马有智[1]2003年在《猪链球菌溶血素基因的克隆及其原核和真核表达》文中指出猪链球菌(Streptococcus suis, Str. suis)能引起猪脑膜炎、心内膜炎、关节炎、肺炎和败血症等，并能感染人，是一种重要的人畜共患病病原，该菌有35个血清型，其中2型流行最广、且致病性最强。Str. suis能产生多种毒力因子，如溶血素(Suilysin)、溶菌酶释放蛋白(Muramidase-released protein)、胞外因子(Extracellular factor)等，其中的溶血素属于巯基活化细胞毒素家族(Thiol-activated cytolysin, TACY)，能刺激机体产生免疫保护作用，且各型猪链球菌均能产生生化和免疫特性相似的溶血素。因此，以溶血素为免疫原的疫苗有可能对各型猪链球菌感染产生交叉保护作用。沙门氏菌是一种较为常见的侵袭性胞内菌，通过一定方法减毒后对宿主致病性显着降低，但仍保留良好的侵袭力，可携带重组质粒侵入脾和淋巴结等器官组织，并在宿主细胞中表达抗原而诱发特异性的免疫应答反应。以减毒沙门氏菌为载体的疫苗已试用于细菌和病毒性疾病的预防，但目前未见以减毒沙门氏菌为载体进行猪链球菌相关基因表达方面的报道。本试验目的是：1)检验猪链球菌分离株的生物学特性；2)建立以溶血素为靶基因的SUIS PCR检测方法；3)构建溶血素基因的原核和真核表达质粒，并分析表达产物的免疫反应性。 从临床表现为脑膜炎和败血症的发病猪病料中分离到两株链球菌，经生化和血清学鉴定为猪链球菌2型，对小白鼠和家兔均具有一定的致病性。PCR能扩增出猪链球菌MRP、EF和溶血素叁个主要毒力因子基因。根据猪链球菌2型溶血素基因序列设计一对引物，成功地建立了检测猪链球菌溶血素基因的PCR方法。用EcoR Ⅰ进行酶切，获得了与预期大小一致的869bp和633bp的两个片段；巢式PCR亦能扩增出预期片段。PCR检测的灵敏程度可达100个细菌，对马链球菌兽疫亚种、类马链球菌、少酸链球菌、猪丹毒杆菌和猪放线杆菌等PCR检测结果均呈阴性。结果表明本试验建立的PCR方法特异性和敏感性均较高，可作为猪链球菌病快速诊断的方法之一。 采用特异性引物PCR扩增猪链球菌2型JX02分离株溶血素基因，将扩增产物克隆到pMD18-T质粒载体中，酶切和PCR鉴定后测序鉴定。结果显示，扩增的JX02株溶血素基因长度为1494bp，编码497个氨基酸，其N末端含有27个氨基酸的信号肚。序列分析表明，猪链球菌JXOZ株溶血素基因及其编码产物属于TACY家族，具有该家族的特征性保守序列ECTGLAWE料R，与猪链球菌2型、1型、4型、8型、19型、昭型和28型等菌株溶血素的氨基酸序列同源性均在99%以上，显示不同血清型猪链球菌产生的溶血素无明显差异。 将溶血素基因克隆入原核表达载体pBV220，重组质粒经鉴定后再导入减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJin株，提取重组质粒进行PCR和酶切鉴定，筛选阳性克隆，用SDS一PAGE电泳和Western blot进行溶血素的表达和鉴定。结果表明，即使在体外无抗生素存在的条件下重组质粒在受体菌ZJ In菌株内比较稳定，能在宿主菌中进行表达，表达产物具有免疫反应性。 PCR扩增猪链球菌JX02株溶血素基因，并将其插入到真核表达载体pcDNA3的CMv启动子下游，构建成真核表达质粒pcDNA3一SLY，将重组质粒导入减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJlll中，并直接转染Vero细胞，细胞形态发生明显变化;提取细胞总DNA，DIG标记探针可检测到阳性杂交信号，SDS一PAGE可检测到58KD的蛋白条带。 本试验结果表明:减毒沙门氏菌可以作为原核和真核表达质粒的载体表达外源抗原，真核表达质粒通过其呈递给Ver。细胞表达猪溶血素，为进一步开展针对溶血素的猪链球菌基因免疫研究奠定了基础。
许崛琼[2]2015年在《猪源PTX3蛋白的真核表达及其对猪链球菌2型的抗菌作用研究》文中指出猪链球菌(Streptococcussuis,SS)是一种重要的人畜共患病病原菌。目前对于该病的治疗主要采用抗生素疗法,但长期大量使用抗生素必然存在抗生素耐药性的风险;另外针对该病,临床上仍缺乏有效预防猪链球菌的疫苗,故寻求能替代的治疗方案以及抗微生物化合物是备受关注的。PTX3是第一个被确认的长正五聚蛋白,具有结合到某些病原微生物的能力,PTX3也可以促进细胞吞噬功能以及随后病原体的清除。另外,PTX3具有充当调理素的治疗效果,可识别微生物成分,引发炎症反应的放大。本试验首先通过构建原核表达载体PET-32a-ptx3,获得原核表达猪源PTX3蛋白,并制备兔抗原核表达PTX3蛋白血清;随后又构建重组真核表达载体pIRES-EGFP-ptx3,并转染至真核表达宿主CHO细胞中,通过G418(750μg/ml)筛选获得能够稳定、大量表达PTX3蛋白的单克隆细胞株,并采用Ni-NTA亲和层析方法纯化细胞培养上清获得纯度较高、性质稳定的真核表达猪源PTX3蛋白;随后成功构建了重组真核表达载体pVAX-ptx3,将纯化的重组质粒肌肉注射BALB/c小鼠(1OOμg/只),在接种后第1,3,5,7,15,20天取外周血及注射部位肌肉,分别用RT-PCR和Western-blot方法进行检测,在第15天左右均可检测到表达产物,表明该重组质粒可在小鼠组织内进行有效表达。通过研究发现表达的猪源PTX3介导一系列抗菌反应,包括提高猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)对猪链球菌2型的吞噬能力以及抑制猪链球菌2型对Hep-2细胞的粘附。在小鼠模型中,用pVAX-ptx3预先接种的小鼠的死亡率降低,并且血、脾、肺、脑中的猪链球菌的载量显着降低;在仔猪模型中,预先接种pVAX-ptx3的仔猪感染猪链球菌2型后,外周血中的细菌载量显着降低,而IL-6和IL-8的血浆水平则显着升高,与此相反,接种组仔猪外周血中的白细胞(WBC)和中性粒细胞(NEU)则相对降低。以上结果表明猪源PTX3以及pVAX-ptx3表达的PTX3蛋白对猪链球菌2型有一定的抗菌作用,同时构建的pVAX-ptx3表达载体可以在动物体内稳定无害化表达,这可能为猪链球菌病的预防和治疗提供了一个新的视角。
