饰介导淋巴细胞发育,非编码RNAs调控免疫细胞,染色质重塑和组蛋白修饰等。这些表观遗传学调控在不改变任何DNA序列前提下,使基因功能发生可遗传变化,最终导致疾病表型发生改变。与DNA修饰和蛋白质修饰一样,发生在RNA水平上的转录后基因表达调控机制——N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）修饰被扰乱后,可能导致RNA表达异常。m6A修饰是指在RNA腺嘌呤第六位的氮原子上发生了甲基化,并调控其基因表达。该种修饰是人类m RNA中广泛存在的一种修饰方式,由特定的甲基转移酶催化形成,在去甲基化酶催化下去除修饰,并在识别蛋白读取m6A修饰所蕴含的信息下,把修饰信息转化为功能信号。在这些m6A甲基化酶的共同作用下,使RNA发生甲基化和去甲基化的动态变化,从而调节机体的各种生物学功能。m6A修饰位点主要分布在转录起始、基因内部编码区和3’-UTR等重要功能区域。已有研究表明,m6A修饰参与细胞代谢调控、胚胎干细胞分化、昼夜节律和细胞凋亡等多种生物学过程。越来越多的证据提示,m6A修饰在免疫应答调控机制和炎症调控网络上被认为是T细胞稳态、细菌或病毒感染后免疫反应的重要调节因子。在SLE中,ALKBH5去甲基化酶已被报道是炎症反应标志物,YTHDF2识别蛋白与SLE疾病活动度有关,但仍需要深入探讨m6A修饰在SLE疾病中的作用机制。m6A修饰在疾病过程,乃至疾病治疗和预后都有可能扮演着重要角色,有望成为治疗和预防疾病的新干预靶点。然而,m6A修饰在SLE中的研究仍十分有限,需要进一步研究。目的借助甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序（Methylated RNA Immunopre-cipitation sequening,Me RIP-seq）技术建立SLE疾病m RNA的m6A修饰谱和表达谱,初步筛选m6A修饰相关m RNAs,并进行人群验证。对差异表达的m6A修饰相关m RNAs进行T细胞相关功能研究,初步揭示m RNA的m6A修饰在SLE疾病过程中的作用。在建立的SLE疾病m RNAs表达谱中筛选目前已经报道的m6A甲基化酶,并选择m6A甲基转移酶进行人群验证。对差异表达的甲基转移酶进行功能研究,初步揭示m6A甲基转移酶在SLE疾病中的作用及其机制。方法本课题采用的是病例对照设计,研究共分四个阶段:（1）第一阶段是建立SLE疾病中m RNAs的m6A修饰谱和表达谱在3例新发未服药的SLE患者和3例匹配的对照外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中利用Me RIP-seq建立m RNAs的m6A修饰谱和表达谱。对差异表达和差异修饰的m RNAs进行GO富集分析（Gene Ontology,GO）和KEGG富集分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）以及关联分析,筛选4个潜在的m6A修饰相关m RNAs,即IFIT5、CSF3R、SP140和IFIH1。在表达谱中筛选目前已经报道的m6A甲基化酶,从中找出m6A甲基转移酶（METTL3、METTL14、METTL16和WTAP）。（2）第二阶段SLE患者与对照PBMC中m6A修饰相关m RNAs和甲基转移酶表达验证借助实时定量聚合酶链反应（quantitative Real-time Polymerase Chain Reactionq,q RT-PCR）技术,在108例SLE患者和110例对照的PBMC中进行4种m6A修饰相关m RNAs（IFIT5、CSF3R、SP140和IFIH1）和4种m6A甲基转移酶（METTL3、METTL14、METTL16和WTAP）的基因表达水平验证;结合临床信息,对差异表达的基因与SLE的临床表现、实验室指标和药物治疗等进行关联分析;借助免疫印迹实验（western blot,WB）技术,在40例SLE患者和40例对照PBMCs中对差异表达的IFIT5和CSF3R以及甲基转移酶METTL3的蛋白水平进行验证。（3）第三阶段SLE患者与对照T细胞中m6A修饰相关m RNAs和METTL3表达验证借助q RT-PCR技术和WB实验在独立重新收集的32例SLE患者和32例对照T细胞中对在PBMC中差异表达的IFIT5、CSF3R和甲基转移酶METTL3的基因表达水平和蛋白水平进行T细胞验证;结合临床信息,分析了IFIT5、CSF3R和METTL3的表达水平与SLE临床特征和药用使用的相关性。（4）第四阶段细胞实验验证m6A修饰相关m RNA和METTL3对SLE患者T细胞功能的影响选用p LKD-CMV-EGFP-2A-Puro-U6-sh RNA干扰载体构建了IFIT5干扰的Jurkat细胞株,用p LKD-CMV-EGFP-2A-Puro-U6-sh RNA干扰载体构建了METTL3干扰的Jurkat细胞株,用p SLenti-EF1-EGFP-F2A-Puro-CMV-METTL3-WPRE过表达载体构建了METTL3过表达的Jurkat细胞株。借助流式细胞仪检测技术,在Annexin V-PE和7-Amino-Actinomycin D双染色后检测IFIT5沉默、METTL3沉默和过表达后分别对Jurkat细胞凋亡的影响;用EDU检测IFIT5沉默、METTL3沉默和过表达后分别对Jurkat细胞在0 h、6 h、12 h和24 h时对细胞周期的影响。结果（1）SLE疾病中m RNA表达谱和m6A修饰谱分析本课题通过Me RIP-seq建立了SLE疾病m RNA的表达谱和m6A修饰谱,发现SLE中m6A甲基化水平低于对照组。SLE病例组与对照组均能检测到peaks峰的基因有6293个,有2137个差异peaks分布在1943个基因中,这些peaks峰集中分布在3’UTR和CDS交界处。在SLE病例中预测到了经典的Motifs（RRACH,R=A/G,H=A、T、C）。差异基因与差异peak关联分析后,从中筛选4个潜在的m6A修饰相关的m RNAs（IFIT5、CSF3R、SP140和IFIH1）进行验证。另外,在SLE疾病中发现m6A修饰酶共20种,其中验证了m6A甲基转移酶（METTL3、METTL14、METTL16和WTAP）。（2）SLE患者与对照PBMC中m6A修饰相关m RNAs和甲基转移酶表达情况在扩大样本人群的PBMC中验证发现,与对照组相比,CSF3R和IFIT5的表达水平和蛋白水平在SLE患者中存在统计学差异,其中CSF3R表达水平和蛋白水平均下调（均有P<0.05）,IFIT5的表达水平和蛋白水平均上调（均有P<0.05）。与临床信息的关联研究结果显示,在SLE患者白细胞减少时,IFIT5的表达水平上调（Z=-2.557,P=0.011）,在抗SSB抗体阳性时表达降低（Z=-2.357,P=0.018）,在患者服用羟氯喹药物组表达水平升高（Z=-2.913,P=0.004）。CSF3R的表达水平与SLE患者ESR水平呈负相关（rs=-0.217,P=0.042）。另外,与对照相比,4种m6A甲基转移酶（METTL3、METTL14、METTL16和WTAP）的表达水平在SLE患者中均表达下调（均有P<0.05）。其中,METTL16表达水平在SLE患者出现蛋白尿时降低（Z=-1.966,P=0.049）;WTAP表达水平在SLE患者白细胞减少时升高（Z=-2.049,P=0.040）且在患者出现抗小核抗体（anti-nucleosome antibody,Anu A）阳性时也升高（Z=-1.992,P=0.046）;METTL3表达水平与SLE患者的CRP大小呈负相关（rs=-0.223,P=0.036）;METTL3与WTAP的表达水平与患者使用糖皮质激素有关（均有P<0.05）;METTL14和METTL16的表达水平与SLE患者服用羟氯喹药物均存在统计学关联（均有P<0.05）。为了进一步验证甲基转移酶的功能,我们选择METTL3进一步验证。WB验证结果显示,METTL3在SLE患者PBMC中的蛋白水平比对照低。（3）SLE患者与对照T细胞中m6A修饰相关m RNAs和METTL3表达情况T细胞验证发现,与对照相比,IFIT5的表达水平和蛋白水平在SLE患者中依然是上调（均有P<0.05）;CSF3R的蛋白水平在SLE患者中依然下调（P<0.05）。与临床信息关联研究结果显示,CSF3R的表达水平与SLE患者白细胞减少存在关联（Z=-2.014,P=0.044）,同时与C3补体水平呈负相关（rs=-0.400,P=0.028）。IFIT5表达水平在SLE患者出现脓尿时升高（Z=-2.590,P=0.010）,还与SLE患者疾病活动度呈正相关（rs=0.388,P=0.028）。与对照相比,METTL3在T细胞中的表达水平和蛋白水平仍然在SLE患者中下调（均有P<0.05）。与临床信息关联分析结果显示,METTL3在SLE患者T细胞中的表达水平与抗ds DNA抗体存在统计学关联,在患者抗ds DNA抗体升高时表达水平降低（Z=-2.439,P=0.015）,抗SSB/La阳性时表达水平同样降低（t=3.181,P=0.007）,同时与SLE患者补体C3和C4水平均呈正相关（C3,rs=0.496,P=0.004;C4,rs=0.430,P=0.014）。（4）差异表达的m6A修饰相关m RNA和METTL3对T细胞的影响细胞实验结果显示,Jurkat细胞株慢病毒感染效率达到90%。与阴性对照相比,IFIT5基因干扰后Jurkat细胞凋亡比例上升（13.6%vs 24.0%）,细胞增殖能力下降。与阴性对照相比,METTL3基因沉默后加速Jurkat细胞凋亡,尤其是细胞早期凋亡（21.2%vs 44.0%）,同时Jurkat细胞增殖能力明显受到抑制;METTL3过表达后,Jurkat细胞凋亡速度变缓（18.6%vs 9.56%）且细胞增殖能力增强。结论（1）本课题发现,与对照相比,SLE疾病中m6A甲基化水平降低。m6A修饰peaks峰主要集中在终止密码子附近,同时在SLE病例中发现了经典的甲基化结合位点Motifs。研究初步揭示了m6A修饰可能参与SLE的疾病过程。（2）CSF3R和IFIT5在SLE中明显异常表达,其中IFIT5干扰后Jurkat细胞凋亡比例上升且细胞增殖能力下降。研究初步发现m6A修饰相关的m RNAs可能影响T细胞稳定性,但其中具体的调控机制仍需进一步研究。（3）本课题发现,SLE疾病中存在多种m6A甲基化酶,其中包括甲基转移酶、去甲基化酶和识别蛋白,因此m6A修饰可能动态调控SLE的疾病过程。甲基转移酶在SLE疾病中均呈现表达下调,其中METTL3与SLE患者临床指标和治疗药物均存在关联。对METTL3基因干扰和过表达后发现,METTL3表达下调会促进Jurkat细胞凋亡,抑制T细胞增殖能力。METLL3和其它差异表达的m6A甲基化酶在SLE疾病中的作用及其机制值得更深入探讨。
刘密迦[4]（2021）在《羟氯喹对IgA肾病患者残余蛋白尿的疗效研究》文中研究表明目的:IgA肾病（immunoglobin A nephropathy,IgAN）是慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）患者进展为终末期肾脏病的重要原因之一。蛋白尿水平是CKD预后的独立预测因素。因此,降低尿蛋白是延缓IgAN进展的关键环节之一。研究发现,尽管经优化支持治疗联合糖皮质激素（corticosteroids,P）及免疫抑制剂治疗（immunosuppressants,IM）后,仍有部分IgAN患者有较高的蛋白尿。这种较高的残余蛋白尿水平会导致IgAN患者不良预后。近年来,多项研究表明,羟氯喹在IgAN患者中有抗尿蛋白作用。基于此,本研究拟探索羟氯喹（hydroxychloroquine,HCQ）联合治疗对支持治疗联合糖皮质激素、免疫抑制剂治疗后的IgAN患者残余蛋白尿的临床疗效。方法:本研究为基于倾向性评分匹配的回顾性研究。1、筛选2007年1月-2019年8月四川省人民医院肾活检证实为IgAN的门诊患者,经至少6月的优化支持治疗联合糖皮质激素和/或免疫抑制剂治疗后,蛋白尿定量≥0.3g/24h的患者,门诊继续随访6个月,观察临床疗效和不良反应事件。2、残余蛋白尿定义为经肾素-血管紧张素系统抑制剂（renin-angiotensin system inhibitors,RASI）、糖皮质激素和/或免疫抑制剂治疗至少6月后,24h蛋白尿定量≥0.3g。残余蛋白尿治疗有效率定义为随访期间残余尿蛋白较入组时下降≥30%。主要终点事件为残余蛋白尿下降≥30%的累积频率,次要终点事件为入组到第6月时的蛋白尿水平、肌酐水平、残余蛋白尿下降率以及残余蛋白尿缓解率。3、依据入组时不同治疗方案以及是否联合HCQ治疗进行分组,分为RASI组、HCQ+RASI组、RASI+P+/-IM组、HCQ+RASI+P+/-IM组四组。4、基于R语言的Match It软件包进行1:1倾向性评分匹配,采用最邻近匹配法,设置卡钳值=0.03,匹配入组时血肌酐及残余蛋白尿水平。