王小强王永峰姜昆郭一凡赵斌
山西医科大学第二医院030000
摘要：目的研制抗感染纳米羟基磷灰石（nano-HA）药物缓释微球，为骨髓炎的治疗提供一新型的局部药物缓释系统（DDS）。方法采用nano-HA为载药核心载体，外包裹PHBV/PEG，承载硫酸庆大霉素（GM）制成nano-HA－PHBV/PEG－GM缓释微球，用X射线衍射法、FT-IR光谱法及电镜对微球的表征进行分析和观察。结果：实验中制备出nano-HA、nano-HA-GM以及nano-HA－PHBV/PEG－GM等产物。结论nano-HA－PHBV/PEG－GM药物缓释微球以纳米材料为载药核心，PHBV/PEG膜包裹纳米级nano-HA－GM形成微球，纳米HA有很大的表面积，对药物有较强承载能力，这些结构的特点保证了nano-HA载药和释药的稳定性。
关键词：纳米羟基磷灰石；聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物；聚乙二醇；硫酸庆大霉素；局部药物释放系统
局部药物缓释系统（drugdeliverysystem，DDS）因其在局部能达到高的药物浓度，同时血药浓度低，不造成毒副作用，为治疗骨髓炎提供了一条有效的治疗途径。本研究采用具有生物活性的纳米羟基磷灰石（nano-HA）为载药核心载体，外包裹生物相容性好且可降解聚羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物/聚乙二醇（PHBV/PEG），承载硫酸庆大霉素（GM）制成nano-HA-PHBV/PEG-GM缓释微球，研究其体外释药特性，旨在为骨髓炎的治疗提供一新型的DDS。
1材料与方法
1.1材料：
1.1.1主要试剂
PHBV分子量为23.5kDa，购自英国ICI
PEG分子量为19，000，购自上海润洁公司
庆大霉素标准品购自中国药品生物制品检定所，批号30326-200314。
余为同产分析纯试剂。
1.1.2主要实验仪器
TSM-1型电磁搅拌器：上海实验仪器设备厂
AEG-120电子分析电平：日本岛津SHIMADZN
FTS冷冻干燥机：美国FTS公司
TDL-50B台式高速离心机：上海
XRD衍射仪：飞利普PW18v5/20
JEOLTEM2010高分辨透射电子显微镜：日本
HitachiS-520扫描电子显微镜：日本
FT-IR光谱仪：Nicolet360型红外光谱仪
1.2方法：
1.2.1微球的研制
1.2.1.1nano-HA的制备[1]
采用乳化合成法：首先，将140g乙醇与60g庚烷制成混合液，称取12.435g十二烷基癸胺（DDA）加入并溶解于混合液中，然后加入500mlCa（NO3）2液体（0.3576mol/l，pH11.5）剧烈搅拌，再快速加入500ml（NH4）2HPO4（0.1585molpH8.5），在25℃温度下持续搅拌24小时，然后离心，过滤，水洗，收集固体干燥，最后在500℃高温下烧结28小时制成白色粉末状nano-HA。
1.2.1.2nano-HA－GM的制备
将质量比为2：1（GM：nano-HA）的庆大霉素药物溶于水，与nano-HA混合，在超声波中分散20min，然后室温下磁力搅拌72h。停止搅拌后，将药物和nano-HA的混合液冻干，得白色冻干粉。
1.2.1.3nano-HA－PHBV/PEG－GM缓释微球的制备
将白色冻干粉nano-HA－GM分散于PHBV/PEG（PEG20000与PHBV的质量比为2：1）的二氯甲烷溶液中，冻干粉与PHBV/PEG的质量比为1：4。然后迅速倒入到外水相中，其中含0.4%（w/v）的甲基纤维素。油相与水相的体积比为1：10，剧烈搅拌直到二氯甲烷挥发完全。然后离心，过滤，水洗，收集固体冷冻干燥，制备出白色粉末状nano-HA－PHBV/PEG－GM缓释微球。环氧乙烷消毒灭菌备用。
1.2.2微球的表征
1.2.2.1X射线衍射法对nano-HA晶粒度进行分析。XRD将X射线加在材料上，通过不同晶面发生衍射现象的强度来绘制，可以得到材料晶体结构和粒度方面的信息。
1.2.2.2FT-IR光谱法对微球的材料组成进行分析。将真空干燥后的粉末试样，以KBr压片，进行测试（400～4000cm-1）。
1.2.2.3电镜观察将少量nano-HA、nano-HA－GM粉末和nano-HA－PHBV/PEG－GM微球加入有适量的无水乙醇溶液中，超声振荡10min，然后将此悬浮液移到带微栅膜的铜网上，待乙醇完全挥发后，用JEOLTEM2010高分辨透射电子显微镜进行分析。nano-HA－PHBV/PEG－GM微球大小和表面形态电镜观察，微球铺在铝箔的粘性表面，微球的表面涂金后，即可在扫描电镜下观察微球形态。
2结果
2.1nano-HA的X射线衍射图