孙学强[3]2010年在《马疱疹病毒1型感染性克隆及表达猪链球菌2型亚单位重组病毒的构建》文中进行了进一步梳理马疱疹病毒1型(Equine herpesvirus type1, EHV-1)是马科动物的重要病原之一,临床上多引起呼吸道、流产及神经系统疾病。疱疹病毒拥有庞大的双股DNA基因组,由于其基因组中存在大量非必需基因,有大约30kbp的序列可以被外源基因取代,并且不会严重影响病毒在体外细胞培养中增殖,EHV-1可作为表达外源蛋白活疫苗载体,不但可以用于马病的预防,而且最近的研究显示EHV-1有发展为通用载体或者基因治疗载体的潜力。本实验以ATCC标准株438/77株基础,分别克隆其ORF19和20,与含有绿色荧光蛋白和氯霉素抗性报告基因的pHA2相连构建转移载体后,与母本病毒共转染以传统的同源重组方法在ORF19和20之间插入mini-F序列,构建了含有GFP和氯霉素基因的重组病毒,提取重组病毒基因组环状中间体电转至大肠杆菌DH10B感受态细胞,经过PGR和RFLP筛选到多株阳性细菌人工染色体(BAC)克隆,以磷酸钙法转染RK13细胞,结果均拯救出病毒。拯救病毒与转移载体p1920XM通过同源重组进一步删除含有报告基因mini-F序列构建了无痕迹有标记的恢复病毒。野生株、拯救株和恢复株经过噬斑测定和一步生长曲线测定证明各毒株体外培养特性差异不显着,说明本实验所构建的BAC具有感染性,而且mini-F的插入和删除均没有改变病毒的体外培养特性。猪链球菌2型作为一种人畜共患病病原日益受到关注,而溶血素又是其分泌到细胞外的外毒素,是公认的重要毒力因子之一,具有良好的免疫原性。通过对其基因序列的分析发现5’约81bp编码的27个氨基酸残基为信号肽序列。本试验通过PCR及融合PCR方法构建载体在大肠杆菌中成功的表达了带有信号肽和无信号肽的SLY,以及将463和464位色氨酸突变为丙氨酸的带有信号肽和无信号肽的溶血素突变体-SLYm。经过蛋白杂交试验证明,表达的重组SLY和SLYm与提取的SS2分泌的SLY分子量完全一致,而且带有的信号肽的SLY和SLYm均能在细菌上清中检测到杂交条带,说明SS2sly基因的信号肽序列同样能够引导在大肠杆菌中成熟的SLY或者SLYm进行跨膜转运,而且转运至细胞外的SLY和SLYm的分子量与SS2的分子量一致,说明其信号肽序列已被切除,而无信号肽的SLY和SLYm的上清中均未检测到。同时通过血平板和96孔板溶血试验证明溶血素突变体失去溶血活性,而野生型SLY不仅能够溶解红细胞而且对PK15.RK13.SUVEC细胞具有毒性,突变体则不能引起任何细胞发生病变。小鼠毒力实验证明所表达的SLY通过腹腔注射和静脉注射均能致死小鼠,而SLYm在同样条件下对小鼠安全。用SLY和SLYm免疫小鼠制备的抗血清均能抑制SS2SLY的溶血活性,提示了463和464为氨基酸的突变虽然灭活其溶血活性,但是仍具备免疫原性其抗血清能够封闭SLY的膜结合结构域阻止其细胞膜的结合。瞬时表达及免疫转印试验证明未经优化的SS2溶血素突变体全基因在PK15细胞中不能被Pcmv启动子启动表达,而优化合成的slyom则能够表达,所表达的溶血素蛋白在PK15细胞中不需要信号肽序列也能实现跨膜转运。MRP被认为是猪链球菌的重要的毒力因子,从病猪体内分离的菌株常常含这种分子。对链球菌致病菌株的MRP进行了克隆、测序,显示N端前47个氨基酸是典型的信号肽,游离于细菌表面,N端有7个带电荷的残基,后面是一个21个氨基酸的疏水孔和一个公认的信号肽酶切位点。剪切掉信号肽得到一个分子量为131094的成熟蛋白,它与136kD的MRP接近。C端有一类似于A群链球菌M蛋白基因的锚式序列,本试验通过构建含有mrp片段的真核表达质粒转染细胞后瞬时表达MRP并经免疫转印确定能够在Pcmv启动子启动下表达。应用疫苗预防目前仍旧是防控猪链球菌病有效措施,传统的灭活疫苗仍旧具有需多次注射的局限,新型高效的猪链球菌2型疫苗仍有待于进一步的研究。本试验在所构建的p438/77的基础上,以两步法无痕迹的将mrp基因片段和溶血素突变体分别插入EHV-1基因组内构建了重组病毒,经过免疫转印鉴定能够表达MRP和SLY。重组病毒通过传统的同源重组方法删除了含有氯霉素抗性基因以及gfp的mini-F序列获得4M和4S株。免疫小鼠后以间接ELISA方法检测到4M能够诱导小鼠产生抗MRP特异性抗体,4M株免疫小鼠后能够抵抗致死量的SLY静脉注射的攻击。
