PtrWOX13在杨树次生细胞壁形成中的功能分析

论文摘要

WOX是植物特有的转录因子家族,其家族中含有60个氨基酸组成“螺旋-环-螺旋-转角-螺旋”的同源异型域（Homeobox domain,HD）,也是与特定的DNA序列结合域。拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtWOX13属WOX基因家族三大分支中第三分枝基因,主要参与干细胞形成、激活细胞生长、促进果实发育过程中胚座的形成等生物学过程。前期生物信息学分析发现,AtWOX13参与了拟南芥次生细胞壁（secondary cell wall,SCW）相关基因的调控。为了证实上述分析结论,本项研究从毛果杨（Populus grichocarpa）中克隆到AtWOX13m的同源基因Potri.005G101800.1,将其命名为PtrWOX13,并对其在杨树SWC形成中的生物学功能进行了初步研究,主要结论如下:1.毛果杨植物不同组织表达特异性分析发现,PtrWOX13可在多个组织中表达,但在过渡木质部、次生木质部和次生韧皮部等SCW在形成旺盛的组织中表达量相对较高。PtrWOX13启动子驱动的GUS瞬时侵染烟草GUS活性染色分析发现,转基因烟草的根部、叶脉处等SCW形成旺盛的部位染色较深。上述结果初步表明,PtrWOX13可能参与了杨树SCW的形成。2.从毛果杨木质部组织中克隆出PtrWOX13基因747bp全长CDs序列,其编码248个氨基酸,且在102-169氨基酸序列处,含有长度为67个氨基酸的WOX家族特有的“螺旋-环-螺旋-转角-螺旋”保守结构域。亚细胞定位研究表明,PtrWOX13定位于细胞核中。此外,转录因子的自激活活性验证结果表明,PtrWOX13具有转录自激活活性。上述结果表明,PtrWOX13是一个定位于细胞核且具有转录自激活性转录因子。3.酵母单杂实验表明,PtrWOX13能够与生物信息学预测的下游调控靶基因C4H、PAL、4CL3及CoAOMT及启动子中高频率元件BoxI、Wbox和TCA特异性结合,初步表明PtrWOX13可能对上述基因具有调控作用。4.过表达和显性抑制PtrWOX13转基因毛果杨生长性状分析表明,过表达转基因杨树株高增长4.27%、1.15%;茎节数增长10.97%、7.3%;地径有明显4.11%、3.27%。显性抑制转基因杨树植株株高降低7.40%、4.44%;茎节数有明显降低5.49%、1.82%,而地径有明显增长3.41%、3.89%。5.过表达和显性抑制PtrWOX13转基因杨树茎部木质素组织化学染色分析表明,过表达转基因杨树茎部木质素染色深度与对照无明显差异,表明其木质素含量无显著变化;显性抑制转基因杨树木质素染色强烈、染色面积扩大,且髓心有变小的趋势,表明其木质素含量和木质化程度均呈现增加趋势。纤维素染色研究表明,过表达转基因杨树的颜色加深,表明纤维素含量增加;显性抑制转基因杨树染色面积与强度均不同程度降低,表明其纤维素含量降低。半纤维素染色结果表明,过表达与显性抑制转基因杨树染色较深,表明2种转基因株系半纤维素含量均呈增加趋势。茎部细胞壁组分含量测定结果表明,过表达转基因株系木质素含量降低18.51%、纤维素含量增加2.77%、半纤维素含量增加3.97%;显性抑制转基因株系木质素含量增加10.91%、纤维素含量降低1.92%、半纤维素含量增加2%。纤维性状测定表明;过表达转基因株系纤维长度与宽度分别降低11.34%和11.15%,显性抑制转基因株系纤维长度与宽度分别降低20.53%和30.53%。扫描电镜观测表明,过表达与显性抑制转基因株系木质部纤维素SCW厚度分别增加了 18.97%和13.1%,韧皮部纤维素SCW厚度增加极显著,形成了类似“G-lay”结构。6.过表达和显性抑制PtrWOX13转基因杨树定量PCR分析表明,过表达转基因株系CEES4、C7和CEAS8表达量显著上升,IX9显著上升、IRXlO显著下降,PAL1、PAL4、HCT、CSE2、G4H2、CAD1、CCR2和F5H表达量显著增加,而CCoAOMT显著降低;显著抑制转基因株系的CESA4、CESA7和CEAS8表达显著下降,IX9显著上升、IRX1O显著下降,PAL1、PAL4、HCT、CSE2、C4H2、CAD1和CCR2显著上升,CcOaOMT和F5H显著降低。上述基因的表达变化与组织化学染色结果与细胞壁组分含量变化基本吻合。上述结果表明,PtrWOX13通过直接或间接调控上述基因的表达参与杨树SCW的形成。

