一、33 ku protein associated several polypeptides with nearly the same molecular weight but not the same isoelectric point（论文文献综述）
李志宾[1]（2021）在《牛乳活性乳清蛋白及酪蛋白胶束的膜分离制备研究》文中进行了进一步梳理牛乳中蛋白主要分为乳清蛋白和酪蛋白两类,具有重要的营养和生理功能,在乳制品加工中应用广泛。乳清蛋白中除了含有髙丰度的β-乳球蛋白和α-乳白蛋白之外,还含有低丰度且具生物活性的蛋白,如免疫球蛋白（Ig）、乳铁蛋白（LF）、乳过氧化物酶（LPO）、黄嘌呤氧化酶（XO）等,这些活性蛋白往往具有较高的热敏性。传统的乳清蛋白配料来源于奶酪加工的副产物乳清,其在生产加工过程中会经历多次热处理,易导致活性蛋白的失活。在牛乳中,酪蛋白与钙磷等矿物盐相结合形成酪蛋白胶束,后者在胃液酸性环境下易形成致密絮凝,抑制蛋白消化降解,酪蛋白胶束胃液絮凝结构的致密程度与钙离子结合量相关。本课题以鲜牛乳为原料,开展了脱脂牛乳的除菌工艺研究、天然牛乳清蛋白的分离制备研究、以及脱钙酪蛋白胶束的制备及消化性研究。首先,比较不同杀菌工艺对脱脂鲜牛乳品质的影响。比较高温短时（HTST）巴氏杀菌,微滤（1.4μm和0.8μm）和紫外（UV-C）对脱脂乳中微生物和生物活性蛋白/酶的影响。经HTST和UV-C处理后,脱脂乳中细菌总数减少了2.3 log,经MF处理后,其细菌减少了3.0 log。三种除菌工艺处理后的脱脂乳中均未检出大肠菌群。HTST处理对芽孢数没有影响,UV-C处理后芽孢数降低0.3 log。体细胞数量不受HTST和UV-C处理的影响,微滤使体细胞数量降低至不可检测的水平。经过HTST处理后,黄嘌呤氧化酶（XO）、免疫球蛋白（Ig）G、乳过氧化物酶（LPO）、乳铁蛋白（LF）、Ig M和Ig A的保留率分别为87%、78%、69%、57%、48%、41%。UV-C和1.4μm微滤处理对脱脂乳中活性成分无显着影响。0.8μm微滤处理后,脱脂乳中Ig G和LPO无显着变化,Ig A、XO、LF和Ig M的保留率分别为93%、92%、91%、86%。经UV-C处理后,羰基含量增加了26%;经HTST处理后,总巯基含量减少了14%;微滤处理对两者无显着影响。因此,选择1.4μm微滤除菌处理,进行下一步研究。其次,使用非/低热工艺制备高活性的乳清蛋白粉。研究膜孔径（100、50、20 nm）,浓缩倍数（1～8）和过滤阶段（1～5）对髙丰度和低丰度乳清蛋白分离的影响,进而探究不同干燥工艺对生物活性蛋白/酶的影响。脱脂乳用100和50 nm微滤处理后,髙丰度乳清蛋白的透过率约为44.3%和44.1%,低丰度蛋白的透过率前者比后者高0～8%。随着浓缩倍数（CF）的增加,膜通量逐渐下降,并在4倍浓缩后保持几乎不变。浓缩倍数对乳清蛋白的透过率影响较小。随着过滤阶段的增加,膜通量逐渐增加,渗透液中乳清蛋白的含量逐渐降低。因此,选择膜孔径100 nm、浓缩倍数4、过滤阶段4,进行乳清分离及制粉研究。在乳清蛋白粉活性蛋白含量方面,常压喷雾干燥比低压喷雾干燥少20～30%,低压喷雾干燥与冷冻干燥无显着差异。最后,对上述乳清分离产生的截留液,即酪蛋白胶束部分,进行离子交换处理以制备脱钙酪蛋白胶束粉,并采用婴幼儿体外模型进行消化性研究。当酪蛋白结合的钙减少36.1%时,胶束结构基本完全解聚,游离的酪蛋白占总酪蛋白的90%以上。随着脱钙率的增加,酪蛋白在模拟胃液中形成的凝块逐渐变小且更疏松,消化性也逐渐变好。综上所述,脱脂鲜牛乳经1.4μm陶瓷膜过滤后,微生物和体细胞去除效果优于HTST处理,且乳中活性蛋白/酶几乎完全保留;进而采用100 nm孔径微滤分离乳清,结合超滤浓缩和低压喷雾干燥制得乳清蛋白粉,较好的保留了活性蛋白/酶;对分离乳清产生的酪蛋白部分进行离子交换和喷雾干燥处理,制备脱钙酪蛋白胶束粉,其消化性显着改善。
郭亮[2]（2021）在《ε-聚赖氨酸与乳蛋白相互作用机制的研究》文中进行了进一步梳理ε-聚赖氨酸是白色链霉菌（Streptomyces albulus）的次级代谢产物,是由25-35个L-赖氨酸组成的抗菌肽。由于其广谱的抑菌效力和无毒特性,ε-聚赖氨酸在世界范围内已被用作安全和天然的食品防腐剂。近年来,ε-聚赖氨酸与生物大分子通过非共价相互作用所形成的产物以其独特的结构和性质,吸引了诸多研究者的兴趣,但对于两者间的作用机制仍缺乏系统性的研究。因此,本文以三种具有代表性的乳蛋白——β-酪蛋白、β-乳球蛋白和牛血清白蛋白作为研究对象,通过研究具有不同拓扑结构的蛋白质与ε-聚赖氨酸间的作用机制,总结归纳了非共价相互作用驱动的ε-聚赖氨酸-蛋白质间跨尺度相互作用的一般特征,为基于ε-聚赖氨酸和蛋白质的复杂系统的设计和应用提供理论参考。具体阐述如下:ε-聚赖氨酸/乳蛋白体系相转变的多尺度表征。考察了p H、离子强度和摩尔比例等外在和内在因素对ε-聚赖氨酸/乳蛋白体系多尺度相转变的影响。通过建立表征ε-聚赖氨酸/乳蛋白体系宏观相转变的浊度等高线图,以直观地反映两者间的相互作用强度和形式。同时,以流体力学直径和ζ-电势为重要指标,探究了ε-聚赖氨酸/乳蛋白体系的介观相转变特征。最后,通过蛋白质表面静电势建模,从微观角度比较不同乳蛋白表面电荷分布的各向异性。研究表明,等摩尔比例或过量的ε-聚赖氨酸与乳蛋白结合后会产生“过度充电”效应,改变乳蛋白表面电荷分布情况,进而影响乳蛋白的自聚集形态。同时,分子量和表面电荷的分布情况决定了p H介导的ε-聚赖氨酸/乳蛋白体系跨尺度相转变的一般特征。ε-聚赖氨酸/乳蛋白体系的多尺度结构表征。用5 m M的磷酸缓冲溶液（p H 7.0）作为ε-聚赖氨酸/乳蛋白体系的溶剂,通过超速离心将其分离为亚稳定的中间相和不稳定的沉淀相,以揭示ε-聚赖氨酸与乳蛋白间相互作用在空间上的跨尺度演化特点。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）、动态光散射、光谱学和显微技术等对中间相和沉淀相的组成、形态和构象进行了表征。研究表明,ε-聚赖氨酸/乳蛋白体系的中间相聚集体为纳米级的紧密球形或椭球型,具有多分散特点,而沉淀相是微米级的无定型结构,呈松散的多孔性特征。ε-聚赖氨酸通过与乳蛋白间的相互作用,从而改变蛋白质聚集体的形态,形成了从复合物到聚集体再到沉淀物具有跨尺度特点的层级复杂体系。ε-聚赖氨酸与乳蛋白间的相互作用机制探究。通过实验和分子动力学模拟的方法,揭示了ε-聚赖氨酸与乳蛋白间相互作用在时空上的跨尺度演化规律。首先,利用“成核-增长”理论解释了体系由中间相转变为沉淀相的相分离动力学;其次,通过添加盐离子和尿素分子以影响ε-聚赖氨酸与乳蛋白间的相互作用方式,间接论证了复合物、中间相和沉淀相的主要驱动力。最后,通过分子动力学模拟,研究了复合物的形成机制。研究表明,ε-聚赖氨酸和乳蛋白间的复合物的形成主要受静电吸引力的驱动,前者通过调整自身的构象结合到后者表面的负电荷区域。疏水相互作用和分子间氢键作用是中间相和沉淀相形成的主要驱动力。不同长度尺度的非共价作用力间的协同和竞争导致了ε-聚赖氨酸/乳蛋白体系的不连续和跨尺度的特征。ε-聚赖氨酸与乳蛋白间的亲和性评价。利用SDS-PAGE和LC-MS定性和定量分析ε-聚赖氨酸与三种乳蛋白混合物间的相互作用特征,以评价ε-聚赖氨酸与不同乳蛋白间的亲和性。并以此为基础,分别考察了ε-聚赖氨酸与脱脂乳以及两种乳源配料（酪蛋白酸钠和乳清分离蛋白）中各蛋白质组份间的亲和性。研究表明:ε-聚赖氨酸与酪蛋白间的亲和性较强并具有明显的相分离产生,但与各酪蛋白组份间没有选择性的差异;同时,ε-聚赖氨酸与β-乳球蛋白间的亲和性大于其与牛血清白蛋白间的亲和性,但没有发生明显的相分离现象。据此提出了静电相互作用的可逆平衡与疏水相互作用的不可逆平衡之间的竞争理论,并结合能量最小化原则,解释了乳蛋白疏水氨基酸残基的分布对它们与ε-聚赖氨酸间亲和性的影响。ε-聚赖氨酸/酪蛋白酸钠的相分离产物的特征及其应用。以不同培养肉汤中酪蛋白酸钠的水解程度为因素,探究不同尺度体系对ε-聚赖氨酸的抑菌效力的影响。结果表明,中间相的形成能够维持ε-聚赖氨酸的抑菌效力,而沉淀相的产生则使其抑菌效力大幅度降低。同时,利用了上述不可逆竞争理论解释该现象并将该理论拓展到了作为生命体的微生物中。此外,通过离心分离法制备了以ε-聚赖氨酸/酪蛋白酸钠的沉淀物为基础的致密复合物,并对其理化性质进行了表征。作为富含β-折叠的生物材料,该复合物具有良好的溶胀性和可塑性,其微观结构具有疏松多孔的特点,并据此考察其对疏水性化合物的吸附特性。利用可挥发物质作为吸附对象,可制备具有不同孔径的生物模板材料。同时,通过体外消化模拟实验,探究了致密复合物对姜黄素的缓释作用。
马艳丽[3]（2020）在《骨明胶的酶法制备及成膜特性研究》文中研究表明骨明胶是骨胶原部分水解的产物,广泛应用于食品、医药、化妆品及感光材料,且在某些医药领域（硬胶囊、软胶囊等）占据着不可取代的地位。但传统碱法骨明胶产业耗水量大、环境污染严重,在资源面临枯竭环境日益恶化的当下,亟需转变骨明胶的传统生产方式以实现其绿色可持续发展。本论文以酶法代替传统碱法工艺制备骨明胶,建立了一条生产周期短、产率高、废弃物少的骨明胶绿色生产线路（一步酶法制备骨明胶）,为骨明胶产业的转型提供参考。一步酶法制备骨明胶工艺将传统碱法工艺的脱矿、浸灰、退灰三步缩短为一步,即脱矿与酶解同时进行,省去高耗时的浸灰步骤与高耗水的退灰步骤,骨素降解时间由3～8周缩减为3 h,无需碱消耗且降低60%水耗。1道提胶的产率与传统碱法4道提胶的产率相当,且骨明胶的质量（冻力、黏度）处于市售高档次胶范围,同时一步酶法骨明胶的各项理化指标均符合国家有关药用明胶及胶囊用明胶标准的要求。此外,绿色产品环境足迹量化管理的生命周期评价（LCA）结果显示,一步酶法骨明胶生产能够降低环境负荷,工艺流程更绿色环保。通过对一步酶法骨明胶结构和功能特性分析得出:一步酶法骨明胶与碱法骨明胶的氨基酸组成相似,含量较高的氨基酸是甘氨酸、亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）和丙氨酸,其含量约为氨基酸残基总量的2/3,分别占比约1/3、1/4和1/9,芳香族氨基酸和含硫氨基酸的含量较少且均不含色氨酸。其次,一步酶法骨明胶与碱法骨明胶的分子量分布相似,主要组成成分均为α1链、α2链和β链。第三,一步酶法骨明胶与碱法骨明胶的结构形态相似,均含有三螺旋结构与无定形区,在圆二色光谱（CD）、红外光谱（FTIR）和X射线衍射图谱（XRD）上各吸收峰的位置一致。第四,一步酶法骨明胶与碱法骨明胶具有相似的动态流变学特性（粘弹性和热稳定性）。一步酶法骨明胶与碱法骨明胶的相似性源自其具有相同的母本胶原（猪骨胶原）,但由于制备工艺的差异,胶原在转变为明胶的过程中胶原链的断裂位点和伸展程度不同,一步酶法骨明胶与碱法骨明胶氨基酸分布及空间构象不同,因而二者的等电点（酶法骨明胶的等电点为8.89,碱法骨明胶的等电点为4.84）、持水性持油性、起泡性泡沫稳定性、乳化性乳化稳定性存在差异。通过对酶溶胶原的一二三级结构分析得出:酶溶胶原三螺旋结构完整,即酶的作用位点不在三螺旋区。通过成纤维能力检测与肽段质谱鉴定得出:酶溶胶原端肽非螺旋区结构完整,则酶的作用位点不在非螺旋区而在共价交联处。在一步酶法制备骨明胶工艺中,胃蛋白酶水解掉共价交联键,胶原单链借助加热从胶原分子中分离进而形成明胶。一步酶法骨明胶和碱法骨明胶等电点差别成因:一是酶法骨明胶和碱法骨明胶空间构象上的差异;二是在长期浸灰过程中,骨素中大量的谷氨酰胺（pI=5.65）和天冬酰胺（pI=5.41）脱酰胺生成对应的等电点较低的谷氨酸（pI=3.22）和天冬氨酸（pI=2.97）,导致碱法骨明胶的等电点低于酶法骨明胶;三是酶法骨明胶中等电点较高的氨基酸暴露量高于碱法骨明胶,因而酶法骨明胶的等电点高于碱法骨明胶。最后,对一步酶法骨明胶的成膜特性研究发现,与目前市售的两种传统明胶（碱法胶、酸法胶）相比,谷氨酰胺转移酶（MTgase）修饰的一步酶法骨明胶具有较高的交联度,经MTgase交联后的一步酶法骨明胶明胶膜比其他两种明胶经MTgase修饰的明胶膜的网络结构稳定,机械强度高,具有沸水中不溶的特性。一步酶法骨明胶为MTgase改性制备水不溶性明胶膜提供了一个新的选择。此外,一步酶法骨明胶分子量分布窄,能够极大限度地复原胶原的三螺旋结构。通过kosmotropic离子SO42-辅助与机械形变诱导可构建出一种仿生胶原结构各向异性明胶膜。其中SO42-能够辅助明胶膜转变为高弹态,进而有助于机械诱导明胶膜内形成多级有序结构。该仿生胶原结构明胶膜的机械强度显着增加,抗张强度和韧性分别由原始明胶膜的89.20 Mpa、3.13 MJm-3增至220.71 Mpa、14.15 MJm-3。该明胶膜还具有较高的透明度和光的双折射现象,能够分离偏振光并调节偏振光的强度。