王晓晖[4]2013年在《鼠源Ptx3蛋白的真核表达及其对感染猪链球菌2型小鼠保护作用的研究》文中认为猪链球菌(Streptocottus suis,SS)是一种重要的人畜共患病病原体,不仅可以引起病畜产生败血症状,也可侵害中枢神经系统和其他组织,引发脑膜炎、肺炎、心内膜炎和关节炎等严重的炎性反应。近10年来,我国有237人感染猪链球菌,导致至少53人死亡的严重后果,给公共卫生带来了严重的威胁,备受世界关注。目前对猪链球菌病的治疗,我们常采用抗生素方法,这样不仅会诱使猪链球菌的耐药性增强,而且抗生素的使用也会引起药物残留,食品安全等一系列的问题,所以急需探索出一种新的、安全有效的猪链球菌病的治疗办法。Ptx3蛋白是第一个被确认的长正五聚蛋白,研究证实,Ptx3蛋白可以绑定在某些病原体上,在对抗某些病原菌的过程中发挥重要作用。随着转基因小鼠和转基因细胞的应用,陆续发现Ptx3还具有调节免疫应答,调理吞噬等作用。通过研究Ptx3和肺炎克雷伯菌外膜蛋白A (KpOmpA)之间的相互作用,发现Ptx3对微生物成分引起的炎症反应也具有调节作用等。本试验首先通过构建重组原核表达载体PET-32a-Ptx3,获得原核表达的鼠源Ptx3蛋白,并制备兔抗原核表达Ptx3蛋白血清,为鼠源Ptx3蛋白的真核表达奠定一定的试验基础。随后又构建了重组真核表达载体pIRES-egfp-Ptx3,并将重组真核表达载体转染到真核表达宿主CHO细胞中,在含有G418(700ng/mL)的F-12K营养液中培养进行阳性细胞的初步筛选。通过流式细胞仪的再次分选作用获得了能够稳定、大量表达Ptx3蛋白的单克隆细胞株。再在无血清培养基中对阳性单克隆细胞株进行传代培养,收集上清并经过葡聚糖凝胶层析系统纯化,获得纯度较高、性质稳定的真核表达鼠源Ptx3蛋白,为鼠源Ptx3蛋白功能的研究做好准备工作。通过研究在真核表达鼠源Ptx3蛋白的作用下,Ana-1细胞对SS2HA9801细菌吞噬能力的变化,观察到Ana-1细胞对HA9801的吞噬率(PA)和吞噬指数(PI)都有显着提高,说明Ptx3蛋白在体外条件下可增强Ana-1的吞噬作用。建立小鼠气囊模型,研究在体内环境下Ptx3蛋白对HA9801感染小鼠引起炎症反应的调节作用,结果表明在Ptx3蛋白作用下炎性细胞的数量与炎性因子(IL-6)的浓度都显着升高,证实Ptx3蛋白可增强HA9801感染小鼠引起炎症反应。并且在Ptx3蛋白作用下HA9801菌株在小鼠体内感染浓度明显降低,所以Ptx3蛋白对HA9801具有一定的抗感染作用。
吴浩[5]2010年在《猪链球菌2型HtrA基因的鉴定及功能研究》文中研究指明猪链球菌病(Swine streptococcal diseases)是由多种致病性链球菌引起的一种细菌急性、热性传染病。其中最为重要的是猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2),呈全球分布,不仅对养猪业的生产造成了巨大的危害,同时可导致人类发生脑膜炎、关节炎、败血症和心内膜炎,严重可致人类急性死亡。1998年江苏与2005年四川资阳爆发的链球菌,引发人猪混合感染,引起全国高度关注。因此对该病防治有重大公共卫生学意义。对猪链球菌2型的研究,目前集中在对毒力因子、毒力岛、双组分系统的研究上,对其致病机理还未有准确表述。高温热激需求蛋白(High temperature requirement A, HtrA)作为热休克诱导的一种丝氨酸蛋白酶,具有丝氨酸蛋白酶与分子伴侣的双重功能。该基因已发现于动植物、细菌、真菌、酵母、支原体以及人类多种生物中；对生物体逃避环境的高温和氧化应激有重要作用；在一些生物中有关于HtrA对细菌毒力、细菌在细胞的定植产生影响的报道；在人类的HtrA同源基因HtrA2也有报道与细胞凋亡和周期有关。本研究旨在通过克隆SC-19基因组中HtrA基因序列,并构建重组蛋白和基因缺失株,研究其与猪链球菌2型在致病力上的相关性,研究的具体结果包括：1.猪链球菌2型HtrA基因的鉴定、蛋白表达、纯化及免疫学研究通过公布的P1/7菌株HtrA基因、蛋白序列比对,以猪链球菌2型SC-19为模板,依据05ZYH33基因组(CP000407)序列进行引物设计。成功克隆HtrA基因后构建pET-32a (+)-HtrA重组质粒,并将其转化到Rosetta (DE3)表达菌中,0.2mM/mL浓度的IPTG,16℃诱导15h,通过Ni-NTA Agarose过柱纯化,得到纯化蛋白,经过SDS-PAGE与Western Blotting共同验证纯化蛋白为目的蛋白。通过对HtrA重组蛋白进行小鼠免疫与攻毒试验,对免疫血清进行抗体和IgG亚类测定,确定其较好的免疫原性。小鼠叁免后用2.5LD50,1.8×109CFU/mL SC-19进行攻毒,证实重组蛋白对小鼠具有保护力。通过设计的HtrA基因引物,对猪链球菌不同血清型的HtrA基因分布进行测定,证实在多数猪链球菌中都存在HtrA基因。重组蛋白对Hep2细胞的黏附实验与抗血清对RAW264.7细胞的调理吞噬实验证实,重组蛋白对细菌在细胞上的黏附有影响,抗血清具有调理巨噬细胞吞噬细菌的作用。运用真核表达载体,将真核表达质质粒转入Hep2细胞中,通过流式细胞仪检测,证实HtrA有促进细胞凋亡的作用。2.猪链球菌2型HtrA基因缺失株的构建及生物特性研究为进一步阐明HtrA基因与猪链球菌2型致病的相关性,本研究构建其基因缺失株和互补菌株,并对其生物学特性加以研究。试验中构建了pSET4s-△HtrA同源重组质粒和pSET2s-c△HtrA互补质粒,分别电转入SC-19和基因缺失株△HtrA中,筛选得到基因缺失株△HtrA和互补菌株c△HtrA。本研究通过溶血活性测定、应激试验、细胞黏附试验证实,基因缺失株△HtrA较野生型都有明显的变化；但是在细菌形态、毒力上基因缺失株△HtrA在与野生型变化不明显。
