钝齿棒杆菌氮素调控因子AmtR在L-精氨酸合成中的作用

论文摘要

L-精氨酸作为半必需氨基酸,具有多种生理功能,是一种重要的工业氨基酸,广泛应用于医药、食品、化工等行业。钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）常作为构建高产L-精氨酸的出发菌株。钝齿棒杆菌在发酵生产L-精氨酸的过程中需要供给大量的氮源,氮的吸收和同化效率对L-精氨酸的产生具有显著的影响。本研究利用C.crenatum SYPA5-5为出发菌株,敲除N转录调控因子（AmtR,amtR基因编码）,同时整合表达铵转运蛋白（AmtB,amtB基因编码）,串联谷氨酰胺合成酶（GS,glnA基因编码）和谷氨酸合成酶（GOGAT,gltB和glt D基因编码）,加强N的吸收和同化,显著提高L-精氨酸的产量。初探钝齿棒杆菌中氮代谢相关基因对L-精氨酸合成的影响,分别将铵转运蛋白AmtB、PII信号转导蛋白（GlnK,glnK基因编码）、双功能尿苷酰转移/去除酶（GlnD,glnD基因编码）以及N转录调控因子AmtR进行敲除和过表达。摇瓶发酵72 h后,敲除AmtR、过表达AmtB蛋白和敲除GlnK蛋白对提高L-精氨酸产量有积极作用,其中敲除AmtR,即Cc-ΔamtR菌株的L-精氨酸产量达到34 g·L-1,比原始菌株Cc5-5提高36%。转录组测序研究模式菌株谷氨酸棒杆菌13032和高产L-精氨酸钝齿棒杆菌SYPA5-5在氮源过量和氮源限量情况下敲除N转录调控因子AmtR后胞内氮代谢相关基因以及L-精氨酸合成相关基因的表达差异。结果表明钝齿棒杆菌在氮源过量环境下编码氨同化的关键酶基因gltB、gltD和glnA的表达倍数明显高于谷氨酸棒杆菌。说明钝齿棒杆菌产L-精氨酸的过程中消耗了大量的氮源,需要更强的氨同化作用将NH4+转化为谷氨酰胺,作为合成L-精氨酸的前体物质。在Cc-ΔamtR菌株中整合表达tacM启动子和铵转运蛋白增强NH4+吸收。重组钝齿棒杆菌Cc-amtB2摇瓶发酵72 h后L-精氨酸产量为38.2 g·L-1,生产强度0.531 g·L-1·h-1,比原始菌株Cc5-5提高52.8%,比Cc-ΔamtR菌株提高12.4%,另外,发酵过程中NH4+的利用率高于原始菌株Cc5-5。其次在Cc-ΔamtR菌株中对gltB、gltD、glnA基因以及谷氨酸脱氢酶GDH的编码基因gdh进行克隆表达。摇瓶发酵后过量表达glnA基因L-精氨酸产量最高。在Cc-ΔamtR菌株中对GlnD进行整合突变,减弱尿苷酰去除酶的活性,最终菌株Cc-glnDAA的L-精氨酸产量为36.2±1.2 g·L-1,生产强度为0.503 g·L-1·h-1,相比于原始菌株Cc5-5提高44.8%,比Cc-ΔamtR菌株提高6.5%。在Cc-amtB2菌株中串联表达gln A-gltB-gltD基因,将菌株Cc-amtB2/ABD进行5 L发酵罐研究,L-精氨酸产量为70.4 g·L-1,生产强度为0.978 g·L-1·h-1,糖酸比为0.393g·g-1葡萄糖,比原始菌株Cc5-5提高了56.4%。说明解除AmtR的抑制,同时加强胞内氨的吸收和同化作用,对L-精氨酸的形成具有积极作用。

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摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 L-精氨酸及其功能

1.1.1 L-精氨酸的结构及其性质

1.1.2 L-精氨酸的功能及应用

1.2 L-精氨酸生产菌株国内外研究概况

1.3 微生物中氮代谢概况

1.4 棒杆菌中氮代谢概况及与L-精氨酸的合成的关系

1.4.1 棒杆菌中氮源吸收利用途径及氮代谢调控

1.4.2 氮代谢调控对L-精氨酸合成的影响

1.5 棒杆菌合成L-精氨酸的代谢工程改造研究进展

1.6 论文研究内容

1.6.1 论文立题依据与研究意义

1.6.2 论文研究思路与主要内容

第二章材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌种与质粒

2.1.2 引物

2.2 主要实验试剂和仪器

2.2.1 主要试剂

2.2.2 相关试剂的配置

2.2.3 主要仪器

2.3 微生物培养条件

2.4 实验方法

2.4.1 大肠杆菌感受态的制备

2.4.2 大肠杆菌质粒抽提

2.4.3 大肠杆菌化学转化法

2.4.4 基因组的提取

2.4.5 同源重组敲除技术

2.4.6 表达质粒的构建

2.4.7 重组钝齿棒杆菌的构建

2.4.8 重组菌的诱导表达

2.4.9 重组菌的酶活检测

2.4.10 转录组实验

2.4.11 串联表达

2.4.12 整合突变

+的浓度'> 2.4.13 离子色谱检测NH4⁺的浓度

2.4.14 L-精氨酸的检测方法

第三章结果与讨论

3.1 钝齿棒杆菌中氮代谢相关基因对L-精氨酸合成的影响

3.1.1 敲除和过表达全局氮转录调控因子AmtR

3.1.2 敲除和过表达铵转运蛋白AmtB

3.1.3 敲除和过表达PII信号转导蛋白GlnK

3.1.4 敲除和过表达双功能尿苷酰转移/去除酶GlnD

3.2 钝齿棒杆菌Cc-ΔamtR的转录组研究

3.2.1 转录组实验条件的设置

3.2.2 氮代谢相关基因和L-精氨酸合成相关基因的转录水平分析

3.3 氮源吸收利用与L-精氨酸合成代谢调控

3.3.1 整合表达铵转运蛋白AmtB增加氮源吸收

3.3.2 过量表达glnA,gltBD和gdh增强氨同化作用

3.3.3 整合突变改造GlnD蛋白减弱尿苷酰去除酶的活性

3.4 在菌株Cc-amtB2中串联表达glnA-gltB-gltD

3.4.1 构建串联表达质粒pXMJ19-glnA-gltB-gltD

3.4.2 重组菌株Cc-amtB2/ABD的酶活检测

3.4.3 摇瓶发酵检测重组菌株Cc-amtB2/ABD产L-精氨酸的能力

3.5 5L发酵罐研究Cc-amtB2/ABD菌株产L-精氨酸

主要结论和展望

主要结论

展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李静

导师: 徐美娟

关键词: 精氨酸,转录调控因子,铵转运蛋白,双功能尿苷酰转移,去除酶,钝齿棒杆菌

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ922.9

总页数: 59

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钝齿棒杆菌氮素调控因子AmtR在L-精氨酸合成中的作用

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