陈世化[4]（2020）在《Bacillus cereus MH19基因组分析及胶原酶分离纯化与重组表达》文中研究指明胶原酶是特异性作用于胶原蛋白、明胶的一类蛋白水解酶,它能够水解胶原蛋白的三维螺旋结构而不破坏其他蛋白与组织。微生物胶原酶来源主要是梭菌属、芽孢杆菌属和弧菌属菌株。商品化的胶原酶就是从溶组织梭状芽孢杆菌提取制备的。梭菌胶原酶Col G、Col H和产气荚膜菌胶原酶Col A的结构性质已得到充分表征,这三种胶原酶常作为研究酶学性质的模式酶。随着研究的深入,越来越多的产胶原酶菌株被分离筛选出来,不同来源的胶原酶结构与性质差异性大,表明胶原酶的结构和功能具有多样性。蜡状芽孢杆菌具有丰富的产酶系统,是产胶原酶优良菌株。本文围绕胶原酶进行研究,鉴定了一株产胶原酶菌株Bacillus ceueus MH19,通过测序获得了全基因组序列,从基因组挖掘胶原酶基因Col B用于大肠杆菌重组表达,通过常规的微生物培养、提取分离也获得了天然的胶原酶,并分别进行了酶活测定与评估,主要研究结果如下:（1）对分离自屠宰厂的产胶原酶菌株进行鉴定,用于后续全基因组测序及胶原酶基因筛选。通过据菌株培养观察、镜检、MYP培养和部分生理生化试验,结合16S r DNA序列比对分析,筛选鉴定出蜡样芽孢杆菌Bacillus ceueus MH19。（2）采用二代结合三代测序技术对Bacillus cereus MH19进行全基因组测序,基因组大小为5,534,899bp,GC含量为35.28%,由一条5,247,580bp的环状染色体和一条287,319 bp的环状质粒组成。预测染色体基因有5,335个,质粒基因253个,绘制了染色体圈图和质粒圈图。对基因组进行功能注释,GO功能注释主要有代谢过程、细胞过程和单组织过程,参与基因分别有1615、1465、1259个。COG共注释3879个基因,占全基因组序列的69.41%。COG功能注释主要有10.19%的基本功能预测、9.07%的转录、8.78%的氨基酸转运和代谢、6.80%的翻译,核糖体结构和生物合成,其次是5.55%的细胞壁/膜/包膜生物合成、5.68%的信号转导机制、6.30%的碳水化合物转运与代谢、5.24%的辅酶转运与代谢和5.61%的无机离子的运输与代谢。KEGG共注释2920个基因,占全基因组序列的52.25%。共线性、共有和特有基因、基因家族的比较基因组分析发现Bacillus cereus MH19的特异性主要体现在环境适应性,即适应环境能力得到了强化,其基因组含有特异基因家族18个及数量最多的特有基因944个。进化选择压力分析表明Bacillus cereus MH19基因组有36个正向选择基因,存在多个转录调节因子。这些调节因子对抗药性的产生、毒力基因的合成、DNA的复制和修复、细胞存活有积极调控作用。（3）B.cereus MH19基因组胶原酶基因的挖掘。通过GO、COG、KEGG、NR、SWISSPROT、IPR多重注释、比对,发现Bacillus cereus MH19基因组有5种不同的胶原酶基因,分子量分布范围35.7-110 k D。序列比对和系统发育树分析表明BCC000504、BCC003388胶原酶基因序列与典型胶原酶基因Col G、Col A、Col H更为接近,BCC003615次之。结构域与功能分析表明,胶原酶BCC000504、BCC003388与胶原酶Col G、Col A、Col H性质较为相似,BCC004271与BCC004272类似,BCC003615可能与其余胶原酶性质有较大差异。对胶原酶的结构进行分析并以溶组织梭菌胶原酶G晶体结构为模板对BCC000504三维结构进行建模,建立的BCC000504胶原酶三级结构模型是可接受的蛋白模型。三级结构模型的建立有助于从分子水平上了解胶原酶的作用机制。将BCC000504命名为Col B,用于大肠杆菌原核表达。（4）研究了Bacillus cereus MH19发酵液中天然胶原酶的分离纯化及酶学性质。采用分步纯化,经硫酸铵沉淀、离子交换柱层析及凝胶层析纯化得到胶原酶BCC,分子量为110 k D,酶活为257.20 U/mg,提纯倍数为6.07,得率为9%。BCC酶的最适温度为37℃,最适p H为7.5。Ca2+对酶活有促进作用,Mn2+、Fe2+、Zn2+、Pb2+、Cu2+对酶活有抑制作用。EDTA、EGTA可抑制胶原酶的酶活性,表明BCC为一种金属蛋白酶。BCC对I型胶原有特异性,属于I型胶原酶。（5）研究了胶原酶Col B在大肠杆菌中的原核表达。从Bacillus cereus MH19基因组挖掘得到Col B基因序列,优化、改造后构建表达质粒p ET30a-Col B,转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,Ni-IDA亲和层析柱纯化后获得了纯度较高的重组Col B,SDS-PAGE及Western Blot分析表明重组Col B分子量为110 k D。胶原酶谱法结果表明重组Col B具有胶原酶活性,能够水解Ⅰ型胶原,测得的胶原酶活性为200.76U/mg。重组胶原酶Col B与提取的天然胶原酶分子量均为110 k D,对I型胶原有特异性,两者可能为同一种酶。
张玲[5]（2020）在《罗非鱼皮胶原降解反应行为及肽钙螯合物制备研究》文中进行了进一步梳理罗非鱼加工过程中会产生大量的鱼皮,其含有大量的蛋白质,具有较高的利用价值。本文以罗非鱼新鲜鱼皮为原料提取胶原,采用酸热处理降解生成明胶化胶原,并开展了明胶化过程的系统研究;为解决含鱼明胶体系中胶原蛋白肽含量测定的诸多问题,对双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法进行了改良及应用评价;对一种来自于枯草芽孢杆菌的碱性胶原蛋白酶进行了分离纯化、酶学性质及结构模拟研究,并采用磺化聚苯乙烯（sulfonated polystyrene,SPS）纳米粒子固载胶原蛋白酶;以固定化酶水解罗非鱼皮明胶化胶原制备胶原蛋白肽为研究体系,基于蛋白质结构知识和3-D模型解析了多组分复杂体系的动态降解行为;以酶解得到的胶原蛋白肽为原料制备了肽钙螯合物,优化了螯合工艺,研究了螯合物的稳定性,并采用Caco-2细胞模型评价了螯合物体外促钙吸收作用。具体研究结果如下:（1）以罗非鱼新鲜鱼皮和鱼鳞为原料,通过纤维组织观察发现罗非鱼皮中主要为Ⅰ型胶原;采用单纯醋酸提取及胃蛋白酶辅助醋酸提取两种方法制得了鱼皮、鱼鳞酸溶性胶原（ASC）及酶促酸溶性胶原（PSC）,对产物进行了系统表征及性质对比分析。结果表明:鱼皮ASC和PSC的纯度分别为85.69%、72.88%,鱼鳞ASC和PSC纯度分别为70.35%、73.92%;产物氨基酸组成中含量最多的是甘氨酸,分别为20.85%、21.01%、21.16%和19.21%,符合胶原蛋白的一级结构特征;鱼皮和鱼鳞ASC、PSC的紫外最大吸收分别在234 nm、222 nm、236 nm、226 nm处,符合胶原特征;鱼皮和鱼鳞ASC、PSC的热收缩温度分别约为89.0℃、81.3℃、74.0℃、70.7℃;FT-IR表明四种胶原产物皆保留了天然的三螺旋结构;高效凝胶色谱（GPC）测得鱼皮ASC和PSC、鱼鳞ASC和PSC的重均相对分子质量分别为139570 Da、20891 Da、131909 Da、20428 Da,从分子量大小及分布来看,鱼皮ASC最接近于天然胶原,在医用及保健食品领域具有更好的应用价值。（2）以罗非鱼皮酸溶性胶原（ASC）为原料,用酸法诱导其明胶化并用热水提取明胶。采用红外光谱、圆二色谱、SDS-PAGE电泳、DSC热稳定性分析对胶原明胶化过程进行研究。结果表明:不同酸处理时间后的明胶化胶原产物的红外光谱在1460～1230cm-1附近吸收峰的尖锐度明显降低,判定胶原三螺旋结构逐渐发生解旋;酸处理4 h时胶原明胶化程度较高,明胶提取率可达到77.41%;DSC与SDS-PAGE电泳分析结果显示,酸处理造成胶原三螺旋结构的解旋和高分子亚基的降解,酸处理的前4 h内这两个过程处于平衡阶段,4 h后以高分子亚基降解过程为主,因此,确定酸处理时间少于4 h可获得较高品质的明胶。（3）以罗非鱼皮胶原蛋白肽为对照品,改良双缩脲比色法测定肽含量的操作方法,探讨了本体系中显色络合物最大吸收波长、线性拟合度高的肽和三氯乙酸（TCA）浓度范围、p H;在最优条件下对标准曲线进行了重复性、精密度评价以及加样回收率的实验并进行了应用评价。结果显示,当胶原蛋白肽（标称分子量3 KDa）质量浓度在0.3～1.5mg/m L范围内,使用13%TCA,p H 12.5,在545 nm处检测,吸光值与肽质量浓度线性拟合好（R2=0.999）;重复性和精密度试验得到RSD分别为1.86%和1.84%,加样回收率分别为113.9%、109.7%,RSD分别为1.39%、1.00%;线性范围宽、重复性好、准确度高。将本法应用于不同种类罗非鱼肽产品体系的检测,加样回收率相差小,偏差较小,说明本法简便、快捷,适用于罗非鱼源肽含量的检测。（4）对一种来自枯草芽孢杆菌的酶制剂进行了分离纯化、酶蛋白结构鉴定及酶学性质研究。结果表明,纯化工艺可使酶比活力提高到608.17 U/μg;其分子量约为31.0 KDa;质谱鉴定得到该酶的氨基酸序列并模拟得到1个蛋白质三维结构,推测该酶可能属于枯草杆菌蛋白酶家族成员。在鱼皮胶原蛋白水解体系中,酶最适反应温度为60℃,最适反应p H为7.4;在低于40℃下具有良好的热稳定性,在p H 5.0-7.0范围内具有良好的酸碱稳定性;米氏常数为88.22 mg/m L,催化效率为26.37 m L·mg-1·min-1;Al3+、Fe3+、Fe2+、Pb2+、Ba2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+对酶有不同程度的抑制作用,巯基乙醇与乙二胺四乙酸（EDTA）能够使其酶活性下降至60%左右,乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）能够使该酶完全失活。采用SPS纳米球固载酶的最优条件为:SPS纳米球乳液与酶液的体积比为3:50（m L:m L）、固载温度为25℃、固载体系p H为4.5;在此条件下,胶原蛋白酶的固载率为73.48%,比活力为274.05 U/μg;固定化酶比活力约为游离酶比活力的53.74%。（5）为展现罗非鱼皮明胶化胶原在固定化碱性蛋白酶降解作用下的酶解行为及结果,基于高效凝胶色谱（GPC）和液质联用（HPLC-MS/MS）检测手段,结合生物信息学知识,运用计算机模拟及图像处理技术,绘制了可表征酶解反应过程动态特性的3-D图,拟合得到了酶解动力学方程,验算得知模型的平均相对误差为5.72%;以抗氧化能力作为评价依据,对水解180 min时的酶解物进行了质谱测序研究,鉴定得到10个片段,并采用Chem Draw19.0-Chem3D软件对肽片段分子结构进行了预测。（6）以标称分子量分别为1 KDa、3 KDa、5 KDa的罗非鱼皮胶原蛋白肽粉和无水氯化钙为原料,研究肽钙螯合物制备工艺的优化。采用响应面试验法优化螯合工艺条件结果表明,最优条件为p H7.00、温度40℃、肽钙质量比7:1、时间30.00 min,此条件下钙螯合率为39.5%±0.5%。对产物进行傅里叶红外光谱、扫描电镜和能谱表征分析以及稳定性评价,结果显示,钙离子被成功螯合;肽钙螯合物在高温下不稳定,温度越高钙结合量下降越快;在酸性环境下易于解离,酸性环境影响比碱性环境大;在与乳糖及氯化钠共存的环境中较为稳定;胃蛋白酶及胰蛋白酶会分解肽钙螯合物,且胰蛋白酶的影响作用比胃蛋白酶大;采用Caco-2单层细胞模型体外评价了肽钙螯合物对钙促转运的作用,发现螯合物浓度在3 mg/L以上时具有良好的促钙转运效果;当3 h时,7 mg/L肽钙螯合物对钙的促转运能力达到2.52μg/mg,促钙吸收率为41.04%,优于罗非鱼皮蛋白肽（Val-Gly-Leu-Pro-Asn-Ser-Arg）钙螯合物,弱于鳕鱼皮胶原蛋白肽（Ala-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Arg）钙螯合物。
李雪[6]（2020）在《质谱鉴定中药阿胶的胶原蛋白和糖胺聚糖及研究糖胺聚糖与趋化因子的相互作用》文中进行了进一步梳理胶类中药是动物类中药的重要组成,其中阿胶（Colla Corii Asini,CCA）的生产规模和市场销量都处于领先。CCA的药理作用主要为改善代谢平衡、滋阴补血和调节免疫功能。CCA中的生物大分子主要为蛋白质和糖胺聚糖（Glycosaminoglycan,GAG）,目前对于CCA的研究还不够全面,因此本论文的第一个目标是研究CCA中生物大分子的结构,研究皮样和胶样中蛋白及糖胺聚糖的组成,建立相关的质谱分析方法。GAG与蛋白的相互作用在生物体内发挥重要功能。在CCA研究中我们对蛋白序列和GAG糖单元进行了分析,但GAG和蛋白的相互作用研究需要更复杂的质谱分析方法和其它新的技术。通过CCA建立的质谱分析方法可对蛋白和GAG进行初步的分析,而对于复杂的糖蛋白混合物的序列长度、糖基化种类、糖链、糖基化位点的定性及定量还需要在其基础上进一步的方法开发。因此本文的剩余篇幅聚焦于复杂度更高的糖蛋白异型体的分析方法开发以及结合生物膜干涉技术（Bio-layer Interferometry,BLI）和亲和柱技术的GAG与趋化因子的相互作用研究。GAG与趋化因子的相互作用与多种生理病理过程相关,我们选择趋化因子5（Chemokine ligand 5,CCL5）作为模式分子建立相关分析方法。CCL5是趋化因子家族的一种。趋化因子是指一些低分子量（6-14kDa）的碱性蛋白,因其定向趋化吸引白细胞迁移到感染部位而在炎症反应中具有重要作用。CCL5又称调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子（Regulated on activation normal T cell expressed and secreted,RANTES）,从属于CC类趋化因子亚族（β类趋化因子）。CCL5与其受体结合,可以抑制HIV病毒进入细胞。但是由于CCL5同样影响炎症作用,因此药物设计一般希望通过调控CCL5的修饰改变炎性作用,并且不影响其抑制病毒进入的作用。CCL5与GAG的结合,是CCL5形成趋化因子梯度,发挥趋化性质的先决条件,同时也是CCL5与受体发生相互作用的前提。因此,对CCL5与GAG相互作用的研究具有重要意义。我们首先建立质谱分析方法了解人体内天然CCL5的结构及组成,然后合成15种不同截短型与糖基化修饰的CCL5异型体,开发相应的定性及定量质谱分析方法,最后应用此分析方法研究不同CCL5与GAG在不同情况下的相互作用,探究并解释相互作用的机理。本论文的主要研究成果如下:1.建立了一种CCA来源鉴定的方法对CCA的主要蛋白进行分析,并建立了 CCA来源鉴定的方法。通过鸟枪法蛋白组学研究不同物种驴马牛猪的皮样蛋白,确定主要蛋白为胶原蛋白,通过羟基化修饰搜索对应物种的数据库,发现胶原蛋白是严重羟基化的。选择主要成分胶原蛋白作为研究对象,通过生物信息学比较不同物种的I型胶原蛋白序列,以推测每种物种理论的特征序列。对皮样的酶解样品进行质谱分析,提取理论特征序列的母离子,根据筛选条件确定每个物种的特征肽,并在胶样样品中提取到了对应的特征肽,从而确证特征肽的可行性。合成对应的特征肽并建立对应特征肽检测的多反应监测（Multiple Reaction Monitoring,MRM）方法,提高了方法灵敏度,并通过分析掺假样品和商品CCA进行了方法确证及应用。最终通过此方法可以检测到掺假0.5%的CCA,并且可以使用此方法特异性地区分驴、马和杂交物种骡子,从而排除其掺假的可能性。2.分析了驴皮降解过程中糖胺聚糖的变化将驴皮和CCA水解物脱脂后进行蛋白酶解,将大部分蛋白除去,然后通过阳离子交换柱收集GAG,使用肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和CSABC酶将提取的GAG完全酶解为二糖,建立二糖的LC-MRM-MS/MS方法,将标准品和样品的二糖提取离子峰的峰面积积分,得到驴皮和CCA中的二糖组成及含量。