杨俊兴[6]2007年在《猪链球菌2型抗体检测试纸条的制备及FBPS与宿主蛋白质相互作用研究》文中提出猪链球菌(Streptocuccus suis,S.suis)是一种重要的人畜共患病原菌。根据荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)抗原成分不同，可以将猪链球菌分为35个血清型(1.34型和1／2型)。其中，猪链球菌2型(Streptocuccussuistype 2，SS2)是最常见、也是毒力最强的血清型。猪链球菌是一种条件致病性病原菌，成年猪感染后一般不表现任何临床症状。但是，受到应激因素的刺激，往往会加剧发病率和死亡率。血清学调查(sero-surveillance)或抗体水平监测(antibody monitoring)有助于了解猪群中链球菌感染状况，为控制猪链球菌病提供科学的依据．目前，有一些方法可以用于SS2抗体检测，如ELISA和琼脂扩散试验等，但这些方法由于费时或成本高等因素的制约，只能用于实验室诊断，不适合用于大量样品的检测。因此，急需研制一种快速检测SS2抗体的方法，对我国SS2血清流行病学进行调查。本试验应用胶体金标记技术(immunogold labeling technique)，根据免疫层析原理，用胶体金标记葡萄球菌蛋白A(SPA)作为探针，用纯化的SS2 CPS和健康猪IgG分别作为检测线试剂和对照线试剂，研制了一种SS2抗体快速检测试纸条。该试纸条具有检测快速和使用方便等优点，可以适用于临床样品的大量检测，为SS2血清抗体检测提供了有效的工具。用该试纸条检测16份SS2感染康复猪血清抗体和24份SS2高免猪血清，试纸条检测为100％阳性，与ELISA法检测结果完全一致；检测68份其它细菌高免血清或健康猪血清，结果除一份链球菌1型(SS1)高免血清呈弱阳性外，其余均为阴性。用试纸条检测20份阳性高免血清抗体滴度，结果表明试纸条的敏感性和ELISA相当。用试纸条和ELISA检测486份临床血清样品，结果表明试纸条的特异性(specificity)为94.6％，敏感性(sensitivity)为91.7％，两种方法检测结果的符合度很高(kappa=0.863)。由此表明，试纸条法可以代替ELISA在临床检测中的应用。深入了解猪链球菌的致病机理，可以为链球菌病的预防和治疗提供科学的依据。病原菌与宿主细胞之间的相互作用，在致病过程中发挥着重要的作用。研究病原与宿主细胞相互作用，可以促进对致病机理的探索。并可以为药物筛选、疫苗设计提供理论依据，以便制定科学的疫病控制措施。纤连蛋白结合蛋白(FBPS)由链球菌Fbps基因编码，可以与人的纤维结合蛋白和纤维蛋白素原结合。在SS2感染过程中，FBPS与细菌在特定器官中的定殖有密切关系，推测FBPS与SS2的致病性有关。因此，本试验用CytoTrap酵母双杂交技术，研究FBPS与宿主细胞蛋白质相互作用，旨在探索FBPS在SS2致病性中的作用。用PCR方法扩增SS2 Fbps全长基因，定向克隆到pSos载体多克隆位点中，构建bait载体(pSos-Fbps)。并将Fbps克隆到pET-28c载体中，构建重组表达载体。将pSos-Fbps和鼠cDNA文库(pMyr-cDNA)共转化cdc25H酵母细胞，筛选与FBPS相互作用的克隆。经过筛选和重复验证，得到2个与FBPS相互作用的阳性克隆，并对Target载体插入片段进行测序，经BLAST分析，两个基因分别与凋亡抑制因子5(apoptosis inhibitor 5，API 5)基因和锌指结构FYVE结构域27(zinc finger FYVE domain containing 27，ZFYVE 27)基因的同源性为99％和100％。将重组原核表达载体pET-28c-Fbps转化BL21大肠杆菌细胞，进行FBPS蛋白质表达。分别用PCR扩增API 5和ZFYVE 27全长基因，定向克隆到pcDNA3.1/myc-His载体中，构建真核表达载体(pcDNA3.1/myc-His-API 5和pcDNA3.1/myc-His-ZFYVE 27)，并分别转染293T细胞进行表达。将细胞裂解后，用兔抗Myc抗体共沉淀FBPS和ZFYVE 27或FBPS和API 5复合物，再用SS2高免血清进行Western-blotting分析。用免疫共沉淀试验分别证了FBPS与API 5和ZFYVE 27之间的相互作用。
刘春生[7]2010年在《河南猪链球菌的分离、鉴定及毒力相关基因的原核表达》文中提出猪链球菌病是危害养猪业的一个重要传染病,可引起猪的脑膜炎、关节炎、败血症、心内膜炎等,给养殖业造成很大的经济损失。猪链球菌是其最主要的病原之一,根据其荚膜多糖抗原的差异,可将其分为35个血清型,其中1、1/2、2、7、9、14型是其主要致病性血清型,给养殖业造成很大的经济损失。同时,它也是一种重要的人兽共患病,可引起人的败血症、脑膜炎和永久性耳聋等,甚至引起死亡,在公共卫生方面引起极大关注。本研究旨在建立快速特异的免疫学和分子生物学检测方法,同时对河南省病猪群中猪链球菌的感染状况及血清分布进行调查,为该病的快速诊断和防制提供参考。1、猪链球菌主要致病血清型PCR检测方法的建立根据猪链球菌种特异的gdh基因序列及1(14)、2(1/2)、7、9型型特异的cps1I、cps2H、cps7H、cps9G基因序列,分别设计了5对引物,预计扩增目的片段分别为689bp、441bp、542bp、232bp和330bp。通过优化反应体系,分别建立了快速检测猪链球菌种及其1(14)、2(1/2)、7型的四重PCR方法和猪链球菌9型的单一PCR方法。利用保存的猪链球菌不同血清型菌株和其他相关标准菌株为参照进行特异性和敏感性试验。用所建立的PCR方法对河南省不同地市的39份猪扁桃体样品进行检测,并选取部分样品通过PCR产物序列测定进行了验证。所建立的PCR法特异、敏感,其中四重PCR对猪链球菌2型的最低检出水平为2.52CFU。该PCR法准确性很好,可用于猪链球菌主要致病血清型的快速检测。2、河南省发病猪群猪链球菌的分离、PCR鉴定及其血清型分布利用所建立的PCR方法,对河南省14个地市33个猪场采集的83份发病猪扁桃体样品进行PCR检测,同时分离疑似猪链球菌,进行形态学、染色特性鉴定、并用猪链球菌种及其主要致病血清型PCR方法进行鉴定,再抽取部分PCR产物进行序列测定进行验证。