5、应用SPSS 22.0软件统计分析各组间的肾活检时的临床及病理资料,比较匹配后各组间残余蛋白尿、肾功能相关指标、残余蛋白尿缓解率、残余蛋白尿下降≥30%的累积频率及不良反应事件。通过单变量和多因素logistic回归,分析与残余蛋白尿下降≥30%有关的临床与病理特征。结果:1、纳入RASI组（n=83例）、HCQ+RASI组（n=52例）、RASI+P+/-IM组（n=133例）、HCQ+RASI+P+/-IM组（n=38例）。2、比较RASI组与HCQ+RASI组、RASI+P+/-IM组与HCQ+RASI+P+/-IM组各组间24小时尿蛋白定量、血清肌酐水平等基线临床与病理资料,差异无统计学意义（P>0.05）。3、与RASI组相比,HCQ+RASI组入组时的残余蛋白尿水平更高,肾功能更差。比较RASI+P+/-IM组与HCQ+RASI+P+/-IM组入组时实验室资料,两组间入组时的残余蛋白尿水平相当,但HCQ联合治疗组入组时的肾功能更差。4、匹配入组时残余蛋白尿水平和血肌酐水平,成功匹配RASI组与HCQ+RASI组各33例,RASI+P+/-IM组与HCQ+RASI+P+/-IM组各26例,分别比较入组时实验室检查及肾活检病理资料,组间无显着差异。5、经匹配后,比较残余蛋白尿相关指标:第2,4,6月时,RASI组与HCQ+RASI组、RASI+P+/-IM组与HCQ+RASI+P+/-IM组各组间残余蛋白尿水平、残余蛋白尿下降水平相当。随访第2月时,HCQ+RASI+P+/-IM组残余蛋白尿下降率明显高于对照组[-44.7（-64.0,-20.6）%vs.-9.6（-54.1,21.8）%,P=0.027],其余第4,6月时的残余蛋白尿下降率组间无统计学差异。随访各时点,残余蛋白尿下降率在RASI组与HCQ+RASI组两组间差异无统计学意义（P>0.05）。与入组时相比,RASI组、HCQ+RASI组、HCQ+RASI+P+/-IM组随访第6月时残余蛋白尿水平显着下降。而RASI+P+/-IM组随访第6月时残余蛋白尿水平较入组前相当。6、经匹配后,比较肾功能相关指标:随访各时点的血肌酐及e GFR在RASI组与HCQ+RASI组、RASI+P+/-IM组与HCQ+RASI+P+/-IM组组间无统计学差异。各组第6个月时的肾功能与入组时无显着差异。7、随访第6个月时,HCQ+RASI组的残余蛋白尿达缓解、蛋白尿下降≥30%的累积频率与RASI组相当。HCQ+RASI+P+/-IM组的残余蛋白尿缓解的累积频率与RASI+P+/-IM组相当。而HCQ+RASI+P+/-IM组残余蛋白尿下降≥30%的累积频率（主要终点事件）显着高于对照组（88.5%vs.65.4%,χ2=5.484,P=0.019）。8、对于RASI、激素和/或免疫抑制剂治疗反应欠佳的IgAN患者,RASI、激素和/或免疫抑制剂基础上联用HCQ治疗、男性是残余蛋白尿下降≥30%的独立影响因素。9、不良反应事件:在随访期间,羟氯喹治疗的IgAN患者中有一例患者出现眼胀不适,眼底检查后未见特殊异常,但患者拒绝继续HCQ治疗,停药后眼部不适消失。随访期间未观察到其余患者中有严重不良事件发生。结论:1、对于优化支持治疗、糖皮质激素和/或免疫抑制剂治疗疗效欠佳的IgAN患者,第6个月蛋白尿下降≥30%的累积频率（主要终点事件）在RASI+P+/-IM组与HCQ+RASI+P+/-IM组间有显着差异,RASI、激素、免疫抑制剂治疗基础上联用HCQ序贯治疗可进一步降低残余尿蛋白,蛋白尿下降≥30%的累积频率可达88.5%。2、对于RASI、激素和/或免疫抑制剂治疗反应欠佳的IgAN患者,加用HCQ治疗、男性是残余蛋白尿下降≥30%的独立影响因素。3、HCQ对已开始积极治疗的CKD患者的短期肾功能可能没有显着影响。4、HCQ可作为激素、免疫抑制剂治疗后存在残余蛋白尿患者的延续治疗,其安全性和耐受性好。
肖卫棉[5]（2020）在《淮莲饮治疗特应性皮炎的临床回顾分析及对特应性皮炎样小鼠模型的免疫干预实验研究》文中指出目的:1.回顾性分析近几年收治的中重度特应性皮炎住院病例,系统归纳其临床发病特点,并总结评估中药复方淮莲饮对中重度特应性皮炎的实际临床干预效果及优势所在,为特应性皮炎的临床诊疗提供切实经验借鉴和参考。2.通过中药复方淮莲饮干预特应性皮炎样小鼠模型,从小鼠皮损评分、搔抓次数、耳廓肿胀度、皮肤组织病理、血清及皮损辅助性T细胞（Th）相关炎症因子、脾脏调节性T淋巴细胞（Treg）及辅助性T细胞17（Th17）、辅助性T细胞9（Th9）表达水平等方面探讨淮莲饮影响特应性皮炎免疫调控的可能机制。方法:1.回顾性临床研究:收集2014年1月到2018年1月间收住入院的中重度特应性皮炎患者的病例信息,根据纳入及排除标准筛选合格研究对象共117人,设计病例信息采集表,建立数据库来进行统计分析。对患者的整体临床资料包括年龄、性别、首次发病时间、病程、临床分期、发病季节、诱发因素、临床特征、个人及家族过敏史、实验室检查等进行列表统计、多维回顾分析,并根据治疗方法有无淮莲饮内服干预措施来设置病例对照,其中采用淮莲饮+西医常规治疗者73人,设置为中西医结合组,仅应用西医常规治疗者共44人,设置为西医对照组,观察并分析两组患者的治疗有效率、出现的不良反应及复发情况,比较两组患者平均住院时间,观察患者入院前及出院时的研究者整体评价（IGA）评分、特应性皮炎严重指数评分（SCORAD）变化。2.动物实验:（1）将雌性BALB/c小鼠随机分为4组（n=8）,即空白对照组、模型组、淮莲饮低剂量组（临床等效剂量,2.6g/kg·d）、淮莲饮高剂量组（临床二倍剂量,5.2g/kg·d）。（2）除空白对照组外,模型组和淮莲饮高、低剂量组均需要造模,采用2,4-二硝基氯苯（即DNCB法）反复刺激的诱导方法建立特应性皮炎样小鼠模型,在造模前先给小鼠背部备皮（面积大小约为2.0cmx1.5cm）,造模第1天开始在小鼠背部备皮区、右耳背侧皮肤用移液器外涂1%DNCB溶液来帮助初次致敏,其中背部备皮区DNCB用量为150ul,右耳背侧皮肤10 ul,连续2天,间隔4天,其后在第7天、第9天、第11天、第13天在小鼠背部备皮区、右耳背面皮肤分别外涂0.2%的DNCB溶液100ul、10ul,反复刺激致敏皮肤（二次致敏）,维持AD样炎症反应,小鼠左耳背面外涂同量的1:4的丙酮和橄榄油基质溶液作为对照。空白对照组给予脱毛,仅外涂1:4的丙酮和橄榄油混合液,涂擦时间及徐擦剂量与其余组别相同。（3）边造模边给药,即在造模第一天开始用药,连续给药14天。其给药方式均为灌胃,淮莲饮高、低剂量组给予高、低浓度淮莲饮治疗,空白对照组和模型组均给予相同体积的蒸馏水。（4）在实验第1天、第8天、第15天时分别观察记录各组小鼠的搔抓次数、皮损评分;（5）予眼球摘除法在实验结束后24小时内（第15天）处死小鼠,双侧耳廓中部对应部分采用6mm小鼠打孔器获取耳片,分析天平检测耳片质量,计算耳廓肿胀度;取其背部及右耳廓皮损行皮肤常规病理组织检查,且采用甲苯胺蓝染色计数肥大细胞、免疫组化染色检测组织中嗜酸性粒细胞浸润情况;（6）采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血清炎症因子白介素4（IL-4）、γ干扰素（IFN-γ）、白介素10（IL-10）、白介素17（IL-17）、白介素9（IL-9）、免疫球蛋白E（Ig E）水平;应用Trizol法提取小鼠背部皮损组织总RNA,采用实时定量聚合酶链式反应（Real-Time PCR）扩増后检测皮损组织中IL-4、IFN-γ、IL-10、IL-17、IL-9m RNA表达水平;（7）取小鼠脾脏,制备脾脏单细胞悬液,分离脾脏淋巴细胞,采用流式细胞术（FCM）检测Th9、Th17、Treg细胞表达水平。结果:1.回顾性临床研究:（1）117例纳入研究的特应性皮炎住院病例均为青少年及成人期中重度患者,女多于男（1.39:1）,平均年龄为（23.08±6.28）岁,发病年龄较早,在1岁以内发病的占77.78%;（2）患者多于夏、冬两季病情加重入院,大多无明显诱因;70.94%的患者有个人或家族过敏史;多数患者血清总Ig E水平增高（67.52%）及EOS计数增高（69.23%）,血清特异性Ig E阳性以吸入组过敏原的屋尘螨/粉尘螨组合出现频次最高;（3）一些具有临床诊断价值的临床特征,117例中重度AD患者依次以全身皮肤干燥（109例）、四肢屈侧皮炎/湿疹（100例）、出汗时瘙痒（80例）、面部红斑（69例）、皮肤白色划痕征（65例）最常见。（4）中西医结合组总有效率、不良反应发生率及复发再次入院率分别为86.30%、10.96%及28.77%,优于对照组的70.45%、31.82%及54.55%,两组间比较差异有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,中西医结合组IGA评分、SCORAD积分及平均住院时间均亦明显下降（P<0.05）。2.动物实验:（1）造模结束后,模型组小鼠搔抓次数、皮损评分、耳廓肿胀度均较空白对照组明显增加（P<0.01）,低、高剂量淮莲饮灌胃干预治疗的用药组小鼠搔抓次数、皮损评分、耳廓肿胀度均较模型组明显下降（P<0.01）;淮莲饮低、高剂量组皮肤组织病理示棘层肥厚程度较模型组减轻,皮损嗜酸性粒细胞浸润减少,肥大细胞计数亦显着降低（P<0.01）;（2）与空白对照组比较,模型组小鼠血清Ig E、IL-4、IL-17、IL-9含量明显増加（P<0.01）,血清IFN-γ、IL-10未见明显改变（P>0.05）,给予低、高剂量淮莲饮治疗的用药组小鼠血清Ig E、IL-4、IL-17、IL-9含量均较模型组明显下降（P<0.01）,其中IL-4、IL-9接近空白对照组水平,而血清IFN-γ、IL-10含量与模型组比较无统计学差异（P>0.05）;（3）实时定量聚合酶链式反应（Real-Time PCR）结果示模型组小鼠背部皮损IL-4、IL-9、IL-17及IFN-γ的m RNA表达水平均较空白对照组显着升高（P<0.01）,IL-10m RNA表达水平则明显下降（P<0.05）;与模型组比较,淮莲饮低、高剂量用药组小鼠背部皮损IL-4、IL-9、IL-17、IFN-γ的m RNA表达水平均显着下降（P<0.01）;与模型组比较,淮莲饮高剂量组皮损IL-10m RNA表达水平明显上升（P<0.05）,淮莲饮低剂量组皮损IL-10m RNA表达升高,但与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）,说明淮莲饮用药组于提升皮损IL-10m RNA表达水平有一定的剂量效应关系;（4）与空白对照组比较,模型组小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+细胞（Tregs）占CD4+T细胞比例明显下降（P<0.01）,CD4+IL-17+（Th17）细胞比例则显着上升（P<0.01）,CD4+IL-9+（Th9）细胞比例无明显变化（P>0.05）;淮莲饮低、高剂量用药组与模型组比较,脾脏Treg细胞比例显着升高（P<0.01）,而脾脏Th17细胞比例明显下降（P<0.01）,Th9细胞比例较模型组稍下降,与之比较无统计学上差异（P>0.05）。结论:1.（1）AD住院病例往往为青少年及成人期中重度患者,早年发病,病史较长,多数患者具有特应性体质,存在一些具有诊断价值的临床特征性表现;（2）应用中药复方淮莲饮干预治疗中重度特应性皮炎,能改善病情、缩短住院时间、减缓复发、并且安全性较好,值得临床广泛应用及推广。2.（1）通过DNCB外源性诱导刺激BALB/c小鼠,成功制备了特应性皮炎样模型小鼠;在临床表现、免疫血清学及皮肤组织病理等方面均可以看出,中药复方淮莲饮可有效的改善AD样小鼠模型的皮损情况,减轻搔抓症状,同时也减少皮肤炎性细胞的浸润;（2）淮莲饮的治疗机制之一在于下调血清Ig E、IL-4、IL-17、IL-9含量和皮损IL-4、IFN-γ、IL-17、IL-9m RNA表达水平、增强皮损IL-10m RNA表达,纠正上述细胞因子紊乱、以恢复体内免疫稳态;（3）淮莲饮低、高剂量组小鼠脾脏Treg细胞比例显着上升,而Th17细胞比例显着下降,表明淮莲饮还可能通过增强体内负向免疫调控机制,调节Th17/Treg失衡,发挥多靶点的综合治疗作用。