我们对于驴皮制作为CCA的过程中GAG的作用有了基本的了解,发现硫酸皮肤素相对于硫酸乙酰肝素来说在CCA中含量多且稳定性强,推测其对于CCA的功效可能起到更重要的作用。3.人血浆中CCL5的富集及分析方法文献报道CCL5存在两个可能的O-糖基化位点及1-68,3-68,4-68三种不同的肽链长度,因此我们建立方法鉴定人血浆中天然CCL5的形式。血浆中CCL5的含量极低,因此首先使用自制CCL5的多抗琼脂糖凝胶亲和柱,富集人血浆中的CCL5,并进行质谱分析。最终我们鉴定到三种不同氨基酸长度的CCL5形式。而对于血浆中CCL5是否存在O糖基化,使用自制VVA凝集素亲和柱将样品中的O-GalNAc糖肽富集,并加入理论蛋白量的5%的内标同位素糖肽,最终通过质谱鉴定到加入的内标糖肽,验证了方法的可行性,但是没鉴定到糖基化CCL5的相关糖肽,说明人血浆中CCL5的糖基化形式低于5%。后续可以使用此方法分析CCL5含量较多的生物样品,从而对CCL5糖基化结构进行表征。4.建立CCL5异型体结构的定性定量方法由于人血浆中的CCL5的含量极低,因此根据CCL5的结构形式,设计并化学合成了 15种糖基化CCL5,包括不同氨基酸长度,不同糖基化和不同糖基化位点等差异。鉴定15种CCL5异型体的难点在于其中存在6组只有糖基化位点不同的同分异构体,由于这6组同分异构体的细小差异,色谱柱无法实现区分,而电子转移裂解（Electron Transfer Dissociation,ETD）碎裂可以保留糖链的完整性,在Ser4和Ser5之间产生特征的c/z碎片离子,从而鉴定位点差异的同分异构体。选择外标法作为定量方法,首先通过高能碰撞诱导（Higher Energy Collision Induced Dissociation,HCD）碎裂确定蛋白序列,根据m/z的不同将一级质谱信息分为9组,然后将其中质量相同的6组采用ETD碎裂方式通过特征碎片离子定量。因此我们结合质谱的HCD和ETD碎裂方式进行了全部CCL5异型体的鉴定和定量,从而建立了区分微小差异的同分异构糖蛋白的方法。将此方法首先用于CCL5-1和CCL5-7混合物过肝素柱后的洗脱液分析。CCL5-1是1-68序列长度且非糖基化的CCL5,CCL5-7是3-68序列长度且Ser4带GalNAc的,因此实验结果表明不同结构的CCL5与肝素的相互作用是有区别的,这为后续研究建立了基础。5.探究了 CCL5与肝素的相互作用及机理为了探究单类CCL5与肝素的相互作用,使用BLI,利用光的干涉原理,分析每种CCL5与肝素的相互作用,测定不同的KKD值。根据BLI的测定原理,KD值越小的相互作用越紧密,亲和力作用越大。将CCL5结构与KD值结合分析,结果表明,对于三个非糖基化异型体的形式,当两个氨基酸残基被截短时,结合亲和力略有降低,而如果再缺少一个氨基酸残基,则结合亲和力略有增加,说明截短与否对亲和力影响不大。Ser-5位置比Ser-4位置更为关键。在聚糖结构方面,与单糖残基相比,二糖残基通常对肝素结合具有更明显的影响。使用分子模型软件对CCL5-11、CCL5-14和CCL5-15与肝素八糖进行了分子对接模拟,发现Ser5和二糖糖基化通过影响CCL5与肝素的结合位点及结合碱性氨基酸的个数,从而影响了其相互作用的强度。为了探究混合情况下CCL5与肝素的相互作用,将不同CCL5混合过肝素亲和柱,收集出峰时的洗脱液,使用开发的分析方法进行定性定量,通过每个CCL5的洗脱量的不同,结合其结构分析,结果显示,不同的氨基酸序列改变,不同位置和种类的糖基化修饰,会对肝素亲和力产生各种不同的影响。同时,在不同组合中,各个异型体的相对亲和力保持一致。这表明某种修饰对CCL5异型体与肝素亲和力强度的排序是稳定的,不受不同的混合物组成的影响。但是由于其它异构体的影响,混合物中某类CCL5的亲和力与单类异构体的作用结果是不一样的。不管是单独结合还是混合结合,CCL5的Ser5糖基化位点带二糖的糖基化修饰对于CCL5与肝素相互作用的性质影响较大且稳定性较好,这些结果为我们提供了有关如何通过专门设计糖基化异型体来改变CCL5的生物活性的指导。综合本论文,我们首先建立质谱分析方法研究中药CCA的胶原蛋白和GAG,开发了 CCA来源鉴定的特征肽方法（已由山东省食品药品检验研究院申请中国药典的CCA补充检验方法）,可以鉴定掺假0.5%的样品且区分驴、马和骡。然后,我们对CCA中的GAG糖单元进行了组成及含量分析。GAG和蛋白的相互作用与生物体内多种生理过程相关,我们选择肝素与CCL5的相互作用进行研究。首先使用CCA建立的质谱分析方法分析了人血浆中天然的CCL5。由于天然CCL5含量太低,为了分析复杂的糖蛋白混合物及研究GAG与CCL5的相互作用,我们合成了 15种存在序列长度、糖链和糖基化位点差异的CCL5异型体,并在CCA鉴定中积累的序列和糖单元分析方法基础上进一步开发了 CCL5异型体混合物的分析方法。通过BLI测定肝素与每种CCL5的亲和常数,采用开发的质谱分析方法对CCL5不同混合形式过肝素柱的洗脱液定性定量。综合BLI分析结果,我们发现Ser5带二糖这个结构对CCL5与肝素的相互作用影响较大。
李雨欣[7]（2020）在《昆虫受体氨肽酶-N仿生聚合物纳米颗粒的设计及对Bt蛋白的选择性识别》文中研究指明苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是一种作用于易感昆虫中肠的革兰氏阳性菌,在其芽孢形成过程中能产生对昆虫幼虫具有高毒力和高特异杀虫活性的蛋白质伴胞晶体,即Bt蛋白。Bt蛋白具有杀虫活性频谱广,效应强等优点,已被广泛用于抗虫转基因作物的培育和生物杀虫剂的生产。Bt蛋白的使用尽管实现了农作物的增产增收,但是其在环境中的残留也带来了潜在生态环境风险问题,引起了社会的广泛关注。因此,研发一种对Bt蛋白具有特异性识别、提取、分离和纯化效果的分子识别材料对Bt蛋白的迁移、转化和残留研究是很有必要的。聚合物纳米颗粒由于合成简单,条件可控,且具有粒径小、比表面积大和生物相容性好等优点,已被广泛用于生物大分子的分离、纯化和检测以及生物毒素的捕获和去除。Bt蛋白杀虫机理研究表明,斜纹夜蛾中肠受体氨肽酶-N（APN）是通过其受体表位128HLHFHLP134（HP-7）与Bt Cry1C蛋白结合在一起的。因此,本研究模拟了Bt Cry1C蛋白与APN之间的分子识别机制,将受体结合位点代表的多肽HP-7丙烯酰胺化,以其作为功能单体,丙烯酰胺（AAm）、异丙基丙烯酰胺（NIPAm）和叔丁基丙烯酰胺（TBAm）为共存单体,通过调节多肽单体和共存的其它单体的种类和配比来控制聚合物纳米颗粒的亲水性、疏水性和电荷性,使其与Bt蛋白抗原决定簇之间具有互补的多重相互作用,从而显示出昆虫受体APN的仿生特点,实现对Bt蛋白的选择性识别。完成的工作主要包括:合成并筛选出对Bt蛋白具有最佳亲和力的聚合物纳米颗粒;对影响Bt蛋白吸附效果的因素进行优化;对聚合物纳米颗粒的吸附热力学、动力学和选择性等进行了评价;对聚合物纳米颗粒与Bt蛋白之间的相互作用机理进行了探讨,并与本实验室前期筛选出的两种聚合物纳米颗粒APhe-NP2和NK-12-NP4进行了比较,得到的主要结果如下:1. 从聚合物纳米颗粒文库中筛选出对Bt Cry1C蛋白具有最佳亲和力的聚合物纳米颗粒为NP3（20%HP-7,38%AAm,40%TBAm,2%BIS）,优化出最佳吸附条件为p H 8.0 10 m M的PBS缓冲溶液。2. 选择性吸附实验表明,聚合物纳米颗粒NP3对研究的几种常规蛋白几乎没有亲和效果,对Bt Cry1C蛋白尽管具有较高的亲和力,但是其吸附容量远远小于BtCry1F和Bt Cry1Ac蛋白。进一步的实验证实,对Bt Cry1F蛋白具有最佳亲和力的聚合物纳米颗粒仍为NP3,最佳吸附条件仍为p H 8.0 10 m M PBS缓冲溶液。这些结果表明NP3对Bt Cry1F和Bt Cry1C蛋白的吸附机理是相似的。Bt Cry1F蛋白在NP3表面的最大理论吸附容量可达646.4mg/g,且20 min内即可达到吸附平衡。3. Bt Cry1F胃蛋白酶酶解液吸附实验结果显示,胃蛋白酶酶解液中的部分多肽片段被NP3吸附后色谱峰信号明显减弱。这些多肽片段可能就是NP3与Bt Cry1F蛋白,以及Bt Cry1F蛋白与斜纹夜蛾受体APN结合的潜在作用位点,其氨基酸序列还有待鉴定。4. Bt Cry1Ac抗原决定簇及突变多肽吸附实验结果显示,APhe-NP2和NK-12-NP4对Bt Cry1Ac蛋白中自然存在的三段多肽RQ-12、FR-14和TS-14均具有非常高的亲和力,由于RQ-12在Bt Cry1Ac蛋白晶体结构中处于Domain II的顶端,其位阻更小,因此RQ-12在Bt Cry1Ac蛋白与聚合物纳米颗粒的结合中可能作用更显着。比较聚合物纳米颗粒对RQ-12、TS-14及其突变多肽的吸附结果,我们发现静电和氢键作用对Bt Cry1Ac蛋白与APhe-NP2和NK-12-NP4的结合起着至关重要的作用,而多肽是线性还是环状结构对其与聚合物纳米颗粒的亲和能力影响不大。聚合物纳米颗粒NP3与Bt Cry1Ac蛋白之间的结合机理与APhe-NP2和NK-12-NP4是不同的,该聚合物纳米颗粒对Bt Cry1Ac中天然存在的RQ-12、FR-14和TS-14的亲和力明显低于APhe-NP2和NK-12-NP4,这主要是因为NP3侧链中引入的HLHFHLP含有三个带正电荷的组氨酸,而RQ-12、FR-14和TS-14中也含有多个带正电荷的氨基酸残基,这些正电荷基团之间的静电斥力可能是导致其结合力弱的主要原因,其具体的结合位点还需要通过其它研究手段进一步分析。
吴宇辰[8]（2020）在《用于药物高效负载和肿瘤特异性药物递送的聚合物纳米载体及其抗肿瘤治疗研究》文中研究指明恶性肿瘤是当前威胁人类生命的头号杀手。近几十年来,纳米医学的蓬勃发展为癌症的治疗提供了新的方法和途径。纳米药物具有诸多优势,例如提高药物溶解性、延长血液循环时间、增加肿瘤部位的药物富集和滞留、减少药物毒副作用等。然而,小分子化学药物、大分子蛋白质药物的高效包载、胞内递送以及肿瘤特异性释放仍然面临着诸多挑战,例如:（1）小分子化疗药物疏水性强,纳米载体的载药量和包封率往往不够理想;（2）不同的化疗药物具有不同的理化性质,其药代动力学和生物分布也不尽相同,如何实现不同药物的高载药量联合包载和药物配比的精准调控也是目前面临的一大难题;（3）蛋白类药物体内不稳定,分子量和等电点差异大,无法透过细胞膜进入细胞,因此亟待开发通用的递送载体实现不同蛋白类药物的高效包载和胞内递送;（4）药物释放缺乏选择性,难以实现病灶组织、病灶细胞中的精准、定点释放,无法充分发挥药物功效,易造成非特异性毒副作用。本论文针对上述关键问题,通过向高分子递送载体和药物分子间引入多重相互作用,实现化学药物/蛋白药物的高效、稳定包载和肿瘤细胞内选择性释放,显着提升药物的体内外抗肿瘤功效。本文第一章对传统抗肿瘤药物（化疗药物与蛋白类药物）、纳米药物、响应型纳米药物载体及蛋白递送体系的相关现状进行概述。本文第二章发展了疏水嵌段侧链末端含有苯硼酸的两亲性纳米胶束,通过聚合物上苯硼酸基团与化学药物上氨基间的供体-受体配位作用实现阿霉素（DOX）和伊立替康（IR）的超高载药量和组分精准可控的联合负载,用于癌症的协同治疗。该共载药纳米胶束粒径可控（30-40 nrn）,DOX和IR载药量高（高达50%）、包封率高（大于95%）,两种药物含量精准可调。在肿瘤细胞内高水平活性氧自由基（ROS,100 μM H2O2）刺激下苯硼酸基团被氧化,疏水嵌段转变为亲水性,纳米胶束解离,从而快速、特异性地释放药物。小鼠Lewis肺癌细胞和体内Lewis肺癌模型中,共载药胶束具有优异的协同抗肿瘤功效和较低的全身毒性。本文第三章发展了磷酸化修饰的蛋白质前药和胍基修饰的α-螺旋阳离子聚多肽（LPP）,利用聚多肽与蛋白质前药间的电荷作用和盐桥作用构建纳米复合物,实现蛋白质药物的高效包载和胞内递送,用于蛋白质抗肿瘤治疗。利用苯硼酸和ATP对蛋白质的赖氨酸残基进行修饰,获得磷酸化的蛋白质并增加表面负电荷密度。磷酸化的蛋白质与LPP通过静电及盐桥相互作用自组装成稳定的、粒径为100-200 nm的纳米复合物。LPP的α-螺旋结构以及阳离子性质可显着促进蛋白质的跨膜细胞摄取,其细胞摄取效率比游离蛋白质提高约23倍。在肿瘤细胞的酸性环境和高浓度H2O2（100μM）刺激下,蛋白质表面的苯硼酸及ATP基团脱落、蛋白质活性可逆恢复。该策略可实现不同分子量、等电点蛋白质（RNase、BSA和Cytochrome C）的可逆修饰,并经LPP介导实现高效的胞内递送。以RNase为模型蛋白,在多种肿瘤细胞（MCF-7、B16F10、HeLa）中具有优异的体外抗肿瘤功效,同时经瘤内注射后在小鼠黑色素瘤模型中具有良好的抑瘤功效。第四章对本文的工作进行总结,并提出了需继续开展的研究。