扁桃体样品中共检测出猪链球菌阳性77份,检出率为92.8%,其中2型15份,占18.1%;7型4份,占4.8%;9型26份,占31.3%;没有检测出血清1型;同时检出2型和7型的有8份,9.6%;同时检出9型和7型的有2份,占2.4%;共分离到猪链球菌菌株77株,其中2型7株,占9.2%;7型3株,占4.0%;9型4株,占5.3%;未定型的63株,占81.8%;没有分离到血清1型。分离到的猪链球菌均为针尖状大小、灰白色或灰色、呈α、β、γ溶血的小菌落,革兰染色均为阳性球菌,一般成对或短链状,偶有长链。结果说明河南省病猪群中猪链球菌的携带率很高,主要为血清9型,其次是2型,7型较少;未发现1型。猪链球菌致病血清型常与HCV,PCV2等混合感染;分离到的猪链球菌菌株较纯,可作为背景明确可靠的实验材料用于今后的生产和科研。3、猪链球菌谷氨酸脱氢酶(GDH)基因的克隆与序列分析PCR扩增出猪链球菌1、2、7、9及其它未定型菌株共5个菌株的gdh基因,克隆于pMD-18T载体,转化宿主菌JM109中进行序列测定。并从GenBank中下载猪链球菌2、7、9型gdh基因序列共16个,对其进行比较分析。成功克隆了5株猪链球菌的gdh基因,序列分析显示其gdh基因与GenBank中已登录的猪链球菌gdh基因有密切的亲缘关系,21株不同血清型菌株gdh基因的核酸同源性96.4%～100%;其推导的氨基酸序列同源性在98.4%～100%,最高只有5个氨基酸的差异。15株血清2型菌中,该基因的核苷酸同源性在99.9%～100%,氨基酸同源性在99.6%～100%,其中有13株为100%,另2株仅有一个氨基酸的差异。对21个菌株的氨基酸序列比较发现,6个血清2型之外菌株的氨基酸序列都有3处氨基酸存在差异,分别发生在299aa处,Ser→Ala,305aa和330aa处,Lys→Glu。除此之外,个别序列在其它位点与2型仅存在1或2处氨基酸的差异。该蛋白抗原性预测显示其共含21-22个抗原表位,BLAST分析显示有13-14个表位是特异性的抗原表位。表明所克隆的基因在猪链球菌之中非常保守,可以进行表达以用作免疫学方面的相关研究。4、猪链球菌血清2型PDSWG-1株gdh基因及9型荚膜多糖cps9G基因的原核表达设计2对引物,分别采用PCR法以猪链球菌2型河南分离株PDSWG-1及猪链球菌9型河南分离株PY-2的基因组DNA为模板扩增出gdh和cps9G全基因。用限制性核酸内切酶BamHⅠ、XhoI进行双酶切后,定向克隆至pET32a(+)中,构建重组表达质粒pET32a-gdh和pET32a-cps9G,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行鉴定。通过优化表达条件,pET32a-gdh/BL21经0.8 mmol/L IPTG诱导3h后SDS-PAGE分析表明,重组菌株表达出了约68.8KDa的融合蛋白条带,与预期结果一致。pET32a-cps9G/BL21经1.2 mmol/L IPTG诱导4h后SDS-PAGE分析表明,重组菌株表达出了约50.7KDa的融合蛋白条带,与预期结果一致。Western blotting分析表明,这两个融合蛋白均具有特异的生物学活性。为建立快速、简便、特异的免疫学检测方法及制备单克隆抗体提供了较好的抗原,同时为研制猪链球菌亚单位疫苗和诊断试剂盒奠定了基础。
吴涛[8]2008年在《猪链球菌2型revS基因缺失株构建及HYL蛋白与宿主互作的研究》文中指出猪链球菌(Streptocuccus suis,S.suis)是当前严重危害养猪业的一种重要病原菌。根据荚膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)抗原成分不同,将猪链球菌分为35个血清型(1-34型和1/2型)。其中,猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)是最常见、也是毒力最强的血清型,同时也是一种重要的人兽共患病原菌。猪链球菌2型revS基因是一种反应调控因子(response regulator),在SS2致病过程中可能起着很重要的作用。研究发现该基因能够在转录水平上对SS2多种毒力因子进行调控,缺失该基因后多种毒力因子表达减弱。鉴于此,本研究构建了猪链球菌2型revS基因缺失菌株和质粒介导的互补菌株,并对缺失菌株和互补菌株的生物学特性进行了研究,进一步研究其所调控毒力因子的表达情况,为深入研究猪链球菌2型的的分子致病机理奠定前期基础。透明质酸酶(hyaluronidase,HYL)由猪链球菌2型Hyt基因编码,该酶为粘多糖分解酶,可水解组织基质中的透明质酸,增加组织的通透性。另外也有研究报道,HYL可以作为一种调控蛋白,通过降低血中的透明质酸酶的浓来诱导血管的增生。在SS2感染过程中,细菌分泌的透明质酸酶是否可以改变宿主细胞通透性,导致链球菌及其分泌的毒力因子更容易进入宿主细胞内而发挥毒性作用有关目前还不清楚。因此,本研究利用酵母双杂交技术,以透明质酸酶作为诱饵蛋白,从小鼠的脑细胞和人的肺细胞cDNA文库中寻找HYL的互作蛋白,旨在为进一步探索HYL在SS2致病中的作用提供理论依据。鉴于以上研究背景,本研究主要开展了以下研究内容:1.猪链球菌2型revS基因缺失菌株和互补菌株的构建与鉴定通过PCR分别扩增了revS基因上下游同源臂p1和p2基因片段、开放阅读框(ORF)和全长序列,利用温度敏感型“自杀性”质粒pSET4s构建了质粒pSET4s-p1-p2,并将该重组质粒电转化进入亲本菌SS2野生菌株SC21中,通过抗生素和温度双重标记筛选,获得revS基因缺失菌株,命名SC211。