林成创[6]（2020）在《重组灵芝免疫调节蛋白在支气管哮喘中的作用及免疫调节机制研究》文中指出目的:支气管哮喘（以下简称哮喘）是最常见的气道慢性炎症性疾病之一,据统计,哮喘作为一个全球重大公共卫生问题,影响3亿左右人口,不同国家和地区患病率有所不同,中国大陆地区哮喘患病率为1.24%,约有3000万哮喘患者,且多数哮喘患者病情控制欠佳,容易反复发作,严重影响生活质量。目前治疗哮喘的一线药物仍以糖皮质激素为主,此类药物虽可以相对较好地控制哮喘,但该类药物治疗周期长,长期使用可引起多种副作用。此外,仍有约40%哮喘患者对糖皮质激素治疗不敏感,临床治疗亟需新研发的、安全有效的治疗药物。近年来发现Th17/Treg细胞失衡在哮喘的发病中起了重要作用,这为哮喘的治疗提供了新的思路。本课题使用卵清蛋白（OVA）及氢氧化铝（AL（OH）3）腹腔注射致敏加雾化激发的方式建立BALB/c小鼠哮喘气道炎症模型,以重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）进行干预,并与正常小鼠、模型组小鼠及地塞米松干预组小鼠对比,明确rLZ-8对哮喘小鼠气道炎症的干预作用及免疫调节机制;同时使用rLZ-8对体外培养小鼠脾脏T细胞进行干预,观察其对T细胞增殖分化影响,探究rLZ-8对哮喘的作用及其免疫调节机制,以期为哮喘的更多治疗选择提供理论依据。方法:1.rLZ-8对小鼠哮喘的缓解作用及免疫调节机制研究建立小鼠哮喘气道炎症模型和观察药物治疗效果:将BALB/c小鼠用随机数字表法分为4组:分别为对照（Control）组,模型（Model）组,地塞米松注射液（DEX）组,rLZ-8组,每组8只。以OVA和AL（OH）3混合致敏液在第0、7、13天腹腔注射致敏,第19天至32天予OVA溶液雾化激发的方法诱导建立哮喘模型,并从第19天开始分别给予生理盐水、DEX、rLZ-8等对应药物干预2周后,采用ELISA法检测各组小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞因子IL-17A、IL-10、IFN-γ和IL-4的水平,HE染色观察肺组织炎症浸润等病理改变。免疫组织化学检测肺组织嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP）及成熟树突状细胞（DC）表面分子（CD11c和CD86）水平,流式细胞术检测哮喘小鼠脾脏细胞中CD11c-CD80+成熟DC和CD11c+CD86+成熟DC的比例。流式细胞术检测哮喘小鼠脾脏细胞中CD4+IFN-γ+Th1细胞、CD4+IL-4+Th2细胞、CD4+IL-17A+Th17细胞、CD4+Foxp3+ Treg细胞的比例。Real-time PCR检测肺组织中转录因子T-bet、IFN-γ、ROR γ t、Foxp3 mRNA 表达水平,Western Blotting 检测肺组织中 STAT3 信号通路表达。2.rLZ-8对哮喘相关T细胞的调节作用分选BALB/c小鼠脾脏CD3+T细胞进行体外培养,用Annexin V/PI法检测rLZ-8对T细胞的毒性并得到实验用药的安全浓度。用CD3CD28抗体刺激CD3+T细胞活化并给予DEX和rLZ-8干预后,采用ELISA法检测T细胞培养上清液中细胞因子IL-1 β、IL-10和TGF-β 1的表达水平。CFSE标记CD3+T细胞后刺激诱导分化,予DEX和rLZ-8干预后采用流式细胞术测定CD4+IL-17A+Th17细胞的比例,采用Real-time PCR检测Th17细胞转录因子ROR γ t表达水平,以研究Th17细胞分化情况。流式分选CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25-T细胞,用CFSE标记CD4+CD25+Treg细胞后进行体外培养并予DEX和rLZ-8干预,然后流式细胞术测定Treg细胞增殖情况。体外诱导CD4+CD25-T细胞分化为Treg,并予DEX和rLZ-8干预,然后采用流式细胞术测定CD4+Foxp3+Treg细胞比例以研究Treg细胞分化情况,并提取细胞蛋白进行Western Blotting检测STAT3蛋白在各组T细胞中的表达。依据计量资料的正态性,使用单因素ANOVA方差分析、独立样本t检验和秩和检验进行组间比较,组间比较采用Dunnett’ sT3法或者LSD法,P<0.05为具有统计学意义。结果:1.rLZ-8对小鼠哮喘的缓解作用及免疫调节机制研究肺组织HE染色和免疫组织化学结果显示OVA诱导建立哮喘模型组小鼠肺部病理出现明显哮喘气道炎症特征,HE染色结果显示rLZ-8和DEX减轻了小鼠气道炎性浸润,免疫组化结果显示rLZ-8和DEX减少了肺部成熟DC（P<0.01）及嗜酸性粒细胞（EOS）浸润（P<0.01）,流式检测也显示rLZ-8降低了哮喘小鼠脾脏中成熟DC细胞（CD11c+CD86+和 CD11c+CD80+DC）的比例（P<0.01）。rLZ-8降低了哮喘小鼠BALF上清液IgE的表达水平（P<0.01）和Th17细胞主要效应因子IL-17A的表达水平（P<0.01）,并提高Treg细胞因子IL-10的水平（P<0.01）,但未改变Th1细胞因子IFN-γ和Th2细胞因子IL-4的水平（P>0.05）。哮喘小鼠肺组织Real-time PCR显示rLZ-8降低了小鼠的Th17细胞转录因子RORγt的表达水平（P<0.01）并提高Treg细胞转录因子Foxp3的表达水平（P<0.05）,但对Th1细胞转录因子T-bet的水平及Th2相关转录因子GATA3的水平则无影响（P>0.05）。rLZ-8下调小鼠脾脏中CD4+IL-17A+Th17细胞的比例并上调CD4+Foxp3+Treg细胞的比例（P<0.01）,但对CD4+IL-4+Th2细胞和CD4+IFN-γ+Th1的细胞比例无显着影响（P>0.05）。此外,rLZ-8抑制肺组织中STAT3信号通路的活化（P<0.01）。2.rLZ-8对T细胞调节作用的体外研究rLZ-8抑制了 CD3+T细胞培养液中Th17相关细胞因子IL-1 β的表达（P<0.01）,促进了 Treg细胞因子IL-10和TGF-β 1的表达,（P<0.01）。在体外刺激CD3+T细胞活化的研究中发现rLZ-8降低了 Th17细胞特异性转录因子ROR y tmRNA的表达水平和CD4+IL-17A+Th17细胞的比例（P<0.01）,并抑制了 STAT3信号通路的活化（P<0.01）,说明Th17细胞的免疫应答受到抑制。CD4+CD25+Treg细胞体外增殖研究和CD4+CD25-T细胞体外分化研究中,发现rLZ-8不能促进CD4+CD25+T细胞的增殖（P>0.05）,但是可以诱导CD4+CD25-T细胞向CD4+Foxp3+Treg的分化（P<0.01）,而DEX则表现为促进CD4+CD25+T细胞增殖的作用（P<0.01）,但不诱导Treg分化（P>0.05）。结论:本研究结果揭示了rLZ-8具有改善哮喘小鼠气道炎症方面的免疫调节作用,其机制可能是通过抑制STAT3信号通路,调节Th17/Treg细胞平衡,表现为抑制了 Th17细胞的增殖活化及转录因子ROR γ t、细胞因子IL-17A的释放,同时促进了 CD4+Foxp3+Treg的分化及其转录因子Foxp3和细胞因子IL-10的释放,并抑制了 DC成熟,从而发挥改善哮喘小鼠气道炎症的免疫调节作用。因此,有良好免疫调节功能的rLZ-8具备成为哮喘治疗药物的可能。
方志锋[7]（2020）在《双歧杆菌缓解特应性皮炎的作用及机制研究》文中研究表明特应性皮炎是一种常见的炎症性皮肤病,临床特点是反复发作和瘙痒。特应性皮炎在全世界的发病率逐年上升,影响到世界上15%-30%儿童和3%的成年人。目前治疗特应性皮炎的药物集中在糖皮质激素类药物和抗组胺药物等方面,因此长时间使用这些药物会带来很大的副作用。研究表明,特应性皮炎的发生与肠道菌群的变化具有相关性,具体表现为特应性皮炎患者肠道菌群多样性降低,乳杆菌,双歧杆菌的丰度降低,而金黄色葡萄球菌,大肠杆菌的丰度升高,所以肠道菌群可能是缓解特应性皮炎的一个潜在靶点。因此,本研究对具有缓解特应性皮炎作用的双歧杆菌进行筛选并分析其作用机制,然后通过动物实验验证其功能及作用机制,最后通过膳食干预试验评价双歧杆菌对特应性皮炎患者的缓解作用。主要的研究结果如下:首先,研究了双歧杆菌对特应性皮炎的缓解作用。利用2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB）构建特应性皮炎小鼠模型,通过灌胃6种共32株双歧杆菌,以小鼠病理特征和免疫炎症变化为指标筛选有效的菌株,比较双歧杆菌缓解特应性皮炎的共同点和差异点。结果发现,长双歧杆菌CCFM1029和两歧双歧杆菌BI1可通过降低炎症细胞的浸润,抑制Th2型免疫反应,缓解特应性皮炎小鼠的病理征状。短双歧杆菌BR1、青春双歧杆菌Ad1则通过减少小鼠组织肿胀程度,降低血清IgE水平,提高IL-10的水平,从而缓解小鼠的病理症状,其余双歧杆菌菌株则对特应性皮炎无缓解作用。这些结果表明双歧杆菌菌株通过不同的作用方式缓解了小鼠的特应性皮炎的症状,且与免疫反应的调节相关,表现出差异性的缓解作用。其次,探究了肠道菌群对双歧杆菌缓解特应性皮炎的作用。利用16S rRNA扩增子测序技术分析小鼠肠道菌群多样性和组成的变化。双歧杆菌通过提高小鼠肠道菌群的α多样性和调节肠道菌群的β多样性而改善了肠道菌群的多样性和组成。通过线性判别分析发现,特应性皮炎小鼠肠道菌群富集了Dorea、萨特氏菌、假单胞菌等有害菌属,因此导致涉及支链氨基酸合成、上皮细胞细菌侵入、脂多糖合成等代谢通路的肠道菌群的功能基因显着上调。双歧杆菌则通过提高乳杆菌、双歧杆菌、Allobacullum、毛螺菌科的相对丰度,降低S24-7科的相对丰度而改变了DNFB诱导的有害菌和代谢活动的富集。因此,双歧杆菌的摄入抑制了有害代谢活动的过表达,还上调了脂肪酸合成、丙酸盐代谢、丁酸盐代谢、亚油酸代谢等功能基因的表达。这些结果说明双歧杆菌通过调节小鼠肠道菌群的多样性、结构组成、代谢活动而影响对特应性皮炎的缓解作用。进一步基于宏基因组学和代谢组学技术探究了长双歧杆菌CCFM1029菌株缓解特应性皮炎的作用机制。研究表明长双歧杆菌CCFM1029死菌无法缓解小鼠特应性皮炎病理症状,因此推断长双歧杆菌CCFM1029是通过调节小鼠肠道菌群活动而起到缓解特应性皮炎的作用。长双歧杆菌CCFM1029通过提高小鼠肠道中乳杆菌、梭菌属、葡萄球菌、毛螺菌科、糖化细菌门的细菌的丰度,从而上调小鼠肠道菌群氨基酰tRNA合成、同源重组、色氨酸代谢功能。通过粪便代谢组富集分析发现,色氨酸代谢可能是长双歧杆菌CCFM1029缓解特应性皮炎的作用途径,进一步验证发现长双歧杆菌CCFM1029缓解特应性皮炎依赖芳香烃受体。吲哚3-甲醛作为芳香烃受体的配体,可直接激活芳香烃受体,长双歧杆菌上调色氨酸代谢活动而提高吲哚3-甲醛的含量,通过芳香烃受体阻断胸腺基质淋巴生成素的生成,进而降低IL-4,IL-5的表达,抑制了Th2型免疫反应,从而缓解小鼠的皮肤病理症状。最后评估了长双歧杆菌CCFM1029对特应性皮炎患者的缓解作用效果。长双歧杆菌CCFM1029通过调节患者肠道菌群的β多样性,降低条件致病菌志贺氏菌和不动杆菌的相对丰度,提高双歧杆菌和Anaerostipes的相对丰度,富集Parabacteroides和RuminococcaceaeUCG002,从而抑制与脂多糖合成,脂多糖合成蛋白相关的肠道菌群的功能基因的过表达,上调对宿主健康具有重要作用的氨基酸代谢、脂类代谢、维生素代谢、免疫系统调节相关的肠道菌群的功能基因的丰度,这与小鼠肠道菌群基因功能预测结果具有一致性。这些变化有助于降低患者生活质量评分,改善患者的生活质量,降低患者的病理严重程度评分（改善率>25%时,有效率约为65.2%）和血清IgE的水平,通过调节免疫应答而缓解患者的病理症状。
冉庆森[8]（2020）在《以小胶质细胞自身免疫炎症调节为切入点探讨DHA在EAE模型小鼠中的药效及分子机制》文中研究表明1.研究背景及目的多发性硬化症（multiple sclerosis,MS）是一种以髓鞘脱失和神经元变性为特点的中枢神经系统（central nervous system,CNS）自身免疫炎症性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE）是一种以CNS内小血管周边大量单个核细胞弥漫浸润及脱髓鞘为特点的MS动物实验模型。MS的致病因素多样,疾病进展的驱动机制复杂。近年来对中枢神经系统免疫微环境的研究结果表明,小胶质细胞在MS的疾病诱发和进展中起重要作用[1]。因此,聚焦中枢神经系统小胶质细胞的调控,改变中枢神经系统免疫微环境的属性和状态,对于包括MS在内的多种中枢神经系统疾病的治疗具有核心且共通性的研究价值。目前,MS的临床治疗处于“能缓不能治,治标不治本”的状态,在MS“高发与难治”的强烈对比下,MS的疾病机理认识与治疗手段拓展成为现代免疫学、神经生物学与新药研发的共同关注热点与应用焦点,具有明确的科学创新意义与实践应用价值。倍半萜类化合物双氢青蒿素（Dihydroartemisinin,DHA）分子式为:C15H24O5分子量为284.35,物化性质为白色结晶或结晶性粉末[2]。随着对DHA研究的不断深入,DHA的药效药理学优势不仅仅只局限在治疗疟疾,其在抗炎免疫调节方面也显示出极大的应用前景。前期研究发现其在治疗免疫性疾病,特别是针对自身免疫病具有明确的有效性,并且初步明确了DHA能够通过调控Th17/Treg细胞平衡机制进而抑制自身免疫炎症性肠病（IBD）[3]。但目前上述研究仍存在关键科学问题的研究空白:（1）DHA调控免疫炎症的共通基础不明,疾病谱不清,特别是其在中枢神经系统自身免疫炎症调控中的应用有效性缺乏系统研究;（2）DHA调控T细胞平衡的免疫过程不明,其对免疫炎性微环境的调控活性缺乏系统的阐释和实验描述;（3）DHA发挥免疫调控活性的潜在分子机制不明,具体分子靶点和相关信号通路缺乏精细化的分析和揭示;基于上述分析,从药效评价、免疫功能揭示、分子机制探索三个方面开展DHA的全面系统研究,是提升DHA药物认识水平,促进DHA合理有效应用的关键研究内容。