郭瑞峰[9]（2021）在《人源化半合成纳米抗体文库的构建及CD47纳米抗体的研制》文中研究表明纳米抗体源自驼类和鲨鱼等软骨鱼类动物体内天然缺失轻链的重链抗体,由其可变区VHH克隆而来。作为结合抗原最小的功能性片段,纳米抗体比完整的传统抗体分子结构简单、稳定性高,分子量仅为其十分之一,具有很强的组织穿透能力,且易于进行基因工程改造,因此在各类生物技术以及医学疾病的诊断和治疗等领域应用前景广阔。而CD47分子作为免疫球蛋白（Ig）超家族的成员在针对肿瘤分子的免疫识别中代表着“别吃我”的信号,即,肿瘤等细胞表面的CD 47分子与巨噬细胞上的蛋白配体SIRP α结合后可抑制后者吞噬功能的发挥,进而逃避了免疫监视作用;而解除此抑制则可重新唤醒“沉睡中的”巨噬细胞,对其进行免疫清除。因此,CD47分子也被赋予免疫检查点的使命,成为肿瘤免疫治疗领域的又一个潜在靶点;而能够阻断CD47-SIRP α通路的靶向药物则有望成为继PD-1、PD-L1阻断药后肿瘤免疫治疗领域的又一热点。本研究立足于纳米抗体的噬菌体展示技术,首先在人源化半合成纳米抗体文库的构建方法方面进行探讨,尝试了一种绕过酶切环节,仅需一步PCR反应即可完成VHH抗体库基因构建的策略;随后以真核表达的CD47抗原分子为靶标,经过对抗体库的若干轮生物淘选来得到VHH噬菌体抗体克隆;再利用大肠杆菌表达系统对VHH片段进行原核分泌表达,并在毕赤酵母中进行了初步的表达尝试;最后通过流式细胞术对VHH的免疫阻断活性进行了检测。第一部分在人源化半合成纳米抗体文库的构建方法方面进行了探讨。本章节采用报道中性质优良的cAbBCII10纳米抗体序列作为基础框架,并将其中FR2区域外的相关氨基酸残基在设计时通过替换处理来实现人源化操作。然后在此框架的基础上通过长引物PCR法引入CD3区随机序列,并对此种策略构建抗体文库的效率及可行性进行了印证。研究中发现,此法仅需通过一步PCR反应即可完成人源化半合成VHH抗体库基因的拼接构建,回收产物连接后即可用于转化,库容多样性良好,每批电转操作后平均可达1.21×108,减少了基因拼接环节的工作强度以及回收步骤过多所造成的损失,提高了工作效率。本章节的研究为纳米抗体文库的构建提供了新的思路和技术路线。第二部分利用真核表达系统对生物淘选过程及后继检验阶段所需的相关抗原进行了制备。本章节用扩增抽提的含有CD47Fc、SIRP α-Fc及CD47his基因的高纯度无菌、无内毒素真核表达质粒对293Fv悬浮细胞株进行转染,成功实现了三种抗原蛋白的真核表达,亲和层析纯化后进行检测,所获得的每种抗原均达到了毫克级别,为后继的淘选及检测实验做好铺垫工作。第三部分进行了针对CD47抗原的生物淘选、单克隆鉴定及亲和力测定等方面的研究。本章节利用VHH纳米抗体库对CD47固相包被抗原进行了4轮的淘选,富集效应明显,第三轮即进入到平台期。随后挑选单克隆进行检验,阳性克隆测序后通过序列比对分析得到了五个针对CD47胞外区抗原的VHH纳米抗体序列。其中四个序列高度相似,仅在框架区有个别氨基酸残基上的差异,而第五个序列则与前四个差异较大。经亲和力实验测得这两类VHH的Kd值分别为1.5×1010 mol-1和7.5×109 mol-1。本章研究结果为后继的VHH纳米抗体的表达做好铺垫工作。第四部分对获得的VHH纳米抗体进行了表达、纯化及免疫阻断活性等方面的研究。本章节通过突变PCR将淘选到的阳性噬菌体展示克隆一步改造成分泌型原核表达载体,随后对VHH纳米抗体的可溶性分泌表达进行了分析。研究过程中对培养基类型、培养温度、VHH分泌表达的分布空间等方面进行了探讨,发现大部分VHH以可溶形式表达,表达空间分布在两类VHH间差异较大,渗透休克法进行周质提取或破菌后取上清是较为优选的策略。另外,本章节还采用了毕赤酵母分泌型表达载体对VHH的分泌表达进行了初步的尝试,见证了在信号肽的导引下,VHH抗体分子可被分泌至培养基中,表达量可观且培养基中杂蛋白背景很少,体现了酵母表达系统在VHH表达方面的优势。本章节最后对大肠杆菌分泌表达的VHH纳米抗体进行了针对CD47-SIRP α通路的免疫阻断实验,显示出其中一个VHH序列具有一定的免疫阻断活性。本章节的研究为实现VHH纳米抗体在大肠杆菌中的可溶性分泌表达提供了新的可行的方法和思路。综上所述,本论文探索了一种较为便捷、高效的人源化半合成VHH纳米抗体文库的构建方法,绕开了传统的动物使用环节,所建库容多样性良好,每个电转批次库容均可达到108以上;在制备真核表达的靶点抗原基础上,本论文通过噬菌体纳米抗体展示库技术经生物淘选得到了 5个针对CD47抗原的的VHH纳米抗体序列,经亲和力分析属于高亲和力抗体;随后采用大肠杆菌表达系统对VHH片段进行原核分泌表达,对培养条件及纯化策略进行了探讨并在毕赤酵母中进行了初步表达尝试;最后通过流式细胞术对VHH的免疫阻断活性进行了检测,确定了一株具有阻断活性的VHH纳米抗体,为后继进一步的应用开发打下基础。
邓叶俊[10]（2020）在《皱皮木瓜籽活性物的分离、结构特征及生物活性研究》文中研究表明皱皮木瓜（Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai.）果实富含多酚、多糖、有机酸、超氧化物歧化酶、皂苷等营养活性成分,其药用、保健价值不断被发掘。随着市场需求的日益增加,皱皮木瓜的种植规模不断扩大。皱皮木瓜籽作为皱皮木瓜主要加工剩余物,含有丰富的油脂、多糖和蛋白等营养成分,但目前尚未得到充分利用。本文以皱皮木瓜籽为原料,研究了皱皮木瓜籽油的品质和营养组成。利用喷雾干燥法将皱皮木瓜籽油微胶囊化,研究了油脂微胶囊的理化性质及其对油脂贮藏稳定性的影响。从脱脂皱皮木瓜籽粕中分离纯化得到高纯度的多糖组分,鉴定了结构特征,并对其生物活性进行了评价。从脱壳皱皮木瓜籽中分别制备得到分离蛋白和主要的分级蛋白,测定了各蛋白组分的氨基酸组成、理化性质和功能特性。利用木瓜蛋白酶水解皱皮木瓜籽分离蛋白,得到具有高酪氨酸酶抑制活性的多肽,测定了多肽的序列,评价了多肽的抗氧化活性及金属离子螯合性能,并通过分子对接技术研究了多肽与酪氨酸酶可能的对接模型。这些工作为皱皮木瓜籽的高值化利用提供了新思路,具体的研究内容及结果如下:皱皮木瓜籽油脂含量高,可作为特种木本油料资源加以开发利用。在单因素试验基础上,进行正交优化试验,确定以石油醚提取皱皮木瓜籽油较优的工艺条件为:料液比1:4（g:m L）、提取温度60℃、提取时间150 min。在该条件下皱皮木瓜籽油的得率达28.5%。皱皮木瓜籽油的酸值和过氧化值等指标达到食用油脂的标准。利用气相色谱-质谱联用法鉴定出皱皮木瓜籽油含12种脂肪酸,主要组成为油酸（42.7%）、亚油酸（32.5%）、棕榈酸（12.9%）、硬脂酸（4.8%）和花生酸（3.3%）,不饱和脂肪酸达77.6%。此外皱皮木瓜籽油含有丰富的多酚和维生素E,具有较高营养价值。通过测定1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基和羟自由基清除能力来评价皱皮木瓜籽油的抗氧化活性,木瓜籽油对DPPH自由基和羟自由基的IC50分别为8.51、0.396 g/L。皱皮木瓜籽油富含不饱和脂肪酸及多酚等易氧化活性成分,为减少油脂营养流失,研究了喷雾干燥法制备皱皮木瓜籽油微胶囊。在单因素试验基础上,利用正交试验确定了喷雾干燥法制备皱皮木瓜籽油微胶囊的较优工艺为:均质压力30 MPa,进风温度190℃,进料速率16 m L/min。在该条件下制备得到的微胶囊产品包埋率达83.59%,水分为2.51%,密度为0.63 g/cm3,吸水性为9.19%,粒径为39.44μm。微胶囊产品的SEM电镜结果显示,微胶囊产品呈球形,表面完整光滑,微胶囊结构致密。在贮藏稳定性试验中,室温贮藏下第18个月时,微胶囊包埋的皱皮木瓜籽油过氧化值仅为5.7 mmol/kg,散装油脂的过氧化值达40.2 mmol/kg。喷雾干燥法制备的微胶囊产品性能优异,大大延长了皱皮木瓜籽油的货架期。脱脂后的皱皮木瓜籽粕多糖含量高,为了更好利用这一自然资源,研究了粗多糖的提取工艺及纯化后多糖的理化性质。在单因素试验基础上,利用正交试验确定了水提醇沉法制备皱皮木瓜籽多糖的较优工艺为:提取温度70℃,提取时间3 h,料液比为1:40（g:m L）,在该条件下粗多糖得率可达到7.46%。依次使用DEAE-52纤维素柱层析和Toyopearl HW-65F凝胶柱层析法对粗多糖进行纯化,得到高纯度多糖F3组分。通过高效凝胶渗透色谱（HPGPC）、高效液相色谱（HPLC）、紫外光谱（UV）,红外光谱（FT-IR）测定了F3的理化性质。结果表明F3是一种均一的杂多糖,分子质量为8.65×106 u,由鼠李糖（6.34%）、葡萄糖醛酸（5.73%）、半乳糖（47.14%）和阿拉伯糖（40.13%）组成。测定了皱皮木瓜籽多糖F3组分的一级结构,并对其生物活性进行了评价。通过核磁共振（NMR）、甲基化分析、高碘酸氧化和Smith降解分析、扫描电镜、原子力显微镜、刚果红分析法鉴定了F3的结构。F3的主链由→3,6)-Galp-(1→组成,侧链由Araf-（1→,→4）-Glcp A-（1→,→4）-Galp-（1→和→3）-Rhap-(1→组成,F3的一级重复单元得到鉴定。抗氧化活性评估试验结果表明,皱皮木瓜籽多糖F3组分具有DPPH、羟基、超氧阴离子自由基清除能力和金属离子螯合性能,且呈明显的量效关系。此外,F3还具有α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶抑制活性,IC50值分别为6.24和4.59 g/L。皱皮木瓜籽富含蛋白,可作为优质的植物蛋白资源利用。分别使用碱溶解酸沉淀法制备分离蛋白,使用Osborne分级法对木瓜籽中蛋白进行分级制备。研究了分离蛋白和主要分级蛋白（白蛋白及谷蛋白）的氨基酸组成,结果表明这几种蛋白的必需氨基酸组成合理,基本符合世界卫生组织/粮食及农业组织（WHO/FAO）对成年人必需氨基酸的推荐摄入量。3种蛋白样品中,谷蛋白的变性温度最高（Td 108.36℃）,且具有最好的热凝固性（25.39%）。白蛋白的溶解性总体高于分离蛋白和谷蛋白,且白蛋白具有更好的乳化性能和起泡性能。分离蛋白具有最高的持油力（10.77 g/g）,谷蛋白的持水力（5.44 g/g）最强。黏度测定结果表明,3种蛋白溶液均为假塑性流体,呈现典型剪切变稀特征。为进一步提高皱皮木瓜籽分离蛋白的利用价值,使用木瓜蛋白酶对木瓜籽分离蛋白进行水解。以酪氨酸酶抑制活性为指标,通过超滤、凝胶柱层析和反相碳十八柱层析法,分离纯化得到两组具有较高活性的肽段。使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-TOF）测定了这两组多肽的氨基酸序列,两组多肽分别为Asparagine-Tyrosine-Arginine-Arginine-Glutamic acid（NYRRE,737.059 u）和Arginine-Histidine-Alanine-Lysine-Phenylalanine（RHAKF,658.010 u）。在抗氧化活性评估试验中,RHAKF的DPPH自由基、超氧阴离子自由基清除能力和油脂过氧化抑制活性更强。此外RHAKF铜离子螯合性能优于NYRRE,它们对铜离子螯合的IC50值分别为0.93 g/L和2.11 g/L。同时RHAKF具有优异的酪氨酸酶抑制活性,其IC50值仅为1.15 g/L,抑制活性显着优于柠檬酸(IC509.77 g/L)。使用分子对接模拟研究了两组活性肽与酪氨酸酶间的相互作用,结果表明RHAKF与酪氨酸酶间存在更多的对接位点。
二、33 ku protein associated several polypeptides with nearly the same molecular weight but not the same isoelectric point（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、33 ku protein associated several polypeptides with nearly the same molecular weight but not the same isoelectric point（论文提纲范文）
（1）牛乳活性乳清蛋白及酪蛋白胶束的膜分离制备研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词注释表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 牛乳简介 |
| 1.1.1 牛乳的基本组成 |
| 1.1.2 牛乳蛋白 |
| 1.2 乳清蛋白配料 |
| 1.2.1 传统乳清蛋白的制备及对活性组分的影响 |
| 1.2.2 膜分离在乳清蛋白制备中的应用 |
| 1.3 酪蛋白胶束配料 |
| 1.3.1 酪蛋白胶束配料的制备 |
| 1.3.2 酪蛋白胶束的消化性及脱钙处理 |
| 1.4 本课题的立题背景和研究内容 |
| 1.4.1 立题背景及意义 |
| 1.4.2 主要研究内容 |
| 第二章 脱脂牛乳的除菌工艺研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要材料和试剂 |
| 2.2.2 主要仪器和设备 |
| 2.2.3 脱脂鲜牛乳的高温短时巴氏杀菌、微滤和紫外处理 |
| 2.2.4 膜清洗程序 |
| 2.2.5 微生物和体细胞的分析 |
| 2.2.6 天然IgG、IgA、IgM和 LF的测定 |
| 2.2.7 LPO和XO酶活的测定 |
| 2.2.8 天然乳清蛋白的测定 |
| 2.2.9 蛋白羰基和总巯基的测定 |
| 2.2.10 蛋白含量的分析 |
| 2.2.11 统计分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 不同除菌方式对微生物和体细胞的影响 |
| 2.3.2 不同除菌方式对IgG、IgA、IgM和 LF保留的影响 |
| 2.3.3 不同除菌方式对LPO和XO酶活的影响 |
| 2.3.4 不同除菌方式对天然乳清蛋白保留率的影响 |
| 2.3.5 不同除菌方式对蛋白羰基和巯基的影响 |
| 2.3.6 不同除菌方式对总蛋白、乳清蛋白和酪蛋白的影响 |
| 2.3.7 不同膜孔径膜通量的变化 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 天然牛乳清蛋白的分离制备研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要材料和试剂 |
| 3.2.2 主要仪器和设备 |
| 3.2.3 不同膜孔径、浓缩倍数和过滤阶段的微滤过程 |
| 3.2.4 微滤膜清洗程序 |
| 3.2.5 髙丰度乳清蛋白的测定 |
| 3.2.6 低丰度乳清蛋白的测定 |
| 3.2.7 乳清粉的制备 |
| 3.2.8 不同干燥方式乳清粉微观结构与溶解性的测定 |
| 3.2.9 数据分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 不同膜孔径对乳清蛋白回收率的影响 |
| 3.3.2 不同浓缩倍数对蛋白转运的影响 |
| 3.3.3 不同过滤阶段对乳清蛋白回收率的影响 |
| 3.3.4 不同干燥方式对乳清蛋白的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 脱钙牛乳酪蛋白胶束的制备及消化性研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要材料和试剂 |
| 4.2.2 主要仪器和设备 |
| 4.2.3 脱钙酪蛋白胶束的制备 |
| 4.2.4 钙含量的测定 |
| 4.2.5 浊度的表征 |
| 4.2.6 粒径的测定 |
| 4.2.7 游离酪蛋白的测定 |
| 4.2.8 胶束透射电镜的分析 |