另外,将revS全长基因定向插入穿梭载体pAT18中,构建了穿梭质粒pAT18-revS,并将该质粒电转入revS基因缺失菌株SC211,通过抗生素筛选,得到质粒介导的revS基因互补菌株,命名为SC212。通过PCR、Southern blotting进一步对基因缺失突变菌株和互补菌株进行了鉴定,证实构建正确。2.猪链球菌2型revS基因缺失菌株和互补菌株的生物学特性研究通过细菌传代培养,对缺失突变菌株SC211和互补菌株SC212的遗传稳定性进行了分析,结果显示缺失突变菌株和互补菌株能够稳定生长。比较了基因缺失突变菌株、互补菌株及野生菌株的生长特性,发现缺失菌株的生长速度明显加快,互补菌株也比野毒菌株的生长快。溶血性试验结果表明,基因缺失后SC211的溶血活性明显降低,而互补菌株SC212的溶血活性虽然有所回复,比基因缺失菌株明显提高,但是没有达到野毒菌株的水平。利用Hep2细胞为模型,研究不同菌株对细胞黏附特性,结果显示,基因缺失后链球菌对Hep2细胞的黏附能力明显下降,只有野毒菌株的29%:互补菌株虽然黏附能力比基因缺失菌株要高,但是没有达到野毒菌株的水平,只有野毒菌株的79%。以CD1小鼠为模型比较了不同菌株的毒力,结果显示基因缺失后链球菌毒力明显下降,基因缺失菌株的LD_(50)(7.78×10~7)是野毒菌株LD_(50)(7.63×10~6)的10倍,而互补菌株的毒力有所增高,但是没有达到野毒菌株的水平,其LD_(50)(2.44×10~7)是野毒菌株的3倍。3.猪链球菌2型revS基因缺失菌株和互补菌株的毒力相关因子的相对定量分析利用定量PCR研究了SS2毒力相关因子体内外表达情况。体外定量结果显示:除了cps和gapdh外,基因缺失菌株其他的毒力相关因子(ef,fops,hyt,sly,sod,mrp,gyrap,和rpob)的表达都要比野毒菌株低,其中ef,fbps,hyl,sly和mrp约下降了50%—80%。而互补菌株在gyrap、rpob和gapdh的表达上和野毒菌株没有明显差别,其他毒力因子(cps,ef,fbps,hyl,sod,sly和mrp)的表达都明显增高,在一定程度上上调了0.5—1.5倍。攻毒后不同时间SS2毒力相关因子的表达水平比较发现:攻毒48h后的组织中链球菌毒力相关因子的表达量要比攻毒24h和72h的高,但是差异不显着。而攻毒后不同组织中的SS2毒力相关因子的表达水平比较发现:攻毒后组织中毒力相关因子的表达量都比体外的高,差异显着(p＜0.01%)。脑组织和肺组织中链球菌毒力相关因子的表达水平比血中的高,但是差异不显着。在体内,不同菌株毒力相关因子的表达水平比较发现:在体内cps的表达野毒菌株和基因缺失菌株之间没有明显差异,但互补菌株的cps表达量是野毒菌株和基因缺失菌株的1.2倍。在基因缺失菌株中,mrp,ef,sly,fbps,sod,rpob,gyra和hyl的表达量分别比野毒菌株降低了41%,37%,29%,39%,33%,46%,36%和49%,而在互补菌株中这些毒力相关因子的表达量比基因缺失菌株增高了1.5—2.5倍,而不同组织中gapdh的表达没有差异。4.猪链球菌2型revS基因缺失菌株和互补菌株的免疫原性的研究免疫保护性实验结果表明:10~6cfu的基因缺失菌株免疫CD1小鼠后能够对猪链球菌2型野毒菌株的攻击提供90%免疫保护,10~7cfu的基因缺失菌株免疫CD1小鼠后能够对猪链球菌2型野毒菌株的攻击提供100%免疫保护力;10~5cfu的互补菌株免疫CD1小鼠后能够对猪链球菌2型野毒菌株的攻击提供90%免疫保护力,10~6cfu的互补菌株免疫CD1小鼠后能够对猪链球菌2型野毒菌株的攻击提供100%免疫保护力。不同菌株免疫CD1小鼠后ELISA抗体水平测定结果显示:revS基因缺失后,猪链球菌2型的免疫原性并没有太大的变化,基因缺失菌株免疫后所诱导的cps抗体水平与野毒菌株差异不显着,但互补菌株的cps抗体水平明显高于野毒菌株和基因缺失菌株。5.猪链球菌2型HYL蛋白与宿主互作蛋白的筛?通过PCR方法扩增SS2 Hyl全长基因,定向克隆到pSos载体中,构建bait载体(pSos-Hyl)。将pSos-Hyl分别与鼠脑和人肺cDNA文库(pMyr-cDNA)共转化cdc25H酵母细胞,筛选与HYL相互作用的阳性克隆。经过筛选和重复验证,并对所得到的Target载体插入片段进行测序,BLAST分析,从鼠的脑组织cDNA文库中得到2个与HYL相互作用的阳性克隆,两个基因分别与锌指结构基序(widely-interspaced zinc fingermotifs gene of Mus musculus(NT-039649 REGION:18685755..18718324),WIZF)和血管生长因子抑制因子1(ribonuclease/angiogenin inhibitor 1 gene of Mus musculus(NT-166306 REGION:2098219..2104509),AI1)基因的同源性为99%和100%;从人的肺组织cDNA文库中得到2个与HYL相互作用的阳性克隆,两个基因分别与γ内收蛋白(Homo sapiens adducin 3(gamma)(NT_030059.12),ADD3)和装配架离子转运蛋白(Homo sapiens chromosome 6genomic contig,reference assembly,ion transporter protein(NT_034880.3),AITP)基因的同源性为99%和100%。6.