众所周知,T细胞的平衡调控是一个复杂而庞大的体系,而“抗原递呈细胞-T细胞”的整合作用单元在T细胞的免疫功能平衡调控中发挥着重要的作用,是自身免疫炎症损伤启动和持续激活的核心病理基础。而基于上述理论的DHA药物研究仍为空白。因此,本文结合DHA的药效特点和MS的病理特征,建立系统的EAE药效评价体系,开展全面的DHA药效活性评价。以中枢神经系统中的抗原递呈细胞小胶质细胞的浸润和激活为基础,建立基于小胶质细胞-T细胞相互作用的免疫活性研究策略,拓展DHA的炎症调节活性认识。并以中枢神经系统炎症中小胶质细胞的功能性改变为切入点,进行机制挖掘和研究,完善“点面集合”的分子药理机制揭示研究,明确分子机理和活性特征,探索DHA在EAE病理环境的重塑中发挥的作用。2.研究方法和内容1.DHA治疗EAE模型小鼠的药效学作用研究（1）建立MOG35-55实验性自身免疫脑脊髓炎动物模型。包括复发缓解（RRMS）动物模型和继发进展（SPMS）动物模型,以DHA2mg/kg/d,10mg/kg/d,20mg/kg/d为给药低,中,高剂量,甲泼尼龙1mg/kg/d为阳性药。分别在小鼠造模第2天开始灌胃给药干预。正常对照组和模型组分别给予等剂量的溶剂。每日定时观测小鼠的状态变化。RRMS动物模型:连续给药23天后,小鼠步态仪进行步态行为检测小鼠机能动态变化。行为学检测后,一部分取出脑和脊髓组织进行组织学（LFB,透射电镜）检测;另一部分小鼠分离血清和脑脊液。SPMS动物模型:连续给药53天后,开始进行步态行为学检测小鼠机能动态变化。行为学实验结束后,采用脊髓和脑组织进行Olig 2的免疫组织化学检测。（2）RRMS小鼠行为学检测后,取出脊髓和脑进行H&E染色,检测炎症细胞浸润的情况;分离中枢神经系统单个核细胞（MNCS）,qRT-PCR法检测MNCS中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和抑炎因子IL-10、TGF-β的mRNA表达2.DHA对EAE模型小鼠的抗炎免疫活性认识的研究（1）分离小鼠中枢神经系统内的单个细胞,进行细胞质检,将细胞数目调整至浓度为1 × 106/mL;10X标记cDNA片段,建库,测序,得到测序数据。采用PCA降维度的方式来看细胞之间的相似性,针对PCA结果中解释方差最大的前10个主成分,采用T-Distributed Stochastic Neighbor Embedding对单细胞群聚类进行可视化,进而得到与EAE疾病相关的细胞亚群和差异基因。（2）体外培养小鼠巨噬细胞株Raw 264.7和小鼠小胶质细胞株BV2,并且体外分离小鼠腹腔巨噬细胞（peritonealmacrophage,PM）。分别以DHA1,4μM为给药低,高剂量和LPS 50ng/ml为造模浓度,细胞经过药物处理24h。首先,RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）的方法在转录水平上检测Raw264.7和PM细胞中负性免疫共刺激分子PDL1的表达;间接免疫荧光技术检测Raw264.7,BV2和PM三种细胞表面免疫共刺激分子PDL1的蛋白表达水平;采用人外周血白血病T细胞JurkatT与小鼠小胶质细胞BV2建立体外“巨噬细胞-T细胞”共培养模型,通过流式细胞技术检测在共培养体系中,DHA对Jurkat T细胞中Treg细胞的分化水平（FOXP3的表达）。（3）体外分离小鼠中枢神经系统单个核细胞（MNCS）,qRT-PCR的方法检测CCL5的表达;ELISA法检测EAE模型小鼠血清和脑脊液中CCL5的含量;趋化实验中,ELISA法检测BV2培养上清中CCL5的含量;transwell法验检测CCL5对小胶质细胞趋化能力变化。（4）体外分离小鼠中枢神经系统单个核细胞（MNCS）,qRT-PCR的方法检测AXL的表达;Western Blot法检测BV2细胞AXL的蛋白表达情况;吞噬试验中,先诱导PC12细胞凋亡,Annexin V-FITC双染法检测PC12细胞的凋亡率;间接免疫荧光方法检测BV2细胞对凋亡的PC12细胞的吞噬能力,并且采用荧光显微镜观察BV2细胞对凋亡PC12细胞的吞噬情况。3.聚焦“小胶质细胞功能调节”的DHA抑制中枢神经系统炎症的分子机制研究（1）为了在分子机制水平上验证DHA对AXL的依赖性,我们使用AXL的阻断剂SGI7079（0.2μM）阻断AXL的激活,我们首先采用BV2细胞吞噬凋亡PC12细胞的方法检测BV2细胞吞噬能力的变化;transwell法验检测CCL5对小鼠小胶质细胞BV2趋化能力变化;最后采用JurkatT与小鼠小胶质细胞BV2建立体外“巨噬细胞-T细胞”共培养模型,间接免疫荧光法检测DHA对Jurkat T细胞中Treg细胞的分化水平（FOXP3的表达）。（2）Western Blot法检测BV2细胞经过DHA和LPS处理后AXL,Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1的表达。在上述研究的基础上加入SGI7079作用后,同样检测AXL,Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1 的表达情况。（3）BV2细胞用DHA1和4 μM作用24h后,间接免疫荧光方法检测BV2细胞的PDL1,FOXP3,CYSE/F480的表达量,ELISA法检测BV2细胞上清中CCL5的含量,transwell法检测对BV2细胞的趋化能力。BV2细胞用IFN-β和STAT1阻断剂Fludarabine作用后,间接免疫荧光法检测CYSE+/F480+的表达量,Western Blot检测Phospho-STAT1,SOCS3,Total-AXL,Phospho-AXL的蛋白表达量。3.研究结果1.DHA治疗EAE模型小鼠的药效学作用研究模型验证:MOG35-55造模后,每日疾病评分逐渐增加;行为学步态等指标出现明确障碍。组织学水平和脊髓电镜超显微结构结果显示上伴随有髓鞘脱失。上述结果证明:EAE模型造模成功,满足用于药物评价的实验要求。1.1 DHA在EAE小鼠中具有机能改善和神经保护的作用RRMS动物模型药效验证:RRMS主要是发病的初期阶段,以中枢神经系统炎症为主并伴随有髓鞘脱失,因此,进行炎症损伤和神经保护检测。与EAE模型组相比,DHA各给药组和MET组能够改善EAE模型小鼠的技能活动障碍。并且在组织学水平上能够对髓鞘起到保护作用。在神经保护作用层面上,DHA中剂量效果明显优于MET组。SPMS动物模型药效验证:SPMS是发病的后期,主要是少突胶质细胞失活而导致髓鞘大量的脱失,Olig 2则是少突胶质细胞的活性标记物,因此通过检测Olig 2的表达来反映少突胶质细胞的活性。与EAE模型组小鼠相比,DHA各给药组和MET组均能够改善EAE模型小鼠的机能活动障碍。组织学水平上,DHA各个剂量组和MET组均能显着提高Olig 2的阳性表达率,并且DHA剂量组具有剂量依赖性。1.2 DHA能够抑制RRMS小鼠中枢神经系统炎症H&E结果显示DHA和MET均能显着降低脑组织和脊髓组织中的炎症细胞浸润水平;DHA各个给药组和MET组均能够下调促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达,相反,抑炎因子IL-10、TGF-β的转录明显激活;同时,DHA重塑炎症反应平衡的活性具有显着的剂量依赖性,并且DHA中,高剂量组均优于MET组。2.DHA对EAE模型小鼠的抗炎免疫活性认识的研究2.1基于10X Genomics技术对DHA调控EAE小鼠中枢神经系统单个核细胞亚群分析细胞亚群分析:得到了 14个细胞亚群,而与EAE疾病模型进程相关性最大的两类细胞亚群分别是巨噬细胞和小胶质细胞。差异基因分析:在EAE模型小鼠的14个细胞亚群中筛选出受DHA调控的基差异基因共305个,而在巨噬细胞和小胶质细胞中富集了差异明显（Fold change>2）的基因共计25个。最后,通过文献挖掘与分子验证,选择富集度最高的并且与EAE疾病进程关系较为密切的候选基因基因:AXL和CCL5,进行进一步的药理学分子机制研究;同时,基于前期研究提示和最新的免疫学研究进展,聚焦“小胶质细胞-T细胞整合调控单元”,从抗原递呈的双信号系统入手,从另一个角度开展药理学研究。2.2 DHA对自身免疫抗原递呈的药物活性研究首先,在分子水平,以Raw264.7和腹腔巨噬细胞为模型,DHA能够显着上调PDL1在细胞表面的表达水平;同时,在功能水平,DHA还能够促进Jurkat T细胞分化成Treg细胞,上调Treg表面标记分子FOXP3的表达。2.3 DHA对自身免疫炎性趋化的药物活性研究体内实验中,qRT-PCR结果表明,在MNCS中,DHA和MET均能够在转录水平抑制CCL5的表达,并且具有剂量依赖性,DHA效果优于MET组。ELISA结果说明,DHA能够减少EAE模型小鼠血清和脑脊液中CCL5的含量。体外实验中,ELISA结果显示,LPS能够升高BV2细胞培养上清中CCL5的含量,而DHA能够减少CCL5的含量;transwell的检测结果中,DHA能够减弱对BV2细胞的趋化能力。2.4 DHA对自身免疫炎症原清除的活性研究体内实验中,qRT-PCR结果表明,在MNCS中,DHA和MET均能够上调吞噬核心介导分子AXL的表达。Western Blot检测表明,DHA可以显着上调BV2细胞中AXL的表达;同时,通过凋亡细胞清除实验,荧光显微镜观察与流式细胞分析分别从定性与定量的双重角度证明:在PC12细胞诱导凋亡成功有效的前提下,DHA能够促进小胶质细胞对凋亡细胞的胞葬能力,促进凋亡细胞碎片的有效清除。3.聚焦“小胶质细胞功能调节”的DHA抑制中枢神经系统炎症的分子机制研究3.1基于小胶质细胞的功能体系的DHA靶向AXL的作用机制研究在进一步的机制研究中发现,BV2细胞在AXL的阻断剂SGI7079干预后,间接免疫荧光结果显示,DHA对自身免疫抗原递呈的能力可被SGI7079所消除;荧光显微镜观察和间接免疫荧光检测可发现,DHA对自身免疫炎症原清除能力也被SGI7079所抑制;transwell检测表明,自身免疫炎性趋化能力也被SGI7079所阻断。3.2 DHA基于AXL调控自身免疫炎症的分子通路研究机制通路水平的研究中,Western Blot检测表明,DHA分别能够上调Total-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1蛋白的表达,差异具有统计学意义。而加入SGI7079作用后,DHA在上调Total-AXL的表达的情况下,其他Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1蛋白的表达均被抑制。3.3 DHA对炎症“促-抑”平衡调控的病理状态特异性研究的初探间接免疫荧光结果表明,与NC组相比,DHA单独干预对自身免疫抗原递呈,自身免疫炎性趋化,自身免疫炎症原清除能力均无显着性差异;BV2细胞在IFN-β干预后,间接免疫荧光结果显示DHA可以增加CYSE+/F480+的细胞亚群的数量,促进BV2的吞噬能力,Fludarabine干预后BV2的吞噬能力则消失了。Western Blot检测表明,在IFN-β干预下,DHA就能上调Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1蛋白的表达,当Fludarabine加入后,DHA对以上蛋白表达均无显着性差异。4.结论1.DHA可以改善EAE小鼠的运动机能障碍;并且在组织学水平上具有神经保护和调节炎症的作用,进一步缓解EAE模型小鼠的中枢神经系统炎症;2.中枢神经系统巨噬细胞及小胶质细胞是DHA在EAE模型中的主要效应细胞,同时小胶质细胞中AXL、CCL5等相关炎症分子的变化构成了DHA发挥药效的主要分子基础;3.DHA在中枢神经系统中对自身免疫性炎症的抗原递呈、炎症趋化、抗原清除发挥了系统而多样的调节活性,最终实现了自身免疫炎症反应的平衡重塑和髓鞘保护。分别总结如下:（1）DHA可以调节抗原加工递呈过程,降低T细胞对自身抗原的高反应状态。促进免疫共抑制分子PDL1的表面表达,逆转中枢神经系统自身免疫性炎症的过激状态,重塑T细胞（Th17/Treg）炎症促抑平衡。（2）DHA可以减少炎性趋化,降低CNS中炎性细胞的募集浸润水平。DHA能显着抑制炎性趋化因子CCL5的表达和分泌,减少炎症损伤部位炎性细胞的浸润,降低炎性细胞的运动趋化能力,进而延缓炎症损伤进展。（3）DHA能够增加小胶质细胞对损伤髓鞘的有效清除,促进炎症进程的主动消散。DHA能够显着且特异性的上调吞噬受体AXL的表达,加强病灶内凋亡细胞碎片的清除能力,减少自身免疫炎症原的暴露,削弱炎症反应的诱发水平。4 DHA对自身免疫炎症反应的调节活性聚焦于对AXL这一分子靶点的有效调控并依赖于“IFNAR-STAT1-SOCS3”信号通路的高水平活化状态。上述分子机制研究也为DHA治疗自身免疫炎症提供了病理选择性和药效特异性的初步实验提示。