| 4.2.9 脱钙胶束粉的消化实验程序 |
| 4.2.10 消化液SDS-PAGE的分析 |
| 4.2.11 消化液激光共聚焦(CLSM)的分析 |
| 4.2.12 消化液水解度分析 |
| 4.2.13 消化液多肽分子量分析 |
| 4.2.14 数据分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 酪蛋白胶束的脱钙率 |
| 4.3.2 酪蛋白胶束浊度的变化 |
| 4.3.3 游离酪蛋白含量的变化 |
| 4.3.4 脱钙酪蛋白胶束粒径的的变化 |
| 4.3.5 脱钙酪蛋白胶束结构的变化 |
| 4.3.6 模拟胃液的絮凝结构 |
| 4.3.7 消化物的SDS-PAGE图 |
| 4.3.8 消化液多肽分子量的分布 |
| 4.4 小结 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（2）ε-聚赖氨酸与乳蛋白相互作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 蛋白质和聚电解质间的相互作用 |
| 1.1.1 聚电解质 |
| 1.1.2 蛋白质和多肽 |
| 1.1.3 热力学性质 |
| 1.1.4 理论模型 |
| 1.1.5 静电相互作用 |
| 1.1.6 短程相互作用力 |
| 1.1.7 相分离 |
| 1.1.8 “成核-增长”理论 |
| 1.2 蛋白质-聚电解质复合物的应用前沿 |
| 1.2.1 纳米递送系统 |
| 1.2.2 蛋白质的浓缩、分离和纯化 |
| 1.2.3 致密复合物 |
| 1.3 ε-聚赖氨酸的结构和功能 |
| 1.3.1 天然防腐剂 |
| 1.3.2 理化性质 |
| 1.3.3 抑菌特性和抑菌机制 |
| 1.4 乳蛋白的结构和功能 |
| 1.4.1 乳蛋白的主要组成 |
| 1.4.2 β-酪蛋白 |
| 1.4.3 β-乳球蛋白 |
| 1.4.4 牛血清白蛋白 |
| 1.5 本课题的研究意义和主要研究内容 |
| 1.5.1 研究目的和意义 |
| 1.5.2 主要研究内容 |
| 1.5.3 技术路线图 |
| 第2章 ε-聚赖氨酸/乳蛋白体系相转变的多尺度表征 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 样品制备 |
| 2.2.4 浊度测定 |
| 2.2.5 流体力学直径和ζ-电势 |
| 2.2.6 原位电喷雾质谱分析 |
| 2.2.7 分子动力学模拟 |
| 2.2.8 蛋白质一级序列特性表征 |
| 2.2.9 β-酪蛋白三级结构预测 |
| 2.2.10 蛋白质表面静电势建模 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 ε-聚赖氨酸的基本特征 |
| 2.3.2 影响ε-聚赖氨酸/乳蛋白体系浊度的因素 |
| 2.3.3 影响ε-聚赖氨酸/乳蛋白体系流体力学直径的因素 |
| 2.3.4 影响ε-聚赖氨酸/乳蛋白体系ζ-电势的因素 |
| 2.3.5 乳蛋白分子的结构特征 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 ε-聚赖氨酸/乳蛋白体系结构的多尺度表征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 样品制备 |
| 3.2.4 流体力学直径和ζ-电势 |
| 3.2.5 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 3.2.6 液相色谱-质谱联用(LC-MS) |
| 3.2.7 光谱学表征方法 |
| 3.2.8 形态学表征方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 中间相和沉淀相的分离 |
| 3.3.2 中间相的组成研究 |
| 3.3.3 中间相的形态表征 |
| 3.3.4 中间相的构象表征 |
| 3.3.5 沉淀相的形态表征 |
| 3.3.6 沉淀相的构象表征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 ε-聚赖氨酸与乳蛋白间的相互作用机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 样品制备 |
| 4.2.4 浊度测定 |
| 4.2.5 蛋白质含量的测定 |
| 4.2.6 流体力学直径和ζ-电势 |
| 4.2.7 分子动力学模拟 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 相分离动力学 |
| 4.3.2 中间相和沉淀相形成机制 |
| 4.3.3 复合物的形成机制 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 ε-聚赖氨酸与乳蛋白间的亲和性评价 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 仪器设备 |
| 5.2.3 样品制备 |
| 5.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 5.2.5 液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS) |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 ε-聚赖氨酸与混合乳蛋白间的亲和性评价 |
| 5.3.2 ε-聚赖氨酸与脱脂乳中蛋白的亲和性评价 |
| 5.3.3 ε-聚赖氨酸与乳源配料间的亲和性评价 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 ε-聚赖氨酸/乳蛋白体系相分离的特征及应用 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 仪器设备 |
| 6.2.3 抑菌特性的表征 |
| 6.2.4 致密复合物的理化性质 |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 相分离对ε-聚赖氨酸抑菌效力的影响 |
| 6.3.2 致密复合物的基础性质 |
| 6.3.3 致密复合物对疏水化合物的吸附特性 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 总结与展望 |
| 7.1 总结 |
| 7.2 主要创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 蛋白质一级序列 |
| 附录二 电喷雾质谱(ESI-MS) |
| 附录三 三维荧光光谱 |
| 附录四 扫描电子显微镜 |
| 附录五 傅立叶变换近红外光谱(FTIR) |
| 附录六 姜黄素包埋率的测定 |
| 附录七 菌落总数 |
| 附录八 肉汤主要成分 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间的论文发表情况 |
（3）骨明胶的酶法制备及成膜特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 骨概述 |
| 1.1.1 骨的基本结构 |
| 1.1.2 骨的化学成分 |
| 1.1.3 骨的利用现状 |
| 1.2 骨胶原概述 |
| 1.2.1 骨胶原的生物合成 |
| 1.2.2 骨胶原的结构 |
| 1.2.3 骨胶原、骨明胶、骨胶原蛋白肽 |
| 1.3 骨明胶的研究 |
| 1.3.1 骨明胶概述 |
| 1.3.2 骨明胶制备工艺 |
| 1.3.3 骨明胶的应用 |
| 1.4 立题背景与意义 |
| 1.5 主要研究内容 |
| 第二章 酶法制备骨明胶工艺研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 原料 |
| 2.2.2 试剂 |
| 2.2.3 仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 基本成分分析 |
| 2.3.2 钙含量测定 |
| 2.3.3 羟脯氨酸含量测定 |
| 2.3.4 酶活检测 |
| 2.3.5 骨明胶质量指标测定 |
| 2.4 骨明胶酶法制备工艺条件优化 |
| 2.4.1 原料预处理 |
| 2.4.2 脱矿工艺优化 |
| 2.4.3 酶解条件优化 |
| 2.4.4 提胶工艺优化 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 2.5.1 脱脂骨粉的基本成分 |
| 2.5.2 脱矿工艺的确定 |
| 2.5.3 最适酶解条件的确定 |
| 2.5.4 提胶工艺的确定 |
| 2.6 一步酶法制胶工艺 |
| 2.6.1 工艺流程对比 |
| 2.6.2 产率与明胶品质(冻力与黏度)对比 |
| 2.6.3 生产消耗对比 |
| 2.6.4 一步酶法制胶评价 |
| 2.7 生命周期评价 |
| 2.7.1 目标与范围 |
| 2.7.2 清单分析 |
| 2.7.3 生命周期影响评价 |
| 2.8 本章小结 |
| 第三章 酶法骨明胶的结构与功能特性研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 原料 |
| 3.2.2 试剂 |
| 3.2.3 仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 骨明胶氨基酸组成测定 |
| 3.3.2 骨明胶分子量分布测定 |
| 3.3.3 骨明胶圆二色性(CD)测定 |
| 3.3.4 骨明胶红外光谱(ATR-FTIR)测定 |
| 3.3.5 骨明胶X-射线衍射(XRD)测定 |
| 3.3.6 骨明胶等电点测定 |
| 3.3.7 骨明胶的流变特性 |
| 3.3.8 骨明胶的持水性与持油性 |
| 3.3.9 骨明胶的起泡性与泡沫稳定性 |
| 3.3.10 骨明胶的乳化性与乳化稳定性 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 骨明胶的一级结构 |
| 3.4.2 骨明胶的二级结构 |
| 3.4.3 骨明胶的三级结构 |
| 3.4.4 骨明胶的等电点 |
| 3.4.5 骨明胶的流变特性 |
| 3.4.6 骨明胶的持水性与持油性 |
| 3.4.7 骨明胶的起泡性与泡沫稳定性 |
| 3.4.8 骨明胶的乳化性与乳化稳定性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 酶法制备骨明胶机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 原料 |
| 4.2.2 试剂 |
| 4.2.3 仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 酸溶骨胶原与酶溶骨胶原的分离纯化 |
| 4.3.2 X-射线衍射(XRD)测定 |
| 4.3.3 分子量分布测定 |
| 4.3.4 红外光谱(ATR-FTIR)测定 |
| 4.3.5 肽序列质谱鉴定 |
| 4.3.6 酸溶骨胶原与酶溶骨胶原成纤维能力测定 |
| 4.3.7 谷氨酰胺(Gln)与天冬酰胺(Asn)含量测定 |
| 4.3.8 圆二色性(CD)测定 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 一步酶法制备骨明胶过程中酶的作用位点 |
| 4.4.2 酶法骨明胶等电点形成机理 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 酶法骨明胶制备高交联度明胶膜 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与仪器 |
| 5.2.1 原料 |
| 5.2.2 试剂 |
| 5.2.3 仪器与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 MTgase交联明胶膜的制备 |
| 5.3.2 谷氨酰胺(Gln)含量测定 |
| 5.3.3 交联度检测 |
| 5.3.4 分子量分布测定 |
| 5.3.5 X-射线衍射(XRD)测定 |
| 5.3.6 水溶性检测 |
| 5.3.7 机械特性测定 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 谷氨酰胺对MTgase修饰明胶膜交联度的影响 |
| 5.4.2 MTgase修饰对明胶分子量的影响 |
| 5.4.3 MTgase修饰对明胶三级结构的影响 |
| 5.4.4 MTgase修饰明胶膜的水溶性 |
| 5.4.5 MTgase修饰明胶膜的机械特性 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 仿生胶原结构明胶膜的构建 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与仪器 |
| 6.2.1 原料 |
| 6.2.2 试剂 |
| 6.2.3 仪器与设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 明胶膜的制备 |
| 6.3.2 取向度测定 |
| 6.3.3 机械特性测定 |
| 6.3.4 圆二色性(CD)测定 |
| 6.3.5 X-射线衍射(XRD)测定 |
| 6.3.6 硫酸钠残留量检测 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 Kosmotropic离子SO_4~(2-)的作用机制 |
| 6.4.2 Na_2SO_4溶液辅助与机械形变诱导构建仿生胶原结构各向异性明胶膜 |
| 6.4.3 仿生胶原结构明胶膜的机械特性 |
| 6.4.4 仿生胶原结构明胶膜的光学特性 |