猪链球菌2型HYL蛋白与宿主互作蛋白的验证与分析将Hyl克隆到pET-28c载体中,构建重组表达载体(pET28c-Hyl)进行原核表达,同时将筛选得到的WIZF、AI1、ADD3和AITP基因分别进行真核细胞表达后,用免疫共沉淀试验验证了HYL与AI1、ADD3和MTP之间的相互作用,而HYL与WIZF的证实没有发生相互作用。进一步并分析和预测了AI1、ADD3和AITP可能与SS2致病性的关系。血管上皮细胞生长抑制因子(AI1)主要是抑制血管上皮细胞的生长,从而导致血管的通透性的改变,利于细菌的扩散。而ADD3是一种内收蛋白,也是一种细胞膜骨架蛋白,内收蛋白的确切功能尚不明了,但是已知它与细胞膜表面spectrin和肌动蛋白连接部位的定向组装信号传导和跨膜离了转运有关,它的改变可以导致细胞膜的通透性的改变。AITP是一种离子转运蛋白,是细胞内外离子转运的载体,与细胞膜的离子通道和通透性有关。
孙雯[9]2008年在《猪链球菌2型强毒株重要功能蛋白的克隆表达、功能鉴定及其免疫特性研究》文中提出猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一种重要的人畜共患病病原体,猪链球菌感染不仅可导致猪脑膜炎、心内膜炎、关节炎、肺炎、败血症和猝死症,并可导致从业人员感染出现中毒性休综合症、脑膜炎及败血症等严重疾患。国内外的研究主要集中于S.suis 2的毒力相关因子,但也仅涉及一些功能性鉴定,新的毒力因子不断被发现并有待进一步探讨。本课题开展了猪链球菌2型(S.suis 2)05ZYH33烯醇化酶(Enolase)、Suilysin和Hemolysin的研究。1猪链球菌2型Enolase对新近测定的S.suis 2 05ZYH33全基因序列进行生物信息学分析,设计合成引物,原核克隆表达并纯化出具有酶活性的S.suis 2 05ZYH33 Enolase。酶联免疫吸附实验和流式细胞术发现Enolase可部分存在S.suis 2 05ZYH33的表面。黏附竞争实验证实S.suis 2表面Enolase参与对宿主细胞的黏附。溶血空斑实验提示Enolase可能抑制免疫反应。PCR检测eno在S.suis各血清型中普遍存在。Westernblot表明Enolase具有较高的反应原性,由此基于Enolase建立了S.suis2 ELISA抗体检测方法。Enolase作为一个潜在的毒力因子为进一步探索S.suis 2的致病机理提供了思路。2猪链球菌2型Suilysin利用PCR技术从S.suis 2 05ZYH33基因组DNA中扩增suilysin序列,构建pET32a::suilysin原核表达质粒,转化入E.coli BL21(DE3),重组菌在37℃诱导4h时表达产物最多。以包涵体形式存在的重组蛋白经尿素溶解、His-Tag亲和层析纯化和谷胱甘肽复性后,溶血实验表明其具有溶血活性,且活性受温度、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、过氧化氢、蛋白酶K等一些理化因素的影响。免疫保护实验显示出Suilysin对Balb/c小鼠有一定的保护作用,有可能作为S.suis 2疫苗的侯选分子。3猪链球菌2型Hemolysin本实验在对S.suis 2 05ZYH33进行全基因组序列测定、ORF预测和功能注释的基础上,对05ZYH33中的05SSU1668编码基因进行系统预测和分析,发现其具有信号肽和跨膜区,主要由DUF21、CBS和CorC-HlyC叁部分组成。同源性分析表明与很多菌中具有溶血活性的蛋白具有较高的相似性。由此构建了pET30a::hemolysin原核表达质粒,为深入探讨Hemolysin的溶血活性及其在S.suis 2致病中的作用奠定基础。
方丽华[10]2016年在《猪链球菌2型超氧化物歧化酶SodA与丝氨酸/苏氨酸去磷酸酶Stp1影响细菌毒力研究》文中指出猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2),是一种重要的人兽共患病病原。感染猪临床表现为脑膜炎、关节炎、败血症等病症,且能感染人,引发心内膜炎、关节炎、败血性休克等疾病,严重可导致死亡。1998年和2005年,我国江苏和四川分别发生了人的猪链球菌2型感染,给公共卫生带来重大威胁。猪链球菌2型致病与细菌黏附、侵袭呼吸道上皮细胞或血管内皮细胞,抗吞噬细胞的吞噬及激活免疫细胞炎症反应等密切相关。研究显示,猪链球菌表面蛋白能够与人血清中的补体负调节因子相结合,以逃避人体免疫细胞的吞噬,从而增强其在血液中的存活能力；猪链球菌2型抗巨噬细胞吞噬的成分有荚膜多糖、肽聚糖脱乙酰酶蛋白、超氧化物歧化酶等。本实验室前期研究发现,超氧化物歧化酶Superoxide dismutase-SodA是猪链球菌2型的重要毒力因子,可清除超氧根离子,增强细菌抗氧化应激的作用。新发现原核生物的丝氨酸/苏氨酸激酶和磷酸酶与其对环境抗性、对毒力因子表达调控和对宿主的致病性紧密相关。本研究目的：(1)初步解析sodA缺失提高猪链球菌2型黏附细胞的机制；(2)探明猪链球菌2型SodA减轻细胞自噬的机制；(3)以小鼠为模型初步探明丝氨酸/苏氨酸磷酸酶Stp1在猪链球菌2型致病中的作用。1.猪链球菌2型SodA介导对细胞的黏附,减轻小鼠巨噬细胞自噬sodA基因缺失株对细胞黏附率显着地高于亲本株：△sodA株对血管内皮细胞黏附率为22.6‰,而亲本株为0.3‰(p<0.01)；△sodA株对HEp-2细胞黏附率为21.3‰,而亲本株为0.4‰(p<0.01)。小鼠巨噬细胞RAW264.7, sodA缺失株被吞噬率显着地高于亲本株(15.71% vs 0.67%,p<0.01)。