李慧珍[9]（2020）在《猪内脂素重组蛋白的优化及其在断奶仔猪免疫炎症反应中的作用》文中进行了进一步梳理内脂素（Visfatin）是一种新型脂肪细胞因子,与机体炎症和免疫应答反应密切相关。断奶仔猪免疫应激是影响仔猪生产性能的重要原因之一,其主要的病理变化是炎症反应,但最终导致仔猪生长的受阻,给畜牧业生产造成巨大经济损失。本实验室前期研究表明,在脂多糖（LPS）诱导的断奶仔猪免疫应激动物模型中,脾脏白髓和红髓中的内脂素阳性表达产物显着增多,推测内脂素作为炎性介质可能参与了断奶仔猪免疫应激炎症反应的发生和发展。为了获得大量内毒素含量低、并具有生物活性的猪内脂素重组蛋白,并明确其在断奶仔猪免疫应激反应中的作用。本研究首先利用原核表达,蛋白质纯化,生物活性验证,Western Blot,q RT-PCR和ELISA技术制备猪内脂素重组蛋白。然后在利用LPS诱导成功构建的断奶仔猪免疫应激模型基础上,通过q RT-PCR,ELISA,免疫组织和TUNNEL法研究内脂素在断奶仔猪免疫炎症反应中的作用。具体研究结果如下:1猪内脂素重组蛋白的原核表达及纯化条件优化以猪肝脏组织总RNA为模板,利用PCR技术,扩增猪内脂素基因,转入p EASY-T1载体后,再转化Trans5α。进行质粒提取,并与p ET-28a和p ET-30a同时进行Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切;将胶回收得到的Visfatin目的基因片段分别连接到p ET-28a和p ET-30a载体上,转化DH5α,对含有目的基因的表达载体进行克隆;提取重组表达质粒分别转入大肠杆菌Trans BL21和Transetta,经IPTG诱导表达、蛋白经纯化系统AKTAprime10纯化后,采用SDS-PAGE和Western Blot技术进行检测。结果表明,Visfatin-p ET28a-Transetta在16℃诱导16h条件下,能稳定表达出大量高纯度的猪重组内脂素蛋白,为最优表达菌株。2猪内脂素重组蛋白中内毒素去除及检测各国对生物制品的内毒素含量都有严格的要求,为保证生物制品使用的安全性,必须加以去除。本试验选用内毒素去除试剂进行猪内脂素重组蛋白中内毒素的去除,并使用内毒素检测鲎试剂盒检测去除效果。结果表明,去除内毒素后的猪内脂素重组蛋白残余量低于1EU/m L,在安全范围内,防止了其可能对后续试验结果判断产生的影响。3猪内脂素重组蛋白生物活性验证将去除内毒素后的猪内脂素重组蛋白作用于Raw264.7细胞。CCK-8结果显示,随着内脂素浓度的增加,细胞存活率先升高后降低,均高于阴性对照组,当浓度为700 ng/m L时,细胞存活率最高,且差异极显着（p?0.0001）,提示内脂素具有促进Raw264.7细胞存活的作用。随后分别设置PBS组、Visfatin组和Visfatin+Poly.B组,并与细胞共孵育6h。q RT-PCR和ELISA结果显示,与PBS组相比,Visfatin组炎症因子IL-1β、TNF-α和MCP-1的m RNA和蛋白表达水平均差异极显着上调;而Visfatin+Poly.B组与Visfatin组相比,炎症因子的m RNA和蛋白表达水平却均没有明显差异。上述结果表明,猪内脂素重组蛋白促进Raw264.7细胞的炎症活动,而残留的内毒素不起作用,证明猪内脂素重组蛋白具有生物学活性。4猪内脂素重组蛋白对断奶仔猪炎症因子表达的影响利用LPS诱导构建断奶仔猪免疫应激模型,测定每头猪的体重及脾脏重量,并计算脾脏指数（脾脏重量（g）/体重（kg））,结果显示:与PBS组相比,LPS组脾脏重量和脾脏指数明显上升,且均差异极显着（p?0.001）,Visfatin组的则无显着变化;而LPS+Visfatin组脾脏重量和脾脏指数与LPS组的相比,明显降低,且均差异极显着（p?0.01）。采用q RT-PCR和ELISA技术检测各组脾脏组织中炎症因子IL-1β、IL-6和MCP-1表达变化,结果显示,与PBS组相比,Visfatin组IL-1β、IL-6和MCP-1的m RNA和蛋白表达水平均没有明显差异,而LPS组的却均显着升高。与LPS组相比,LPS+Visfatin组IL-1β、IL-6和MCP-1的m RNA和蛋白表达水平均显着降低。以上结果表明:LPS激活脾脏免疫系统,诱使淋巴细胞合成大量的炎性细胞因子,致使脾脏功能亢进肿大,而内脂素能通过下调炎症因子的表达,降低LPS引起的脾脏组织炎性损伤。5猪内脂素重组蛋白对断奶仔猪抗氧化功能的影响采用ELISA检测各组猪外周血清中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、溶菌酶（LZM）和超氧化物歧化酶（SOD）的表达量变化。结果显示:与PBS组相比,Visfatin组的MDA表达量无显着差异,GSH-Px和SOD均明显升高,而LPS组的MDA的表达量却明显升高,且差异极显着（p?0.01）,但GSH-Px无明显变化,而SOD和LZM均明显升高。LPS+Visfatin组与LPS组相比,MDA的表达量明显降低,且差异显着（p?0.05）,GSH-Px、SOD和LZM均显着升高。结果表明,内脂素通过提升机体的抗氧化功能,降低断奶应激对仔猪造成的氧化损伤;LPS刺激后,机体发生了严重的氧化损伤,外源性注射内脂素降低了血清中MDA的含量,提高SOD、GSH-Px和LZM的酶活性,证明内脂素通过提升断奶仔猪的抗氧化功能降低免疫应激对机体造成的损伤。6猪内脂素重组蛋白对断奶仔猪外周免疫器官细胞增殖和凋亡的影响采用免疫组化、TUNEL技术以及Leica Image Scope软件,研究并统计分析了不同组脾脏和肠系膜淋巴结组织内细胞的增殖和凋亡。免疫组化法检测增殖细胞核抗原（PCNA）结果显示:增殖细胞阳性信号PCNA主要分布于脾脏和肠系膜淋巴结组织内的生发中心;与PBS组相比,Visfatin组脾脏和肠系膜淋巴结组织内PCNA阳性率均显着升高,而LPS组的却均差异极显着降低;与LPS组相比,LPS+Visfatin组脾脏和肠系膜淋巴结组织内PCNA阳性率均明显升高,且差异均极显着（p<0.01）。TUNEL检测结果显示:与PBS组相比,Visfatin组脾脏和肠系膜淋巴结组织内凋亡细胞阳性率均有降低的趋势;与LPS组相比,LPS+Visfatin组脾脏和肠系膜淋巴结组织内凋亡细胞阳性率均差异均极显着降低。此外,利用q RT-PCR技术检测脾脏组织内细胞凋亡的相关基因,结果显示:与PBS组相比,LPS组的FAS和caspase-3表达均明显上调,且差异极显着（p<0.0001）,Visfatin组caspase-3呈下降趋势。而与LPS组相比,LPS+Visfatin组FAS和caspase-3表达则均差异极显着降低。上述结果表明,内脂素通过促进外周免疫器官脾脏和肠系膜淋巴结组织细胞增殖、抑制的细胞凋亡,改善断奶应激仔猪的免疫机能;LPS激活了线粒体凋亡途径,从而抑制了细胞增殖,促使脾脏和肠系膜淋巴结发生凋亡损伤。而外源性注射内脂素通过抑制LPS刺激诱导的外周免疫器官细胞凋亡、促进外周免疫器官细胞增殖、降低FAS和caspase-3的表达,改善机体发生免疫应激时的免疫状况。
洪天一[10]（2020）在《蝎黄解痉治哮颗粒影响NF-κB和HIF-1α信号传导通路治疗哮喘的调控机制》文中研究指明研究目的支气管哮喘是儿科常见的呼吸系统疾病,严重危害儿童的身体健康。且病情顽固难愈,病程迁延反复,如果未及时治疗,可伴随终身[1]。研究表明,气道慢性炎症是气道重塑的发生基础,而重塑则是气道炎症缓慢发展的必然结果,气道持续性的炎症反应以及损伤和修复,最终导致组织增生和气道狭窄[2-3]。核转录因子Kappa B（NF-κB）、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、丝氨酸/苏氨酸激酶（AKT）分别是炎症和缺氧反应中的关键转录因子,受上游的丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路的调控,从而激活其下游的血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、转化生长因子β1（TGF-β1）等基因表达,在气道炎症反应[4-8]和气道重塑演进过程中[9-11]发挥重要作用。蝎黄解痉治哮颗粒为导师冯晓纯教授基于中医理论与前人总结经验的自拟方,全方由麻黄、全蝎、杏仁、白果、苦参、甘草等组成。以《摄生众妙方》中定喘汤为基础,加减化裁而来,加入祛风解痉的虫类药全蝎为理论基础,具有宣肺解痉、止咳平喘的功效。本课题文以NF-κB和HIF-1αα作为切入点,探讨蝎黄解痉治哮颗粒对MAPKs信号通路调节NF-κB和HIF-1αα的作用,阐述其缓解支气管哮喘气道炎症和气道重塑的机制,为今后中医药防治哮喘病的基础研究提供必要的理论与实验依据。研究方法实验一:建立急性哮喘小鼠模型,分为对照组、模型组、蝎黄解痉治哮颗粒高剂量组（XHG）、蝎黄解痉治哮颗粒低剂量组（XHD）和孟鲁司特组（Montelukast）。体内实验观察指标:（1）雾化激发时观察小鼠一般状态及行为学;（2）支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中细胞计数及细胞因子;（3）肺组织切片进行苏木精-伊红（haematoxylin and eosin,HE）染色、过碘酸雪夫（periodic acid-schiff,PAS）染色、Masson染色进行病理检查和比较结果;（4）通过免疫组化法检测肺组织中p-ERK 1/2、p-p38MAPK、p-JNK 和 Akt、p-NF-κBp65 蛋白表达,及其下游通路的 VEGF、MMP-9、TGF-β1蛋白表达。体外实验观察指标:（1）检测药物对16HBE（人支气管上皮细胞）细胞毒性实验;（2）免疫荧光法检测LPS诱导16HBE细胞中p-NF-KB p65表达,以及蝎黄解痉治哮颗粒的干预作用。实验二:建立哮喘气道重塑模型小鼠,分为对照组、模型组、蝎黄解痉治哮颗粒高剂量组（XHG）、蝎黄解痉治哮颗粒低剂量组（XHD）和孟鲁司特组（Montelukast）。体内实验观察指标:（1）支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中细胞计数及炎症细胞因子的变化;（2）肺组织切片进行苏木精-伊红（haematoxylin and eosin,HE）染色、过碘酸雪夫（periodic acid-schiff,PAS）染色、Masson染色进行病理检查和比较结果;（3）通过免疫组化法检测肺组织中p-ERK 1/2、p-p38、p-JNK、Akt和HIF-1α蛋白表达,及其下游通路的VEGF、MMP-9、TGF-p1蛋白表达,以及α-SMA蛋白表达;（4）免疫荧光法检测哮喘模型小鼠肺组织内α-SMA蛋白表达;（5）免疫蛋白印记法（Western Blot,WB）检测模型小鼠肺组织内α-SMA蛋白表达水平。体外实验观察指标:（1）检测药物对ASMC（气道平滑肌细胞）细胞毒性实验;（2）免疫荧光法检测LPS诱导RASMC细胞p-NF-κB p65蛋白表达,以及蝎黄解痉治哮颗粒的干预作用。研究结果实验—结果（1）OVA致敏小鼠出现哮喘发作表现。（2）实验结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠BALF中炎症细胞总数及分类细胞计数（嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞）明显升高,蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理后,炎症细胞数量及分类细胞计数明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。BALF中细胞因子检测结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠TNF-α、IL-6、IL-1(β水平增加,经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可显着降低哮喘小鼠BALF中TNF-αα、IL-6、IL-1β水平,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）HE染色结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠炎症细胞广泛浸润到气管及血管周围。经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理显着改善这种情况。PAS染色结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠气道周围杯状细胞增生明显,黏液分泌增加,经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制哮喘小鼠气道杯状细胞增生及黏液分泌。