| 6.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间学术成果 |
（4）Bacillus cereus MH19基因组分析及胶原酶分离纯化与重组表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 微生物胶原酶 |
| 1.1 微生物胶原酶的种类 |
| 1.2 胶原酶的分子生物学特征 |
| 1.3 胶原酶的多样性 |
| 1.4 胶原酶与明胶酶及其他胶原蛋白降解酶的区别 |
| 1.5 胶原酶的应用 |
| 2 研究目的与主要内容 |
| 2.1 研究目的与意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 第二章 产胶原酶蜡样芽孢杆菌的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 菌株培养形态 |
| 2.2 菌株培养显微镜观察 |
| 2.3 菌株产胶原酶活性 |
| 2.4 菌株16SrDNA序列鉴定 |
| 2.5 MYP培养鉴定 |
| 2.6 菌株生理生化鉴定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 胶原酶活性的测定 |
| 3.2 芽孢杆菌属内菌种的鉴定 |
| 3.3 产胶原酶菌株的筛选 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 Bacillus cereus MH19全基因组测序及分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 基因组DNA质量 |
| 2.2 测序及基因组基本特征 |
| 2.3 GC-Depth分析 |
| 2.4 基因组注释与基因功能分析 |
| 2.5 比较基因组学分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第四章 Bacillus cereus MH19胶原酶结构与功能分析 |
| 1 方法 |
| 1.1 基因功能注释查找胶原酶基因 |
| 1.2 胶原酶基因系统发育分析 |
| 1.3 胶原酶氨基酸组成和物理化学特性分析 |
| 1.4 胶原酶结构域分析 |
| 1.5 胶原酶二级结构的预测 |
| 1.6 胶原酶三维模型预测和评估 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 基因功能注释查找胶原酶基因 |
| 2.2 胶原酶基因系统发育分类分析 |
| 2.3 理化性质 |
| 2.4 胶原酶结构域及功能分析 |
| 2.5 胶原酶二级结构分析 |
| 2.6 胶原酶三级结构预测和评估 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第五章 胶原酶的分离纯化及性质研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Bacillu cereus MH19菌株生长曲线与酶活曲线 |
| 2.2 胶原酶的分离纯化 |
| 2.3 胶原酶的酶学性质分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 BCC与其他微生物胶原酶的性质比较 |
| 3.2 胶原酶的应用 |
| 4 本章小结 |
| 第六章 ColB胶原酶基因在大肠杆菌中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ColB序列分析及预处理 |
| 2.2 密码子优化设计 |
| 2.3 ColB的全基因合成 |
| 2.4 重组表达载体pET30a-ColB构建 |
| 2.5 重组质粒菌落PCR鉴定 |
| 2.6 重组质粒提取及双酶切鉴定 |
| 2.7 重组质粒pET30a-ColB测序分析 |
| 2.8 重组ColB蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 2.9 重组ColB蛋白的纯化及可溶性分析 |
| 2.10 重组ColB蛋白质量检测 |
| 2.11 重组蛋白ColB胶原酶活性分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 重组蛋白表达系统的选择 |
| 3.2 提高重组蛋白的可溶性表达 |
| 4 本章小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 本研究存在的问题及展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）罗非鱼皮胶原降解反应行为及肽钙螯合物制备研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 罗非鱼养殖及加工现状 |
| 1.1.1 罗非鱼习性及养殖现状 |
| 1.1.2 罗非鱼加工现状 |
| 1.1.3 罗非鱼的下脚料的综合利用 |
| 1.1.4 罗非鱼产业存在的问题及产业转型的迫切性 |
| 1.2 胶原蛋白的研究进展 |
| 1.2.1 胶原蛋白的分类 |
| 1.2.2 胶原蛋白的结构 |
| 1.2.3 胶原蛋白的提取方法 |
| 1.2.4 胶原蛋白的应用 |
| 1.3 胶原明胶化过程 |
| 1.3.1 明胶概述 |
| 1.3.2 明胶结构 |
| 1.3.3 明胶的提取方法 |
| 1.4 胶原明胶化过程的微观结构变化研究 |
| 1.5 鱼明胶及酶解制备胶原蛋白肽 |
| 1.5.1 鱼明胶概况 |
| 1.5.2 鱼明胶的氨基酸组成 |
| 1.5.3 鱼明胶的应用 |
| 1.5.4 胶原蛋白肽的概述 |
| 1.6 胶原蛋白酶性质及酶的分离纯化方法 |
| 1.6.1 胶原蛋白酶性质 |
| 1.6.2 酶的纯化方法 |
| 1.7 胶原蛋白肽含量的检测方法 |
| 1.8 3-D模型构建在蛋白质酶促水解过程的应用研究 |
| 1.9 肽螯合钙的研究进展 |
| 1.9.1 螯合机制 |
| 1.9.2 肽钙螯合物的吸收利用 |
| 1.9.3 生产制备工艺 |
| 1.9.4 肽钙螯合物的特性及促钙吸收的机理 |
| 1.9.5 肽钙螯合物的结合性能分析 |
| 1.9.6 肽钙螯合产品研究 |
| 1.10 本文的研究目的、研究内容 |
| 1.10.1 研究目的及意义 |
| 1.10.2 研究内容 |
| 1.10.3 研究技术路线 |
| 第二章 罗非鱼皮胶原纤维结构及性质研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 主要材料和试剂 |
| 2.2.2 主要仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 罗非鱼新鲜鱼皮和鱼鳞基本成分的测定 |
| 2.3.2 鱼皮胶原纤维的分布 |
| 2.3.3 罗非鱼鱼皮、鱼鳞酸溶性胶原(ASC)和酶促酸溶性胶原(PSC)提取方法 |
| 2.3.4 胶原产物性质的测定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 罗非鱼鱼皮和鱼鳞组成成分的比较 |
| 2.4.2 罗非鱼皮中胶原纤维的分布 |
| 2.4.3 胶原产物纯度的测定结果 |
| 2.4.4 紫外光谱分析 |
| 2.4.5 氨基酸组成分析 |
| 2.4.6 FTIR分析 |
| 2.4.7 胶原热收缩温度测定(Ts) |
| 2.4.8 胶原产物分子量分布测定结果 |
| 2.5 本章小节 |
| 第三章 罗非鱼皮胶原明胶化过程的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 主要材料和试剂 |
| 3.2.2 主要仪器与设备 |
| 3.3 实验流程及方法 |
| 3.3.1 盐酸法提取罗非鱼鱼皮明胶化胶原的制备方法 |
| 3.3.2 罗非鱼鱼皮明胶的提取及其提取率计算 |
| 3.3.3 罗非鱼鱼皮胶原基本成分的测定方法 |
| 3.3.4 明胶化胶原的热稳定性分析 |
| 3.3.5 红外光谱分析 |
| 3.3.6 明胶化胶原的圆二色谱分析 |
| 3.3.7 产物亚基组成及分子量分布 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 罗非鱼鱼皮胶原基本成分测定结果 |
| 3.4.2 酸处理时间对明胶提取率的影响 |
| 3.4.3 不同酸处理时间下胶原降解物的红外光谱分析 |
| 3.4.4 酸处理对罗非鱼皮胶原降解物热稳定性的影响 |
| 3.4.5 酸处理罗非鱼皮胶原圆二色谱结果分析 |
| 3.4.6 不同酸处理时间下罗非鱼皮胶原降解物的SDS-PAGE电泳分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的改良及应用评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 仪器与设备 |
| 4.3 实验内容和方法 |
| 4.3.1 实验流程 |
| 4.3.2 测定方法最适参数的选定 |
| 4.3.3 最适条件下标准曲线的制作 |
| 4.3.4 精密度实验 |
| 4.3.5 重复性实验 |
| 4.3.6 鱼皮胶原蛋白肽的加样回收率试验 |
| 4.3.7 鱼皮胶原蛋白肽与罗非鱼皮胶原蛋白的加样回收率试验 |
| 4.3.8 不同种类的罗非鱼胶原蛋白肽加样回收率试验 |
| 4.3.9 不同种类罗非鱼胶原蛋白肽与罗非鱼皮胶原蛋白的加样回收率试验 |
| 4.3.10 数据及图片处理方法 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 络合物最大吸收波长的确定 |
| 4.4.2 多肽线性质量浓度范围的确定 |
| 4.4.3 最适pH的确定 |
| 4.4.4 最适TCA浓度的确定 |
| 4.4.5 最适条件下标准曲线的绘制 |
| 4.4.6 精密度试验结果分析 |
| 4.4.7 重复性试验结果分析 |
| 4.4.8 鱼皮胶原蛋白肽的加样回收率试验结果分析 |
| 4.4.9 鱼皮胶原蛋白肽与胶原蛋白的加样回收率试验结果分析 |
| 4.4.10 不同种类的罗非鱼胶原蛋白肽及加罗非鱼胶原蛋白的加样回收率试验结果分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 胶原蛋白水解酶的纯化鉴定、酶学性质及固定化研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与仪器 |
| 5.2.1 主要材料与试剂 |
| 5.2.2 仪器与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 酶的纯化及鉴定 |
| 5.3.2 胶原蛋白水解酶酶学性质研究 |
| 5.3.3 磺化聚苯乙烯纳米球固定胶原蛋白水解酶及表征 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 胶原蛋白水解酶的分离、纯化与鉴定 |
| 5.4.2 胶原蛋白水解酶酶学性质研究 |
| 5.4.3 磺化聚苯乙烯(SPS)纳米球固定胶原蛋白水解酶及表征 |
| 5.5 本章小节 |
| 第六章 罗非鱼皮胶原蛋白酶解过程反应行为研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与仪器 |
| 6.2.1 主要材料与试剂 |
| 6.2.2 主要仪器与设备 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 酶解体系的建立 |
| 6.3.2 水解度的测定 |
| 6.3.3 酶解体系物质分子量分布的测定 |
| 6.3.4 3-D图形构建与曲面方程拟合及验证 |
| 6.3.5 不同水解度下酶解物的抗氧化能力评价 |
| 6.3.6 罗非鱼皮明胶化胶原蛋白肽的HPLC-MSMS检测方法及序列分析 |
| 6.3.7 鉴定得到的肽序列结构的模拟 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 酶解反应动态特征3-D模型构建 |
| 6.4.2 罗非鱼皮明胶化胶原酶解产物的抗氧化能力评价 |
| 6.4.3 罗非鱼皮明胶化胶原酶解产物肽的序列分析及结构预测 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 罗非鱼皮胶原蛋白肽-钙螯合物的制备及体外Caco-2细胞模型促钙吸收评价 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 材料与仪器 |
| 7.2.1 主要材料与试剂 |
| 7.2.2 仪器与设备 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 罗非鱼皮胶原蛋白肽分子量的测定方法 |
| 7.3.2 罗非鱼皮胶原蛋白肽中钙含量的测定 |
| 7.3.3 罗非鱼皮胶原蛋白肽-钙螯合物基本制备方法 |
| 7.3.4 罗非鱼皮胶原蛋白肽-钙螯合物制备工艺优化 |
| 7.3.5 钙螯合率的测定 |
| 7.3.6 胶原蛋白肽螯合钙的结构表征 |
| 7.3.7 罗非鱼皮胶原蛋白肽钙螯合物的稳定性研究 |
| 7.3.8 罗非鱼鱼鳞肽钙螯合物中钙结合量的测定方法 |
| 7.4 结果与讨论 |
| 7.4.1 罗非鱼皮胶原蛋白肽分子量分布测定结果 |
| 7.4.2 罗非鱼胶原蛋白肽含钙量的测定结果 |
| 7.4.3 罗非鱼皮胶原蛋白肽钙螯合物制备工艺单因素实验结果及分析 |
| 7.4.4 罗非鱼皮胶原蛋白肽钙螯合物制备工艺响应面优化试验结果及分析 |
| 7.4.5 胶原蛋白肽钙螯合物结构表征 |
| 7.4.6 罗非鱼皮胶原蛋白肽钙螯合物稳定性研究 |
| 7.4.7 罗非鱼皮胶原蛋白肽钙螯合物体外促钙吸收效果 |
| 7.5 本章小节 |