样品的衍射峰都与HA的标准图谱相符。从图1-1中可以看出，nano-HA的晶面如（002），（211），（112），（300），（202），（310）等均已出现特征衍射峰。其中（211），（300）晶面的衍射峰为其主要衍射峰，证明制备的产物是nano-HA，而且XRD图中无其他相的衍射峰，说明产物比较单一。nano-HA粉末的XRD谱图在衍射角2θ约32°处为其特征峰，根据Scherrer方程可计算出HA的晶粒度：L（hkl）=kλβ1/2×12cosθ。式中，k为常数0.89，λ为X射线波长，θ为布拉格衍射角，β1/2是半峰高处的宽度。即所得nano-HA沉淀的晶粒度在20-60nm间[2]。
2.2FT-IR光谱：
图1-2中显示nano-HA与载药后nano-HA－GM的FT-IR光谱曲线。HA和GM的分子式分别为Ca10（PO4）6（OH）2、C21H43N5O7。在nano-HA光谱曲线中，在3570cm-1and630cm-1处出现吸收峰显示出HA分子中O-H键的振动峰，在565cm-1、602cm-1、962cm-1及1035cm-1处出现吸收峰则显示出PO4-3离子根的振动峰[3]。在nano-HA－GM光谱曲线中，这些吸收峰消失或者移至低频区，而且邻近的波峰变宽。对FT-IR光谱进行分析，nano-HA－GM的曲线的变化可能与nano-HA与GM之间存在氢键有关。图1-2中显示为nano-HA－GM，PHBV/PEG，nano-HA－PHBV/PEG－GM的FT-IR光谱曲线。其中PHBV/PEG与nano-HA－PHBV/PEG－GM曲线非常相近，说明nano-HA－PHBV/PEG－GM微球的成分中PHBV/PEG占主要部分。
2.3电镜观察结果
在透射电镜下可见：nano-HA为纳米相晶体颗粒，平均尺寸小于20~60nm（如图1-3），nano-HA－GM由于晶体自然凝聚以及庆大药物颗粒叠加在一起成为所谓的“二次颗粒”，其大小在100～300nm左右，庆大药物颗粒如串珠状吸附于nano-HA晶体表面，nano-HA－PHBV/PEG－GM微球透射结构为PHBV/PEG膜包裹纳米级nano-HA－GM药粒形成微球（如图1-3）。扫描电镜观察：制备的微球呈白色，形态大小均匀规整，微球表面形态一致，表面为多孔呈皱缩结构（如图1-4）。
图1-4nano-HA－PHBV/PEG－GM微球扫描电镜下表面形态观察1000×
Fig.1-4photographofthemorphologyofnano-HAunderscanningelectronmicroscope1000×
3讨论
DDS传统的载体材料主要可分为聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、无机盐材料、骨移植材料等。PMMA是最早被用作局部缓释药物的载体，曾被广泛的应用，在体内不降解，需二次取出，限制了其应用范围。目前应用的无机盐载体主要是生物陶瓷，常用的有羟基磷灰石陶瓷（HA），磷酸三钙（TCP）等。生物陶瓷主要的优点是它们的结构和骨相似，高的组织相容性，缺点是硬度大，不易塑型为探寻新型的DDS载体材料，本研究研制了一种具有纳米材料为载药核心的缓释微球。微球（microsphere）、纳米球（nanosphere）技术是由上世纪末发展起来的新型给药技术。微球系指药物溶解或分散在辅料中形成的粒径为1～250um微小球状实体，而粒径在10～1000nm之间的通常称之为纳米球（又称毫微球、纳米粒）。药物以微球、纳米球的形式给药后，可使药物具有靶向和控释作用，改变了药物在体内的动力学，从而提高药物的生物利用度，降低毒副作用[4]。目前纳米球、微球药物缓释系统多为口服或静脉给药制剂，已经应用于肿瘤的靶向化疗等方面。nano-HA－PHBV/PEG－GM微球是nano-HA与PHBV/PEG为复合体材料，以治疗骨髓炎为目的研制的DDS。HA为天然骨组织中主要的无机盐成分，有成骨活性，而且纳米HA有很大的比表面，对药物有很强承载能力，而且通过对FT-IR光谱进行分析，可能HA与GM之间存在氢键，这些结构的特点保证了nano-HA载药和释药的稳定性。常用的多聚物有聚乳酸（PLA，PLLA）、聚乙二醇（PEG）、聚羟基丁酸酯－羟基戊酸酯共聚物（PHBV）等，它们有良好的组织相容性，可降解，具有弹性，降解速度通过改变多聚物的亲水性和晶体结构来控制，由于这些特点，如PHBV、PEG制成的DDS具有良好的药物缓释性能[5][6]。因此，该DDS符合治疗骨髓炎理想的DDS载体材料所应有的特点：良好的组织相容性、载药和缓释性能以及成骨活性[7]。
本研究所研制的载药微球以纳米材料为载药核心进行微米级DDS的组装，突破了传统DDS依靠材料多孔结构进行药物承载和缓释的模式。纳米科技在医学方面的应用已经取得了巨大的成就，纳米材料在载药方面有着其它材料无法比拟的优势，可以相信，将纳米材料应用到DDS中来，会开拓出广泛的研究前景，而有着纳米材料的DDS将会最终治愈骨髓炎。
参考文献：
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