Masson染色结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠肺气道上皮维化程度加深,经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制哮喘小鼠气道上皮纤维化程度。（4）免疫组化法检测小鼠肺组织中p-ERκ1/2、p-JNK、p-p38 MAPK、AKT、p-NF-KB p65、VEGF、MMP-9和TGF-β1蛋白表达的变化。结果表明,与对照组相比较,模型组小鼠肺组织中各蛋白表达明显增加,与模型组相比较,蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制上述蛋白表达。差异具有统计学意义（P<0.05）。（5）免疫荧光法检测LPS诱导16HBE细胞中p-NF-κB p65蛋白表达的变化。结果表明,与对照组相比较,LPS诱导的16HBE细胞中p-NF-κB p65蛋白表达明显增加,与模型组相比较,蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制p-NF-κB p65蛋白表达。差异具有统计学意义（P<0.05）。实验二结果（1）实验结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠BALF中炎症细胞总数及分类细胞计数（嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞）明显升高,蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理后,炎症细胞数量及分类细胞计数明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。BALF中细胞因子检测结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠TNF-α IL-6、IL-1β水平增加,经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可显着降低哮喘小鼠BALF中TNF-α、IL-6、IL-1p水平,差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）HE染色结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠炎症细胞广泛浸润到气管及血管周围。经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理显着改善这种情况。PAS染色结果表明,与对照组小鼠比较,模型组小鼠气道周围杯状细胞增生明显,黏液分泌增加,附着于上皮管腔内,部分地方形成粘液栓。经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制哮喘小鼠气道杯状细胞增生及黏液分泌。Masson染色结果表明,与对照组小鼠比较,模型组可见上皮细胞紊乱、脱落,气道壁增厚,气管腔狭窄,部分小血管形成和大量胶原纤维沉积,经蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制哮喘小鼠气道上皮纤维化程度。（3）免疫组化法检测小鼠肺组织中p-ERK1/2、p-JNK、p-p38MAPK、AKT、HIF-1α、VEGF、MMP-9和TGF-p1蛋白表达的变化。结果表明,与对照组相比较,模型组小鼠肺组织中各蛋白表达明显增加,与模型组相比较,蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制这些蛋白表达。差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）免疫荧光法检测LPS诱导RASMCs中p-NF-KB p65蛋白表达的变化。结果表明,与对照组相比较,LPS诱导的RASMCs中p-NF-κBp65蛋白表达明显增加,与模型组相比较,蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制p-NF-κB p65蛋白表达。差异具有统计学意义（P<0.05）。（5）分别通过免疫组化法、免疫荧光法和WB法检测模型小鼠肺组织中αα-SMA蛋白表达的变化。结果表明,与对照组相比较,模型组α-SMA蛋白表达明显增加,与模型组相比较,高剂量蝎黄解痉治哮颗粒或孟鲁司特处理可明显抑制α-SMA蛋白表达。研究结论（1）蝎黄解痉治哮颗粒可抑制急性哮喘模型小鼠和哮喘气道重塑模型小鼠BALF中炎症细胞和相关细胞因子的表达,减轻了模型小鼠气道内炎症反应。（2）蝎黄解痉治哮颗粒可显着减少急性哮喘模型小鼠和哮喘气道重塑模型小鼠气道及血管周围炎症细胞浸润,减少气道杯状细胞增生及黏液分泌,减少胶原细胞沉积降低气道上皮下纤维化程度。（3）由急性哮喘模型小鼠肺组织实验结果证实,蝎黄解痉治哮颗粒能抑制MAPKs、Akt、NF-<B通路的激活,以及其下游VEGF、MMP-9、TGF-β1的表达,阻止了由此引发的支气管哮喘的反复发作。（4）由哮喘气道重塑模型小鼠肺组织实验结果证实,蝎黄解痉治哮颗粒能抑制MAPKs、Akt、HIF-1α通路的激活,以及其下游VEGF、MMP-9、TGF-β1的表达,阻止了由此引发的支气管哮喘的反复发作。（5）蝎黄解痉治哮颗粒能抑制哮喘气道重塑模型小鼠肺组织内α-SMA的表达,进而减轻哮喘模型小鼠的气道高反应和减缓气道重塑。（6）蝎黄解痉治哮颗粒可抑制LPS诱导的16HBE细胞和RASMCs中p-NF-κB p65蛋白表达。
二、糖皮质激素在免疫-炎症中作用机制的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、糖皮质激素在免疫-炎症中作用机制的研究进展（论文提纲范文）
（1）肺脾为核心脏腑整体辨证支气管哮喘慢性持续期免疫调控研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 支气管哮喘慢性持续期免疫调控研究 |
| 前言 |
| 1 支气管哮喘慢性持续期的免疫调控特征 |
| 2 支气管哮喘慢性持续期炎性因子与免疫调控的相互关系 |
| 3 免疫调控对支气管哮喘慢性持续期预后转归的影响 |
| 4 支气管哮喘慢性持续期免疫调控的临床需求 |
| 5 支气管哮喘慢性持续期免疫调控的临床局限与未来展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医支气管哮喘慢性持续期免疫调控研究 |
| 前言 |
| 1 支气管哮喘慢性持续期的中医观 |
| 2 支气管哮喘慢性持续期中医临床特征与免疫炎症的相关性 |
| 3 支气管哮喘慢性持续期中医病机演变与免疫调控的相互关系 |
| 4 中医干预对支气管哮喘慢性持续期炎性因子与免疫调控的作用 |
| 5 中医通过免疫调控影响支气管哮喘慢性持续期预后转归 |
| 6 支气管哮喘慢性持续期中医免疫调控的优势与特色 |
| 7 支气管哮喘慢性持续期中医免疫调控面临的问题与发展趋势 |
| 参考文献 |
| 第二部分 支气管哮喘慢性持续期“肺脾为核心脏腑整体辨证”理论研究 |
| 1 “脏腑整体辨证”观 |
| 1.1 整体观念 |
| 1.2 脏腑辨证 |
| 1.3 “脏腑整体辨证”的含义 |
| 2 “肺脾为核心脏腑整体辨证”观 |
| 2.1 支气管哮喘慢性持续期关键病机的共性规律特征 |
| 2.2 “肺脾为核心脏腑整体辨证”的含义 |
| 3 “温润辛金培本”原理方药的临床应用 |
| 3.1 “温润辛金培本”治则理论基础 |
| 3.2 “温润辛金培本”原理方药系列疗法 |
| 3.3 温润辛金培本原理内服方药 |
| 3.4 温润方 |
| 4 支气管哮喘慢性持续期“肺脾为核心脏腑整体辨证”与西医免疫调控的异同 |
| 4.1 免疫调控失衡的认识思路不同 |
| 4.2 免疫调控的方法有别 |
| 4.3 免疫调控的目的一致 |
| 5 “肺脾为核心脏腑整体辨证”继承与发展了中医解决支气管哮喘慢性持续期问题的优势与特色 |
| 参考文献 |
| 第三部分 肺脾为核心脏腑整体辨证支气管哮喘慢性持续期免疫调控研究 |
| 研究一 基于RCT的肺脾为核心脏腑整体辨证支气管哮喘慢性持续期患者临床信息分析及血清标本收集 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究二 肺脾为核心脏腑整体辨证治疗支气管哮喘慢性持续期调节免疫球蛋白水平的免疫调控机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究三 肺脾为核心脏腑整体辨证治疗支气管哮喘慢性持续期调节促炎ILs水平的免疫调控机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究四 肺脾为核心脏腑整体辨证治疗支气管哮喘慢性持续期调节抗炎ILs水平的免疫调控机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1 结论 |
| 2 特色与创新 |
| 3 问题与展望 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
| 附录 |
| 附件1 支气管哮喘慢性持续期实用性随机对照研究方案 |
| 附件2 试验过程的标准作业程序质量控制(即SOP管理) |
| 附件3 各中心血清采集及哮喘控制情况 |
（2）基于AMPK/SIRT1/PGC-1α通路研究醒脾解郁方对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 抑郁症现代医学研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 抑郁症中医药研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 1. 抑郁症病理机制中的线粒体损伤 |
| 2. 线粒体能量代谢障碍与突触可塑性损伤 |
| 3. 线粒体生物合成异常与抑郁症神经元突触重塑 |
| 4. 从“脾”论治抑郁症或成为中医治疗的新途径 |
| 参考文献 |
| 实验一 醒脾解郁方对肝郁脾虚抑郁大鼠行为学及海马神经元损伤的保护作用研究 |
| 概述 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于AMPK/SIRT1/PGC-1α介导的线粒体生物合成研究醒脾解郁方对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响 |
| 概述 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 基于AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路探讨醒脾解郁方含药血清对皮质酮诱导海马神经元损伤突触重塑的影响 |
| 概述 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 基于AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路探讨突触微环境对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响及醒脾解郁方干预效应 |
| 概述 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 结语 |
| 一、研究总结 |
| 二、初步结论 |
| 三、存在不足 |
| 四、创新点 |
| 五、展望 |
| 第四部分 附录 |
| 附录1: 致谢 |
| 附录2 攻读学位期间发表的学术论文及参与课题情况 |
| 附录3 个人简历 |
（3）m6A修饰在系统性红斑狼疮发病中的作用研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 SLE 患者 T 细胞相关基因 mRNA 的 m6A 修饰研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 资料与标本收集 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 统计分析 |
| 2.5 质量控制 |
| 3 结果 |
| 3.1 第一阶段 SLE 患者 PBMC 中 mRNAs m6A 修饰谱和表达谱的建立 |
| 3.2 第二阶段 SLE 患者 PBMC 中 m6A 修饰相关 mRNAs 的 qRT-PCR 和 western blot验证 |
| 3.3 第三阶段 T 细胞中 m6A 修饰相关 mRNAs 的 qRT-PCR 和 western blot 验证 |