| 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、主要创新点 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）质谱鉴定中药阿胶的胶原蛋白和糖胺聚糖及研究糖胺聚糖与趋化因子的相互作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 胶原蛋白及其降解物 |
| 1.1.1 胶原蛋白类型与分子结构 |
| 1.1.2 胶原蛋白降解物 |
| 1.1.3 胶原蛋白的传统鉴定方法 |
| 1.2 糖胺聚糖的种类及功能 |
| 1.2.1 肝素及硫酸乙酰肝素 |
| 1.2.2 硫酸软骨素和硫酸皮肤素 |
| 1.2.3 透明质酸 |
| 1.2.4 硫酸角质素 |
| 1.3 趋化因子的结构及生理作用 |
| 1.3.1 CCL5的结构特点 |
| 1.3.2 CCL5的生理作用 |
| 1.4 糖基化修饰的种类及功能 |
| 1.4.1 N-连接糖基化 |
| 1.4.2 O-GalNAc糖基化 |
| 1.4.3 O-GlcNAc糖基化 |
| 1.4.4 磷酸化糖基修饰 |
| 1.4.5 C-甘露糖基化 |
| 1.4.6 糖基化磷脂酰肌醇锚定 |
| 1.5 现代质谱分析技术 |
| 1.5.1 生物质谱仪 |
| 1.5.2 质谱的碎裂方式 |
| 1.6 蛋白质与糖胺聚糖的质谱分析策略 |
| 1.6.1 蛋白质的质谱分析策略 |
| 1.6.2 糖胺聚糖的质谱分析策略 |
| 1.7 糖胺聚糖与蛋白的相互作用 |
| 1.8 论文大纲 |
| 第二章 阿胶中胶原蛋白成分的鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 试剂与耗材 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 色谱柱 |
| 2.2.4 缓冲液及流动相的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物皮样处理 |
| 2.3.2 胶样产品处理 |
| 2.3.3 蛋白酶解 |
| 2.3.4 NanoLC-MS/MS分析 |
| 2.3.5 生物信息学分析 |
| 2.3.6 数据库搜索 |
| 2.3.7 LC-MRM-MS/MS分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 鸟枪法蛋白组学 |
| 2.4.2 生物信息学 |
| 2.4.3 挑选每个物种的特征肽 |
| 2.4.4 特征肽的MRM定量方法研究 |
| 2.4.5 掺假阿胶产品的检测 |
| 2.4.6 掺假杂交动物皮的阿胶的鉴定 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 阿胶制作中糖胺聚糖的变化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试剂与耗材 |
| 3.2.1 试剂与耗材 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 色谱柱 |
| 3.2.4 缓冲液及流动相的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 糖胺聚糖的提取 |
| 3.3.2 糖胺聚糖的酶解及AMAC标记 |
| 3.3.3 LC-MRM-MS/MS分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 糖胺聚糖的结构表征和含量测定 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 人血浆中天然CCL5的鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 药品与试剂 |
| 4.2.1 试剂与耗材 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 色谱柱 |
| 4.2.4 缓冲液及流动相的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 CCL5多抗偶联琼脂糖珠的制备 |
| 4.3.2 CCL5的纯化 |
| 4.3.3 野豌豆凝集素亲和柱的制备 |
| 4.3.4 CCL5的糖肽富集 |
| 4.3.5 蛋白酶解 |
| 4.3.6 质谱分析 |
| 4.3.7 数据库搜索 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 血浆制备 |
| 4.4.2 天然CCL5的存在形式 |
| 4.4.3 CCL5的糖基化形式 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 CCL5异型体混合物的定性及定量研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 药品与试剂 |
| 5.2.1 试剂与耗材 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 色谱柱 |
| 5.2.4 缓冲液及流动相的配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 CCL5异型体混合物的酶解 |
| 5.3.2 CCL5异型体混合物的质谱分析 |
| 5.3.3 CCL5混合物的定量方法摸索 |
| 5.3.4 数据处理 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 CCL5糖基化异型体的合成 |
| 5.4.2 CCL5碎裂方式选择 |
| 5.4.3 HCD和ETD鉴定CCL5 |
| 5.4.4 CCL5定量方法应用 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 CCL5与肝素相互作用研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 药品与试剂 |
| 6.2.1 试剂与耗材 |
| 6.2.2 主要仪器 |
| 6.2.3 色谱柱 |
| 6.2.4 缓冲液及流动相的配制 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 BLI测定 |
| 6.3.2 分子对接模拟 |
| 6.3.3 CCL5混合物过肝素亲和柱 |
| 6.3.4 洗脱样品的定量质谱分析 |
| 6.3.5 数据处理 |
| 6.4 结果与讨论 |
| 6.4.1 CCL5个体与肝素的相互作用 |
| 6.4.2 分子对接模拟 |
| 6.4.3 CCL5混合物与肝素的相互作用 |
| 6.5 本章小结 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及申请的专利 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（7）昆虫受体氨肽酶-N仿生聚合物纳米颗粒的设计及对Bt蛋白的选择性识别（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 Bt蛋白 |
| 1.1.1 Bt蛋白概述 |
| 1.1.2 Bt蛋白的应用及环境生态风险 |
| 1.1.3 Bt蛋白分析检测方法 |
| 1.1.4 Bt蛋白杀虫机理 |
| 1.2 聚合物纳米颗粒 |
| 1.2.1 聚合物纳米颗粒研究概述 |
| 1.2.2 聚合物纳米颗粒应用现状 |
| 1.2.3 聚合物纳米颗粒合成方法及设计策略 |
| 1.3 聚合物纳米颗粒与生物大分子作用机理研究方法 |
| 1.3.1 等温滴定量热法(ITC) |
| 1.3.2 单纳米颗粒表面等离子体共振成像(SPRI) |
| 1.3.3 石英晶体微天平(QCM) |
| 1.4 论文选题思想 |
| 第二章 实验材料及研究方法 |
| 2.1 实验所用药品及仪器 |
| 2.1.1 实验药品 |
| 2.1.2 主要溶液配制 |
| 2.1.3 实验仪器设备 |
| 2.2 聚合物纳米颗粒的制备 |
| 2.2.1 聚合物纳米颗粒的合成 |
| 2.2.2 大尺寸聚合物纳米颗粒的合成 |
| 2.2.3 聚合物纳米颗粒的纯化 |
| 2.3 聚合物纳米颗粒的性质表征 |
| 2.3.1 材料浓度及产率表征 |
| 2.3.2 材料粒径大小表征 |
| 2.3.3 pH值对材料粒径的影响 |
| 2.3.4 材料表面Zeta电位表征 |
| 2.3.5 pH值对材料表面Zeta电位影响 |
| 2.4 检测方法 |
| 2.4.1 蛋白质检测方法 |
| 2.4.2 多肽检测方法 |
| 2.5 聚合物纳米颗粒筛选及吸附条件优化 |
| 2.5.1 聚合物纳米颗粒吸附能力的筛选实验 |
| 2.5.2 缓冲液pH优化 |
| 2.5.3 缓冲液浓度优化 |
| 2.5.4 缓冲液盐浓度优化 |
| 2.6 聚合物纳米颗粒吸附性能的评价 |
| 2.6.1 选择性吸附实验 |
| 2.6.2 等温吸附实验 |
| 2.6.3 吸附动力学实验 |
| 2.7 Bt蛋白潜在作用位点分析 |
| 2.7.1 酶解方法 |
| 2.7.2 Bt Cry1F胃蛋白酶酶解液的吸附 |
| 2.7.3 Bt Cry1Ac抗原决定簇及突变多肽的吸附 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 丙烯酸-HP-7-NH_2单体的结构表征 |
| 3.2 聚合物纳米颗粒理化性质的表征 |
| 3.2.1 聚合物纳米颗粒浓度、产率及粒径的表征 |
| 3.2.2 pH值对聚合物纳米颗粒粒径的影响 |
| 3.2.3 pH值对聚合物纳米颗粒Zeta电位的影响 |
| 3.3 聚合物纳米颗粒与Bt Cry1C蛋白的吸附 |
| 3.3.1 聚合物纳米颗粒的筛选 |
| 3.3.2 缓冲溶液pH值优化 |
| 3.3.3 缓冲溶液浓度优化 |
| 3.3.4 选择性吸附 |
| 3.4 聚合物纳米颗粒与Bt Cry1F蛋白的吸附 |
| 3.4.1 聚合物纳米颗粒的筛选 |
| 3.4.2 缓冲溶液pH值优化 |
| 3.4.3 缓冲溶液浓度优化 |
| 3.4.4 缓冲溶液盐浓度优化 |
| 3.4.5 等温吸附 |
| 3.4.6 吸附动力学 |
| 3.5 聚合物纳米颗粒与Bt蛋白相互作用机理研究 |
| 3.5.1 Bt Cry1F胃蛋白酶酶解液吸附实验及潜在作用位点分析 |
| 3.5.2 Bt Cry1Ac抗原决定簇和突变多肽吸附实验及潜在结合机理分析 |
| 3.6 小结 |
| 结束语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）用于药物高效负载和肿瘤特异性药物递送的聚合物纳米载体及其抗肿瘤治疗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略语及全名对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 恶性肿瘤简介 |
| 1.1.1 恶性肿瘤现状简介 |
| 1.1.2 恶性肿瘤主要特征 |
| 1.2 传统化疗药物 |
| 1.2.1 小分子化疗药物 |
| 1.2.2 蛋白类抗肿瘤药物 |
| 1.3 抗肿瘤纳米药物 |
| 1.3.1 纳米药物的主要优势 |
| 1.3.2 纳米药物的肿瘤靶向递送屏障 |
| 1.3.3 高载药量化疗药物递送体系 |
| 1.3.4 蛋白质胞内递送体系 |
| 1.3.5 刺激响应型纳米药物 |
| 1.4 论文选题依据与研究方向 |
| 参考文献 |
| 第二章 具有可控及高效载药能力的聚合物胶束共递送两种化疗药物用于协同抗肿瘤治疗 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 药品、细胞和动物 |
| 2.2.2 实验仪器与设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 mPEG-b-PBLA共聚物的合成 |
| 2.3.2 mPEG-b-PHEA的合成 |
| 2.3.3 4-(羟甲基)苯硼酸频哪醇羰基咪唑的合成 |
| 2.3.4 苄基羰基咪唑的合成 |
| 2.3.5 mPEG-b-PHEA-PBA (PPBA)的合成 |
| 2.3.6 mPEG-b-PHEA-Bn (PCBZ)的合成 |
| 2.3.7 PPBA和PCBZ载药胶束的制备及载药量/包封率测定 |
| 2.3.8 PPBA-DI胶束的稳定性 |
| 2.3.9 PPBA-DI胶束的H_2O_2响应性降解 |
| 2.3.10 体外药物释放研究 |
| 2.3.11 体外细胞毒性研究 |
| 2.3.12 体外细胞摄取和胞内分布 |
| 2.3.13 体外抗肿瘤效果 |
| 2.3.14 体内生物分布研究 |
| 2.3.15 体内抑瘤效果 |
| 2.3.16 统计学分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 mPEG-b-PHEA的合成 |
| 2.4.2 羰基咪唑修饰的苯硼酸和苄基小分子的合成 |
| 2.4.3 聚合物PPBA和PCBZ的合成 |
| 2.4.4 载药胶束的制备与表征 |
| 2.4.5 体外药物释放 |
| 2.4.6 共载药胶束的细胞摄取 |
| 2.4.7 体外抗肿瘤效果 |
| 2.4.8 PPBA胶束的体内生物分布 |
| 2.4.9 体内抗肿瘤效果 |
| 2.4.10 组织学和免疫组化分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 蛋白质磷酸化修饰及阳离子多肽辅助的高效胞内蛋白质递送 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 药品、细胞和动物 |
| 3.2.2 实验仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 POB-L-Glu-NCA的合成与表征 |
| 3.3.2 胍基小分子的合成与表征 |