论文目录

摘要

Abstract

1 绪论

1.1 引言

1.2 植物次生细胞壁的研究进展

1.2.1 植物次生细胞壁的生物合成

1.2.2 SCW形成的转录调控机制

1.3 WOX基因家族研究概况

1.3.1 WOX转录因子结构特点

1.3.2 WOX转录因子生物学功能

1.3.3 WOX13可能参与SCW形成

1.4 研究的目的与意义

1.5 技术路线

2 PtrWOX13的组织表达特性分析与基因克隆

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌种与载体

2.1.3 试剂和药品

2.1.4 主要仪器设备

2.1.5 主要试剂及培养基配制

2.1.6 引物合成及测序

2.2 实验方法

2.2.1 PtrWOX13家族基因组织表达模式分析

2.2.2 PtrWOX13启动子的克隆

PtrWO13-GUS载体构建'> 2.2.3 p1301-Pro_PtrWO13-GUS载体构建

2.2.4 PtrWOX13启动子的GUS瞬时表达分析

TM-Blunt-PtrWOX13载体构建'> 2.2.5 PtrWOX13的克隆及pEASY^TM-Blunt-PtrWOX13载体构建

2.2.6 PtrWOX13生物信息学分析

2.3 结果与分析

2.3.1 PtrWOX13家族基因组织表达模式分析

2.3.2 PtrWOX13启动子的克隆

2.3.3 PtrWOX13启动子GUS瞬时表达分析

2.3.4 毛果杨次生木质部RNA提取

TM-Blunt-PtrWOX13载体构建'> 2.3.5 PtrWOX13的克隆与pEASY^TM-Blunt-PtrWOX13载体构建

2.3.6 PtrWOX13的生物信息学分析

2.4 本章小结

3 PtrWOX13的克隆与转录特性分析

3.1 实验材料

3.1.1 菌株和载体

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器设备

3.1.4 试剂及培养基配制

3.2 实验方法

3.2.1 PtrWOX13的亚细胞定位

3.2.2 PtrWOX13转录激活活性分析

3.2.3 PtrWOX13结合元件分析

3.3 结果与分析

3.3.1 PtrWOX13亚细胞定位

3.3.2 pGBKT7-PtrWOX13的载体构建

3.3.3 PtrWOX13的转录激活活性检测

3.3.4 pGADT7-Rec2-PtrWOX13效应载体的构建

3.3.5 报告载体pHIS2-元件的构建

3.3.6 PtrWOX13结合顺式作用元件分析

3.4 本章小结

4 PtrWOX13表达载体构建与遗传转化

4.1 实验材料

4.1.1 植物材料

4.1.2 菌种与载体

4.1.3 试剂和药品

4.1.4 主要仪器设备

4.1.5 主要培养基及试剂配制

4.2 实验方法

4.2.1 转基因载体的构建

4.2.2 ProkII-PtrWOX13转基因杨树的获得

4.2.3 ProkII-PtrWOX13转基因杨树的鉴定

4.3 结果与分析

4.3.1 转基因载体的构建

4.3.2 ProkII-PtrWOX13转基因杨树的鉴定

4.4 本章小结

5 PtrWOX13转基因杨树的表型与次生性状分析

5.1 实验材料

5.1.1 主要试剂

5.1.2 主要仪器设备

5.2 实验方法

5.2.1 PtrWOX13转基因杨树表型及营养生长观测

5.2.2 PtrWOX13转基因杨树次生相关性状测定

5.2.3 PtrWOX13转基因杨树SWC形成与纤维性状相关基因的表达分析

5.3 结果与分析

5.3.1 PtrWOX13转基因杨树表型及营养生长观测

5.3.2 PtrWOX13转基因杨树次生相关性状测定

5.3.3 PtrWOX13转基因杨树次生壁形成与纤维性状相关基因表达分析

5.4 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王爽

导师: 魏志刚

关键词: 次生细胞壁,过表达,毛果杨

来源: 东北林业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,林业

单位: 东北林业大学

基金: 国家自然科学基金(31770640)

分类号: Q943.2;S792.11

DOI: 10.27009/d.cnki.gdblu.2019.000427

总页数: 80

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