| 3.4 第四阶段 m6A 修饰相关 mRNAs 的功能研究 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 SLE患者中m6A甲基化酶的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 第一阶段 SLE 患者 PBMC 中 m6A 甲基化酶的检测 |
| 3.2 第二阶段 T 细胞中 m6A 甲基转移酶 METTL3 的 qRT-PCR 和 Western Blot 验证 |
| 3.3 第三阶段 METTL3 的相关功能研究 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 m6A 修饰在自身免疫性疾病中的调节作用 |
| 参考文献 |
| 附件 |
（4）羟氯喹对IgA肾病患者残余蛋白尿的疗效研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 研究对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 羟氯喹在IgA肾病患者中抗蛋白尿作用的研究进展 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（5）淮莲饮治疗特应性皮炎的临床回顾分析及对特应性皮炎样小鼠模型的免疫干预实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1.1 特应性皮炎的现代医学研究进展 |
| 1.1.1 特应性皮炎的流行病学特点及危害 |
| 1.1.2 特应性皮炎的发病机制 |
| 1.1.3 特应性皮炎的治疗进展 |
| 1.1.4 特应性皮炎动物模型的研究进展 |
| 1.2 中医药对特应性皮炎免疫调节的研究概况 |
| 1.2.1 中医对特应性皮炎的认识 |
| 1.2.2 中医与免疫 |
| 1.2.3 皮肤与免疫 |
| 1.2.4 中医药对AD免疫调节的影响 |
| 1.3 小结 |
| 第二部分 淮莲饮治疗特应性皮炎的临床回顾性研究 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 诊断标准 |
| 2.1.2 纳入标准 |
| 2.1.3 排除标准 |
| 2.2 治疗方法 |
| 2.3 疗效评价 |
| 2.3.1 治疗前后SCORAD积分及IGA评分比较 |
| 2.3.2 疗效判定 |
| 2.4 研究方法 |
| 2.4.1 资料采集与建立数据库 |
| 2.4.2 病例分组并对比两组疗效 |
| 2.5 临床回顾性研究技术路线图 |
| 2.6 统计学方法 |
| 2.7 结果 |
| 2.7.1 一般资料情况 |
| 2.7.2 病史资料 |
| 2.7.3 临床特征 |
| 2.7.4 两组疗效对比 |
| 2.8 讨论 |
| 2.8.1 临床资料回顾 |
| 2.8.2 淮莲饮的组方分析 |
| 2.8.3 淮莲饮治疗特应性皮炎有效的理论基础 |
| 2.8.4 淮莲饮治疗特应性皮炎的安全性评价 |
| 2.9 小结 |
| 第三部分 淮莲饮对AD样小鼠的免疫干预实验研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验主要药品、仪器与试剂 |
| 3.1.3 分组、建模、给药及检测方法 |
| 3.2 实验指标 |
| 3.2.1 皮损评分 |
| 3.2.2 记录小鼠搔抓次数 |
| 3.2.3 耳肿胀度评价 |
| 3.2.4 皮肤常规病理组织学检查及嗜酸性粒细胞、肥大细胞计数 |
| 3.2.5 免疫分子血清学指标 |
| 3.2.6 背部皮损炎症因子m RNA表达情况 |
| 3.2.7 脾脏Th17/Treg、Th9 细胞表达水平 |
| 3.3 统计学方法 |
| 3.4 结果观察 |
| 3.4.1 淮莲饮对AD样小鼠模型皮损评分的影响 |
| 3.4.2 淮莲饮对AD样小鼠搔抓症状及耳廓肿胀度的影响 |
| 3.4.3 淮莲饮对AD样小鼠皮肤病理及肥大细胞、嗜酸性粒细胞计数的影响 |
| 3.4.4 淮莲饮对AD样小鼠血清学免疫分子的影响 |
| 3.4.5 淮莲饮对AD样小鼠背部皮损炎症因子m RNA表达水平的影响 |
| 3.4.6 淮莲饮对AD样小鼠脾脏Th9、Th17、Treg细胞表达的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 Th1/Th2、Th17/Treg平衡与AD的关联 |
| 3.5.2 Th9/IL-9 与AD的关联 |
| 3.5.3 实验结果分析 |
| 3.6 小结 |
| 结语 |
| 一、结论 |
| 二、创新之处 |
| 三、不足之处 |
| 四、展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（6）重组灵芝免疫调节蛋白在支气管哮喘中的作用及免疫调节机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 中医对哮喘的认识 |
| 一、古代中医对哮喘的认识 |
| 二、现代中医对哮喘的认识与辨治 |
| 第二节 哮喘的西医研究进展 |
| 一、哮喘的定义 |
| 二、哮喘的流行病学研究 |
| 三、哮喘的病因 |
| 四、哮喘的治疗 |
| 五、哮喘与Th17/Treg细胞平衡 |
| 第三节 RLZ-8的免疫研究进展 |
| 一、凝集红细胞作用 |
| 二、免疫活性 |
| 三、抑制过敏性反应 |
| 四、抗癌活性 |
| 五、抗炎 |
| 六、其他作用 |
| 第二章 RLZ-8对哮喘小鼠的作用及免疫调节机制研究 |
| 第一节 实验材料及试剂 |
| 一、实验动物 |
| 二、主要实验仪器 |
| 三、实验试剂 |
| 第二节 实验方法 |
| 一、主要试剂的配制 |
| 二、实验分组及小鼠哮喘模型的建立 |
| 三、肺组织组织学检测 |
| 四、支气管肺泡灌洗液(BALF)免疫学检测 |
| 五、肺组织mRNA提取及Real-time PCR检测 |
| 六、流式细胞术检测小鼠脾脏细胞表型 |
| 七、Western Blotting检测 |
| 八、统计方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 一、rLZ-8降低哮喘小鼠肺部炎症细胞浸润 |
| 二、rLZ-8抑制OVA诱导的哮喘小鼠脾脏CD11c~+ DC的成熟 |
| 三、rLZ-8影响哮喘小鼠BALF细胞因子的水平 |
| 四、rLZ-8调控哮喘小鼠肺组织mRNA表达 |
| 五、rLZ-8降低了哮喘小鼠脾脏Th17的比例并增加了Treg细胞的比例 |
| 六、rLZ-8抑制哮喘小鼠STAT3信号通路活化 |
| 第四节 讨论 |
| 一、OVA诱导建立小鼠哮喘模型 |
| 二、rLZ-8对Th17/Treg细胞平衡的调控作用 |
| 三、rLZ-8对肺组织相关转录因子的调控作用 |
| 四、rLZ-8调控哮喘小鼠气道炎症因子的释放 |
| 五、rLZ-8抑制哮喘小鼠肺部DC成熟 |
| 六、rLZ-8抑制小鼠肺组织STAT3信号通路 |
| 第三章 RLZ-8干预哮喘气道炎症的免疫机制体外研究 |
| 第一节 实验材料及试剂 |
| 一、实验动物 |
| 二、实验仪器 |
| 三、实验试剂 |
| 第二节 实验方法 |
| 一、主要试剂的配制 |
| 二、小鼠脾脏CD3~+T细胞的提取 |
| 三、Annexin/pi法进行细胞凋亡实验 |
| 四、ELISA检测CD3~+T细胞培养上清中细胞因子分泌 |
| 五、rLZ-8对体外CD4~+IL-17A~+ Th17细胞分化影响的体外研究 |
| 六、小鼠脾脏CD4~+CD25~+ Treg细胞的提取 |
| 七、CSFE检测rLZ-8对CD4~+CD25~+ Treg细胞的体外增殖作用 |
| 八、小鼠脾脏CD4~+CD25~- T细胞的提取 |
| 九、流式细胞术检测rLZ-8对Treg的分化影响 |
| 十、Western Blotting检测CD3~+T淋巴细胞中STAT3的表达 |
| 十一、统计方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 一、rLZ-8对CD3~+T细胞毒性 |
| 二、rLZ-8对CD3~+T细胞细胞因子水平的影响 |
| 三、rLZ-8抑制Th17的体外活化和增殖 |
| 四、rLZ-8促进CD4~+Foxp3~+Treg体外分化 |
| 五、rLZ-8抑制STAT3信号通路在体外的活化 |
| 第四节 讨论 |
| 一、rLZ-8直接从细胞层面和转录因子的表达作用于Th17/Treg细胞平衡 |
| 二、rLZ-8对体外培养T细胞细胞因子释放的影响 |
| 三、rLZ-8抑制体外培养T细胞STAT3信号通路 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（7）双歧杆菌缓解特应性皮炎的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 特应性皮炎概述 |
| 1.1.1 特应性皮炎成因及发病机制 |
| 1.1.2 特应性皮炎的治疗措施 |
| 1.2 特应性皮炎与肠道微生态的联系 |
| 1.2.1 肠道微生态与人体疾病 |
| 1.2.2 特应性皮炎患者肠道菌群的特征 |
| 1.2.3 益生菌对特应性皮炎的缓解作用 |
| 1.3 双歧杆菌缓解特应性皮炎潜在的作用机制 |
| 1.3.1 双歧杆菌调节机体肠道菌群的多样性和组成 |
| 1.3.2 双歧杆菌调节机体肠道菌群的代谢活动 |
| 1.3.3 双歧杆菌调节机体的免疫应答 |
| 1.4 论文立题背景及依据 |
| 1.5 论文的主要研究内容 |
| 第二章 双歧杆菌对特应性皮炎的缓解作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与设备 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 实验仪器及设备 |
| 2.2.3 实验动物及饲料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 双歧杆菌菌液制备 |
| 2.3.2 动物实验设计 |
| 2.3.3 小鼠耳朵肿胀程度测定 |
| 2.3.4 小鼠背部病理症状评价 |
| 2.3.5 小鼠背部皮肤肥大细胞浸润 |
| 2.3.6 免疫炎症因子的测定 |
| 2.3.7 数据统计及分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 双歧杆菌对特应性皮炎小鼠耳朵肿胀程度的影响 |
| 2.4.2 双歧杆菌对特应性皮炎小鼠背部皮肤病理症状的影响 |
| 2.4.3 双歧杆菌对特应性皮炎小鼠背部皮肤肥大细胞炎症浸润的影响 |
| 2.4.4 双歧杆菌对特应性皮炎小鼠免疫炎症指标的影响 |
| 2.4.5 双歧杆菌缓解特应性皮炎作用能力分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 双歧杆菌对特应性皮炎小鼠肠道菌群的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.2.2 主要设备 |
| 3.2.3 实验动物及饲料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 双歧杆菌菌株 |
| 3.3.2 实验动物设计 |
| 3.3.3 小鼠粪便收集 |
| 3.3.4 小鼠肠道菌群测定 |
| 3.3.5 数据统计及分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 双歧杆菌对特应性小鼠肠道菌群多样性的影响 |
| 3.4.2 双歧杆菌对特应性皮炎小鼠肠道菌群组成的影响 |
| 3.4.3 双歧杆菌对特应性皮炎小鼠特定差异菌群的影响 |
| 3.4.4 双歧杆菌对特应性皮炎小鼠肠道菌群基因组功能组成的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 长双歧杆菌CCFM1029缓解特应性皮炎的作用机制解析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 实验仪器及设备 |
| 4.2.3 实验动物及饲料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 长双歧杆菌CCFM1029活菌和死菌菌液制备 |
| 4.3.2 动物实验设计 |
| 4.3.3 小鼠耳朵厚度测定 |
| 4.3.4 小鼠皮肤病理H&E染色 |
| 4.3.5 小鼠脾脏Treg细胞比例测定以及免疫炎症因子测定 |
| 4.3.6 血清皮肤组织吲哚3-甲醛含量与皮肤芳香烃受体表达测定 |
| 4.3.7 统计分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 长双歧杆菌CCFM1029活菌/死菌对特应性皮炎小鼠的影响 |
