活性污泥中几丁质酶基因的系统发育分布及克隆表达

论文摘要

几丁质是地球上含量仅次于纤维素的天然多糖,其降解产物几丁寡糖不仅功能丰富且由于分子量小、溶解性增强更便于利用。生物降解几丁质是一种条件温和且便于控制产物的获得几丁寡糖的方式,其中涉及的关键酶为几丁质酶。目前已报道许多微生物能够产生几丁质酶,它们在细菌和真菌中都存在。传统上获得新几丁质酶的方法是通过条件培养基对微生物进行筛选,而后利用纯培养物进行酶的生产。然而,由于目前的分离和培养方法无法有效培养自然环境中大部分的微生物,因此传统方法严重限制了微生物中几丁质酶资源的利用。为解除培养法对开发几丁质酶的限制,本研究采用基于序列的宏基因组学方法结合异源蛋白表达对活性污泥中的几丁质酶基因进行鉴定及功能验证。研究结果如下:1)基于公开数据库中基因组核糖体蛋白序列串联建树及基因功能注释结果,74个细菌门中29个预测有几丁质酶基因,具有几丁质降解功能的微生物数量超过预期。2)根据实际污水厂来源的活性污泥宏基因组分析结果表明,活性污泥中存在大量潜在几丁质酶基因(56个),并且宏转录组结果表明其中35个原位表达。3)综合几丁质酶基因的转录活性和系统发生关系,来源菌的丰度变化和分类地位多方面因素选择基因进行克隆和异源蛋白表达。10个表达成功的重组蛋白中有9个具有几丁质降解能力,表明本研究采用的功能基因筛选方法成效显著,具有借鉴意义。4)首次发现亚硝化单胞菌属中广泛存在几丁质酶基因,但其模式菌株Nitrosomonas europaea Winogradsky 1892无法以几丁质作为唯一氮源生长,指示几丁质酶对于该菌的功能意义可能不在于能量摄取,其具体功能需要进一步研究。综上所述,本研究阐明了活性污泥中几丁质酶基因的分布情况,获得了多种新几丁质酶,验证了基于序列的宏基因组学方法结合异源蛋白表达开发活性污泥中几丁质酶的可行性,为其他功能基因的探究提供了方法借鉴。

论文目录

摘要

Abstract

第一章引言

1.1 几丁质与几丁质寡糖

1.2 几丁质酶的研究概况

1.2.1 几丁质酶的来源

1.2.2 几丁质酶的分类

1.2.3 几丁质酶的性质

1.2.4 传统几丁质酶研究方法

1.3 宏基因组学研究方法

1.3.1 功能宏基因组学

1.3.2 基于序列的宏基因组学研究方法

1.4 研究内容与意义

第二章材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 活性污泥样品

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要设备

2.1.4 本研究使用的其他数据

2.2 实验方法

2.2.1 几丁质酶基因在微生物中的分布

2.2.2 几丁质降解菌的富集与诱导培养实验

2.2.3 几丁质降解菌培养情况分析

2.2.4 集美污水厂活性污泥样品宏基因组及宏转录组数据分析

2.2.5 几丁质酶的异源表达

2.2.6 重组蛋白表达和分析

2.2.7 几丁质酶活性测定

2.2.8 几丁质酶基因在亚硝化单胞菌目中的分布

第三章结果与讨论

3.1 几丁质酶基因在微生物中的分布

3.2 几丁质降解菌的富集与诱导培养结果分析

3.2.1 16S rRNA基因V4区高通量测序分析

3.2.2 宏基因组测序结果分析

3.3 集美污水厂活性污泥样品宏基因组及宏转录组数据结果分析

3.4 来自富集诱导培养体系及集美污水厂的几丁质酶基因预测结果

3.5 几丁质酶的异源表达

3.5.1 从宏基因组中扩增几丁质酶基因

3.5.2 几丁质酶基因工程表达菌的构建

3.5.3 几丁质酶基因工程菌表达重组蛋白

3.6 几丁质酶活性检测结果

3.6.1 几丁质酶活性定性检测

3.6.2 酸碱度对几丁质酶活性的影响

3.7 几丁质不可作为唯一氮源支持亚硝化单胞菌的生长

3.7.1 几丁质酶基因在亚硝化单胞菌科中的分布情况

3.7.2 Nitrosomonas europaea Winogradsky 1892几丁质利用情况分析

第四章结论

第五章创新点、不足与展望

5.1 创新点

5.2 不足之处

5.3 展望

附录

参考文献

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 梁怡婷

导师: 郭峰

关键词: 活性污泥,几丁质酶,宏基因组

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,环境科学与资源利用

单位: 厦门大学

分类号: Q78;X703

总页数: 103

文件大小: 7334K

下载量: 22

活性污泥中几丁质酶基因的系统发育分布及克隆表达

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