为探究sodA基因缺失对细胞黏附提高的机制,对猪链球菌2型细菌野生株和sodA缺失株进行了细菌表面蛋白的二维电泳分离,选择了6个表达差异较大的点进行质谱鉴定及对相应蛋白mRNA荧光定量分析,结果显示sodA缺失株硫氧还蛋白mRNA转录水平显着高于亲本株。为探究其机制,原核表达了猪链球菌的硫氧还蛋白Thioredoxin-1和Thioredoxin-2,并制备了相应的兔源多抗。通过提取细菌表面蛋白进行验证,发现sodA基因缺失对Thioredoxin-1表达影响不显着,而Thioredoxin-2表达显着上升,故推测Thioredoxin-2可能介导了sodA缺失株的黏附上升。前期研究表明,猪链球菌2型sodA缺失株在巨噬细胞中抗吞噬和杀菌能力显着下降,提示SodA可能通过降低ROS对菌体的损伤,有利于其存活。为探究SodA对猪链球菌2型感染小鼠巨噬细胞自噬的影响及其机制,以感染比(MOI)100:1,将猪链球菌2型野生型(WT)与sodA缺失株(△sodA)感染稳定表达GFP-LC3的RAW264.7细胞。激光共聚焦分析显示△sodA感染的细胞中LC3-II-GFP荧光斑点数显着高于野生型菌株(p<0.01)；用溶酶体标记分子Lysortrack进行跟踪,溶酶体与LC3-II-GFP分子的共定位；免疫印迹检测自噬标记分子LC3-Ⅱ/Ⅰ表达差异,灰度比结果显示△sodA相对亲本株更早促进细胞自噬；△sodA株在感染细胞1小时LC3-Ⅱ的表达量显着高于亲本株(p<0.01),亲本株在感染2小时后才出现LC3-Ⅱ的表达量上调。为了探明sodA缺失菌影响细胞自噬的机制,采用检测超氧根离子的探针分子二氢乙锭(Dihydroethidium-DHE)及检测过氧化氢探针2’,7’-二氯荧光黄双乙酸盐(dihydrodichlorofluorescein diacetate-H2DCF-DA),用流式细胞仪检测细菌感染RAW264.7细胞1小时和2小时后细胞内的ROS变化。结果显示,△sodA株细胞内ROS的量显着高于野生菌株(p<0.05),而细胞内H202的变化差异不显着。且sodA缺失株,在百草枯中相对亲本株,生长速度变慢。大肠杆菌表达的猪链球菌2型SodA蛋白,具有催化活性,可快速清除体外黄嘌呤-次黄嘌呤氧化酶体系产生的ROS。因此,猪链球菌2型可能利用SodA降低感染细胞内的ROS,从而延缓细胞自噬。2.猪链球菌2型Stp1具有去磷酸化作用,介导对小鼠的致病性stp1是猪链球菌2型编码丝氨酸/苏氨酸去磷酸酶的基因,该酶是依赖金属离子的水解酶,进行去磷酸化反应。为了研究stp1基因在猪链球菌2型致病中的作用,利用同源重组方法构建了stp1基因缺失株,分析stp1基因缺失对细胞黏附和小鼠致病力的影响。结果显示,缺失stp1基因(△stp1)对于bEnd.3和HEp-2细胞的黏附能力显着上升,△stp1对bEnd.3细胞粘附率为1.9‰,而亲本株为03‰(p<0.01), HEp-2细胞相应的粘附率分别为1.92‰和0.40‰(p<0.05)。△stp1在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的存活率相对于亲本株显着上升(0.79% vs0.16%,p<0.05)。在含百草枯(20mM)的培养基中,△stp1的抗氧化应激能力显着高于亲本株(p<0.01)。Astp1对小鼠的毒力试验显示,LD50升高1.8倍;stp1缺失株在小鼠脏器中的细菌载量显着降低(p<0.01),表明缺失stp1细菌毒力显着下降。用抗丝氨酸抗体检测了二维电泳胶中亲本株与△stp1缺失株蛋白表达水平差异,结合质谱技术分析发现Stp1可调控10个蛋白点的磷酸化。而体外磷酸化显示,Stp1对已知底物pNPP具有去磷酸化作用,但对SodA的去磷酸化作用不显着,有待进一步改善方法加以证实。综上所述,本研究首次证实缺失sodA基因可增强猪链球菌2型对细胞的黏附能力,且该菌可利用SodA清除巨噬细胞内超氧根离子的量进而延缓细胞自噬；Stp1蛋白在猪链球菌2型中是个重要的磷酸酶,缺失stp1基因可影响细菌的黏附能力、细胞内的存活率和小鼠毒力。上述研究结果可为深入探索猪链球菌2型的致病机制提供一定的基础。
参考文献：
[1]. 猪链球菌溶血素基因的克隆及其原核和真核表达[D]. 马有智. 浙江大学. 2003
[2]. 猪源PTX3蛋白的真核表达及其对猪链球菌2型的抗菌作用研究[D]. 许崛琼. 南京农业大学. 2015
[3]. 马疱疹病毒1型感染性克隆及表达猪链球菌2型亚单位重组病毒的构建[D]. 孙学强. 南京农业大学. 2010
[4]. 鼠源Ptx3蛋白的真核表达及其对感染猪链球菌2型小鼠保护作用的研究[D]. 王晓晖. 南京农业大学. 2013
[5]. 猪链球菌2型HtrA基因的鉴定及功能研究[D]. 吴浩. 华中农业大学. 2010
[6]. 猪链球菌2型抗体检测试纸条的制备及FBPS与宿主蛋白质相互作用研究[D]. 杨俊兴. 华中农业大学. 2007
[7]. 河南猪链球菌的分离、鉴定及毒力相关基因的原核表达[D]. 刘春生. 河南农业大学. 2010
[8]. 猪链球菌2型revS基因缺失株构建及HYL蛋白与宿主互作的研究[D]. 吴涛. 华中农业大学. 2008
[9]. 猪链球菌2型强毒株重要功能蛋白的克隆表达、功能鉴定及其免疫特性研究[D]. 孙雯. 南京师范大学. 2008
[10]. 猪链球菌2型超氧化物歧化酶SodA与丝氨酸/苏氨酸去磷酸酶Stp1影响细菌毒力研究[D]. 方丽华. 浙江大学. 2016
标签：畜牧与动物医学论文; 猪链球菌论文; 原核表达论文; 重组蛋白论文; 血清蛋白论文; 溶血素论文; 基因合成论文; 质粒载体论文; 信号肽论文; pcr论文;