| 4.4.2 宏基因组测序探究长双歧杆菌CCFM1029对肠道菌群组成的影响 |
| 4.4.3 宏基因组测序揭示长双歧杆菌CCFM1029对肠道菌群功能通路的影响 |
| 4.4.4 LC-MS代谢组学揭示肠道菌群代谢产物的变化 |
| 4.4.5 差异代谢产物KEGG通路富集 |
| 4.4.6 长双歧杆菌CCFM1029缓解特应性皮炎作用机制探讨 |
| 4.4.7 长双歧杆菌CCFM1029通过芳香烃受体缓解小鼠特应性皮炎症状 |
| 4.4.8 长双歧杆菌CCFM1029提高吲哚3-甲醛和AhR的表达 |
| 4.4.9 长双歧杆菌CCFM1029抑制小鼠皮肤组织炎症因子的产生 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 长双歧杆菌CCFM1029对特应性皮炎患者的影响 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 材料与试剂 |
| 5.2.2 实验仪器与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 实验设计 |
| 5.3.2 患者招募 |
| 5.3.3 患者入组标准与排除标准 |
| 5.3.4 实验分组 |
| 5.3.5 特应性皮炎患者基础特征测定 |
| 5.3.6 长双歧杆菌CCFM1029缓解作用评价 |
| 5.3.7 血清炎症免疫指标测定 |
| 5.3.8 粪便样本收集及测序 |
| 5.3.9 数据统计及分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 长双歧杆菌CCFM1029降低特应性皮炎患者SCORAD评分 |
| 5.4.2 长双歧杆菌CCFM1029降低特应性皮炎患者DLQI评分 |
| 5.4.3 长双歧杆菌CCFM1029对特应性皮炎患者血清炎症因子的影响 |
| 5.4.4 长双歧杆菌CCFM1029调节特应性皮炎患者肠道菌群的多样性 |
| 5.4.5 长双歧杆菌CCFM1029调节特应性皮炎患者肠道菌群的组成 |
| 5.4.6 长双歧杆菌CCFM1029改变特应性皮炎患者肠道菌群的差异菌属 |
| 5.4.7 长双歧杆菌CCFM1029调节特应性皮炎患者肠道菌群基因的功能组成 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 一、主要结论 |
| 二、展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ:作者在攻读博士期间取得的成果 |
| 附录Ⅱ |
| 附录Ⅲ |
（8）以小胶质细胞自身免疫炎症调节为切入点探讨DHA在EAE模型小鼠中的药效及分子机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表(Abbreviation) |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 DHA治疗EAE模型小鼠的药效学研究 |
| 第一节 DHA在EAE模型中具有机能改善和神经保护的作用 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 第二节 DHA对EAE小鼠中枢神经系统炎症进展的影响及药效评价 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第二章 DHA在EAE模型中对中枢神经系统自身免疫炎症反应的系统性药理学研究 |
| 第一节 基于10X Genomics技术对DHA调控EAE小鼠中枢神经系统单个核细胞亚群分析 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第二节 基于免疫共刺激分子探索DHA对“巨噬细胞-T细胞”相互作用单元所产生的影响的研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第三节 DHA能够通过抑制CCL5来抑制炎症细胞趋化募集 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第四节 DHA能够增强小胶质细胞的吞噬能力 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第三章 聚焦“小胶质细胞功能调节”开展DHA抑制中枢神经系统炎症的分子机制研究 |
| 第一节 基于小胶质细胞的功能体系的DHA靶向AXL的作用机制研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第二节 DHA基于AXL调控自身免疫炎症的分子通路研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第三节 DHA对炎症“促-抑”平衡调控的病理状态特异性研究的初探 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 结语与展望 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 查新报告 |
（9）猪内脂素重组蛋白的优化及其在断奶仔猪免疫炎症反应中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 立题背景 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 内脂素的研究进展 |
| 1.2.1.1 内脂素的起源和分子结构特征 |
| 1.2.1.2 内脂素的分布情况 |
| 1.2.1.3 内脂素对炎症反应的影响 |
| 1.2.1.4 内脂素对细胞增殖和凋亡的影响 |
| 1.2.2 免疫应激的研究进展 |
| 1.2.2.1 免疫应激的作用机制 |
| 1.2.2.2 免疫应激模型的构建 |
| 1.2.2.3 免疫应激对机体的影响 |
| 1.2.3 LPS诱发免疫应激的作用机制 |
| 1.2.4 内脂素与免疫应激之间的关系 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 第一部分 猪内脂素重组蛋白表达的优化及生物活性验证 |
| 1 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.2 主要仪器与试剂 |
| 1.1.3 主要溶液配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 Visfatin基因的扩增 |
| 1.2.2 Visfatin基因克隆菌株的构建 |
| 1.2.3 重组表达质粒的构建 |
| 1.2.4 猪内脂素重组蛋白的表达、纯化与鉴定 |
| 1.2.5 猪内脂素重组蛋白中内毒素的去除 |
| 1.2.6 猪内脂素重组蛋白生物活性验证 |
| 1.2.7 猪内脂素重组蛋白多克隆抗体的制备和验证 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪Visfatin基因的扩增 |
| 2.1.1 |
| 2.1.2 核酸序列分析 |
| 2.1.3 氨基酸序列分析 |
| 2.1.4 重组表达质粒的构建 |
| 2.2 猪内脂素重组蛋白表达条件的优化 |
| 2.2.1 猪内脂素重组蛋白小量表达条件优化 |
| 2.2.2 猪内脂素重组蛋白的大量表达 |
| 2.3 猪内脂素重组蛋白的内毒素去除效果检测 |
| 2.4 猪内脂素重组蛋白生物活性验证 |
| 2.4.1 猪内脂素重组蛋白对Raw264.7细胞活力的影响 |
| 2.4.2 qRT-PCR和 ELISA法检测炎症因子 |
| 2.5 猪内脂素重组蛋白多克隆抗体的验证 |
| 3 讨论 |
| 3.1 猪内脂素重组蛋白的原核表达 |
| 3.2 猪内脂素重组蛋白纯化条件的优化 |
| 3.3 猪内脂素重组蛋白内毒素的去除及活性验证 |
| 4 结论 |
| 第二部分 猪内脂素重组蛋白在断奶仔猪免疫炎症反应中的作用 |
| 1 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验动物及处理 |
| 1.1.2 主要仪器与设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要试剂的配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 样品采集和处理 |
| 1.2.2 脾脏指数测定 |
| 1.2.3 不同处理组脾内炎性细胞因子检测 |
| 1.2.4 抗氧化指标检测 |
| 1.2.5 石蜡切片的制作 |
| 1.2.6 免疫组化 |
| 1.2.7 细胞凋亡检测(TUNNEL法) |
| 1.2.8 细胞凋亡因子检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 LPS组猪临床表征和病理变化 |
| 2.2 不同处理组猪脾脏指标的变化 |
| 2.3 脾脏内炎症因子表达的变化 |
| 2.4 内脂素对断奶仔猪抗氧化功能的影响 |
| 2.5 内脂素对断奶仔猪外周免疫器官细胞增殖的影响 |
| 2.5.1 内脂素对脾脏内细胞增殖的影响 |
| 2.5.2 内脂素对肠系膜淋巴结内细胞增殖的影响 |
| 2.6 内脂素对断奶仔猪外周免疫器官细胞凋亡的影响 |
| 2.6.1 内脂素对脾脏内细胞凋亡的影响 |
| 2.6.2 内脂素对肠系膜淋巴结内细胞凋亡的影响 |
| 2.6.3 内脂素对脾内凋亡因子的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 内脂素对断奶仔猪免疫应激脾脏损伤的影响 |
| 3.2 内脂素对断奶仔猪免疫应激抗氧化功能的影响 |
| 3.3 内脂素对断奶仔脾脏和肠系膜淋巴结内细胞增殖和凋亡的影响 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 个人简介 |
| 附录2 论文发表情况 |
| 致谢 |
（10）蝎黄解痉治哮颗粒影响NF-κB和HIF-1α信号传导通路治疗哮喘的调控机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 文献综述一 支气管哮喘的中西医研究概况 |
| 1 病名与症状的研究 |
| 2 病因病机 |
| 3 古今医家论治支气管哮喘 |
| 4 支气管哮喘发病机制的中医研究 |
| 5 现代医学对于支气管哮喘的研究 |
| 6 小结 |
| 文献综述二 哮喘模型动物的选择与建立 |
| 1 实验动物的选择 |
| 2 小鼠哮喘模型的致敏剂与剂量 |
| 3 不同病理改变的哮喘模型小鼠 |
| 4 特殊种类哮喘的鼠类模型 |
| 5 细胞模型 |
| 6 小结 |
| 实验研究 |
| 第一章 蝎黄解痉治哮颗粒通过抑制MAPKs/NF-κB通路改善急性哮喘气道炎症 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 蝎黄解痉治哮颗粒通过抑制MAPKs和AKT/HIF-1α通路改善哮喘气道重塑 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间科研成果 |
| 个人简历 |
四、糖皮质激素在免疫-炎症中作用机制的研究进展（论文参考文献）
- [1]肺脾为核心脏腑整体辨证支气管哮喘慢性持续期免疫调控研究[D]. 司东旭. 北京中医药大学, 2021(01)
- [2]基于AMPK/SIRT1/PGC-1α通路研究醒脾解郁方对抑郁大鼠海马神经元突触重塑的影响[D]. 任非非. 北京中医药大学, 2021(01)
- [3]m6A修饰在系统性红斑狼疮发病中的作用研究[D]. 吴俊. 安徽医科大学, 2021(01)
- [4]羟氯喹对IgA肾病患者残余蛋白尿的疗效研究[D]. 刘密迦. 西南医科大学, 2021(01)
- [5]淮莲饮治疗特应性皮炎的临床回顾分析及对特应性皮炎样小鼠模型的免疫干预实验研究[D]. 肖卫棉. 广州中医药大学, 2020(09)
- [6]重组灵芝免疫调节蛋白在支气管哮喘中的作用及免疫调节机制研究[D]. 林成创. 广州中医药大学, 2020(06)
- [7]双歧杆菌缓解特应性皮炎的作用及机制研究[D]. 方志锋. 江南大学, 2020(01)
- [8]以小胶质细胞自身免疫炎症调节为切入点探讨DHA在EAE模型小鼠中的药效及分子机制[D]. 冉庆森. 中国中医科学院, 2020(01)
- [9]猪内脂素重组蛋白的优化及其在断奶仔猪免疫炎症反应中的作用[D]. 李慧珍. 华中农业大学, 2020
- [10]蝎黄解痉治哮颗粒影响NF-κB和HIF-1α信号传导通路治疗哮喘的调控机制[D]. 洪天一. 长春中医药大学, 2020(01)