| 3.3.3 阳离子聚多肽LPP的合成与表征 |
| 3.3.4 蛋白质的修饰与表征 |
| 3.3.5 蛋白质的荧光标记与表征 |
| 3.3.6 LPP/蛋白质纳米复合物的制备与表征 |
| 3.3.7 LPP/蛋白质纳米复合物的稳定性研究 |
| 3.3.8 RNase A酶活性的研究 |
| 3.3.9 LPP/蛋白质复合物的细胞摄取研究 |
| 3.3.10 LPP的细胞毒性研究 |
| 3.3.11 LPP/蛋白质纳米复合物的体外抗肿瘤效果 |
| 3.3.12 LPP/蛋白质纳米复合物的体内抗肿瘤效果 |
| 3.3.13 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 POB-L-Glu-NCA的合成与表征 |
| 3.4.2 胍基小分子的合成与表征 |
| 3.4.3 线形阳离子聚多肽LPP的合成与表征 |
| 3.4.4 RNase A的修饰与表征 |
| 3.4.5 LPP/RNase A纳米复合物的制备及表征 |
| 3.4.6 LPP/R-P-ATP纳米复合物的制备及表征 |
| 3.4.7 R-P-ATP的酶活性研究 |
| 3.4.8 体外肿瘤细胞摄取研究 |
| 3.4.9 体外抗肿瘤效果 |
| 3.4.10 体内抗肿瘤效果 |
| 3.5 本章小节 |
| 参考文献 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 展望 |
| 攻读学位期间已发表或待发表成果 |
| 致谢 |
（9）人源化半合成纳米抗体文库的构建及CD47纳米抗体的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 噬菌体与噬菌体抗体库展示技术 |
| 1.2 纳米抗体 |
| 1.3 CD47分子与配体SIRPα的结构特征及免疫调节功能 |
| 1.4 立题依据与研究内容 |
| 第2章 人源化半合成纳米抗体文库的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 试剂、酶及仪器 |
| 2.2.2 载体、菌种、培养基及溶液 |
| 2.2.3 VHH全长模板及引物设计 |
| 2.2.4 人源化VHH噬菌体展示库全长载体的构建 |
| 2.2.5 DNA琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.6 PCR产物的胶回收 |
| 2.2.7 回收产物的磷酸化处理 |
| 2.2.8 磷酸化产物的连接 |
| 2.2.9 TG1电转感受态细胞的制备 |
| 2.2.10 TG1感受态细胞的电转化 |
| 2.2.11 单克隆的挑取及菌落PCR检验 |
| 2.2.12 测序结果分析及库容计算 |
| 2.2.13 纳米抗体文库的保存 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 VHH噬菌体展示库全长DNA的线性PCR产物及回收后连接结果的鉴定 |
| 2.3.2 VHH噬菌体展示库随机克隆测序及氨基酸序列比对分析 |
| 2.3.3 VHH噬菌体展示库库容量的计算 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 CD47及SIRP α抗原的制备 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 试剂、酶及仪器 |
| 3.2.2 载体、菌种、细胞、培养基及溶液 |
| 3.2.3 真核表达质粒的大抽制备 |
| 3.2.4 CD47Fc、CD47his及SIRPα-Fc抗原蛋白在293F细胞中的瞬转表达 |
| 3.2.5 抗原蛋白的亲和层析 |
| 3.2.6 抗原蛋白SDS-PAGE电泳 |
| 3.2.7 抗原蛋白溶液的超滤浓缩 |
| 3.2.8 抗原蛋白浓度测定 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 大抽质粒浓度的测定 |
| 3.3.2 CD47Fc、SIRPα-Fc及CD47his抗原蛋白的真核表达及亲和纯化 |
| 3.3.3 抗原蛋白浓度测定 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 CD47纳米抗体的淘选 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 试剂、酶及仪器 |
| 4.2.2 载体、菌种、细胞、培养基及溶液 |
| 4.2.3 M13K07辅助噬菌体的扩增制备 |
| 4.2.4 噬菌体纳米抗体库的包装制备 |
| 4.2.5 纳米抗体的淘选 |
| 4.2.6 抗体库富集程度的ELISA检测 |
| 4.2.7 单克隆的ELISA筛选 |
| 4.2.8 阳性克隆测序及序列分析 |
| 4.2.9 阳性克隆噬菌体抗体的包装 |
| 4.2.10 阳性克隆的亲和力测定 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 M13K07辅助噬菌体的制备及滴度测定 |
| 4.3.2 噬菌体纳米抗体库的包装制备 |
| 4.3.3 CD47纳米抗体的淘选 |
| 4.3.4 阳性单克隆的筛选 |
| 4.3.5 阳性克隆序列分析 |
| 4.3.6 阳性克隆亲和力的测定 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 CD47纳米抗体的表达及免疫阻断活性检测 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 试剂、酶及仪器 |
| 5.2.2 载体、菌种、细胞、培养基及溶液 |
| 5.2.3 大肠杆菌CD47VHH阳性克隆表达载体的构建 |
| 5.2.4 大肠杆菌DH5α与BL21超级感受态细胞的制备及转化 |
| 5.2.5 大肠杆菌系统的原核分泌表达及周质蛋白的渗透休克法提取 |
| 5.2.6 VHH蛋白的镍柱亲和纯化 |
| 5.2.7 同源重组法构建pPIC9K-CD47VHH-3-5表达质粒 |
| 5.2.8 毕赤酵母重组表达载体的线性化及回收 |
| 5.2.9 毕赤酵母感受态细胞的制备 |
| 5.2.10 线性载体质粒的电转化 |
| 5.2.11 G418筛选高表达菌株 |
| 5.2.12 阳性酵母菌的诱导表达 |
| 5.2.13 流式细胞仪检测VHH纳米抗体的免疫阻断活性 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 大肠杆菌CD47VHH阳性克隆表达载体的构建及BL21表达菌的转化 |
| 5.3.2 CD47VHH-3-5his在使用不同培养基时周质的表达及提取情况。 |
| 5.3.3 CD47VHH-3-5his与CD47VHH-3-91his在BL21宿主菌周质中的表达 |
| 5.3.4 CD47VHH-3-5his于不同温度以及培养基中葡萄糖含量时在BL21中的表达情况 |
| 5.3.5 CD47VHH-3-5his于不同温度及培养基葡萄糖含量时在TG1中的表达情况 |
| 5.3.6 CD47VHH-3-91his在不同温度下的表达情况 |
| 5.3.7 VHH蛋白的亲和纯化 |
| 5.3.8 毕赤酵母pPIC9K-CD47VHH-3-5质粒和空载体的线性化酶切 |
| 5.3.9 转化的GS115-pPIC9K-CD47VHH-3-5在MD和G418平板上的生长情况 |
| 5.3.10 纳米抗体CD47VHH-3-5在毕赤酵母GS115中的表达情况 |
| 5.3.11 流式细胞仪检测CD47VHH的免疫阻断活性 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士在读期间发表的学术成果 |
（10）皱皮木瓜籽活性物的分离、结构特征及生物活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 种子源功能性油脂 |
| 1.2.2 种子源多糖及其活性 |
| 1.2.3 种子源蛋白的制备及功能 |
| 1.3 研究目标与主要研究内容 |
| 1.3.1 研究目标 |
| 1.3.2 主要研究内容 |
| 1.4 创新点 |
| 1.5 技术路线 |
| 1.6 项目来源和经费支持 |
| 2 皱皮木瓜籽油的提取技术及油脂性质研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.4 数据处理 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 皱皮木瓜籽主要组成 |
| 2.3.2 提取单因素试验 |
| 2.3.3 提取工艺优化 |
| 2.3.4 木瓜籽油的理化性质 |
| 2.3.5 皱皮木瓜籽油的脂肪酸组成分析 |
| 2.3.6 皱皮木瓜籽油的活性成分分析 |
| 2.3.7 皱皮木瓜籽油的抗氧化活性 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 喷雾干燥法制备皱皮木瓜籽油微胶囊及其性能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.2.4 数据处理 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 喷雾干燥法制备皱皮木瓜籽油微胶囊单因素试验 |
| 3.3.2 微胶囊制备的工艺条件优化 |
| 3.3.3 皱皮木瓜籽油微胶囊的性能 |
| 3.3.4 皱皮木瓜籽油的贮藏稳定性 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 皱皮木瓜籽多糖的提取、分离纯化及理化性质研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.2.4 数据处理 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 粗多糖提取单因素试验 |
| 4.3.2 粗多糖的提取工艺优化 |
| 4.3.3 粗多糖的分离纯化 |
| 4.3.4 多糖F3的主要组成 |
| 4.3.5 多糖F3组分的紫外光谱 |
| 4.3.6 多糖F3组分的红外光谱 |
| 4.3.7 多糖F3组分的相对分子质量 |
| 4.3.8 多糖F3的单糖组成 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 皱皮木瓜籽多糖的结构解析与活性评价 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 材料与试剂 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 实验方法 |
| 5.2.4 数据处理 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 多糖F3组分的甲基化分析 |
| 5.3.2 多糖F3组分的高碘酸氧化及Smith降解分析 |
| 5.3.3 多糖F3组分的核磁分析 |
| 5.3.4 多糖F3组分的超微观结构 |
| 5.3.5 多糖F3组分的抗氧化活性研究 |
| 5.3.6 多糖F3组分的降糖活性研究 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 皱皮木瓜籽蛋白的理化性质及功能特性分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 材料与试剂 |
| 6.2.2 主要仪器 |
| 6.2.3 实验方法 |
| 6.2.4 数据统计 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 分离蛋白的电势 |
| 6.3.2 理化性质 |
| 6.3.3 疏水性指数、巯基和二硫键含量 |
| 6.3.4 氨基酸组成 |
| 6.3.5 SDS-PAGE电泳分析 |
| 6.3.6 热力学性能 |
| 6.3.7 溶解度 |
| 6.3.8 持水力和持油力 |
| 6.3.9 乳化性能及乳化稳定性 |
| 6.3.10 起泡性能及泡沫稳定性 |
| 6.3.11 热凝固性 |
| 6.3.12 黏度分析 |
| 6.4 本章小结 |
| 7 皱皮木瓜籽蛋白源酪氨酸酶抑制肽的分离纯化及抗氧化活性研究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验部分 |
| 7.2.1 材料与试剂 |
| 7.2.2 主要仪器 |
| 7.2.3 实验方法 |
| 7.2.4 数据统计 |
| 7.3 结果与讨论 |
| 7.3.1 多肽的制备 |
| 7.3.2 多肽的分离纯化 |
| 7.3.3 多肽的氨基酸序列 |
| 7.3.4 多肽对DPPH自由基的清除能力 |
| 7.3.5 多肽对超氧阴离子自由基的清除能力 |
| 7.3.6 多肽的脂质过氧化抑制活性 |
| 7.3.7 多肽的铜螯合性能 |
| 7.3.8 多肽的酪氨酸酶抑制活性 |
| 7.3.9 分子对接模拟 |
| 7.4 本章小结 |
| 8 结论与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间的学术研究 |
| 致谢 |
四、33 ku protein associated several polypeptides with nearly the same molecular weight but not the same isoelectric point（论文参考文献）
- [1]牛乳活性乳清蛋白及酪蛋白胶束的膜分离制备研究[D]. 李志宾. 江南大学, 2021(01)
- [2]ε-聚赖氨酸与乳蛋白相互作用机制的研究[D]. 郭亮. 浙江工商大学, 2021(10)
- [3]骨明胶的酶法制备及成膜特性研究[D]. 马艳丽. 江南大学, 2020(01)
- [4]Bacillus cereus MH19基因组分析及胶原酶分离纯化与重组表达[D]. 陈世化. 华中农业大学, 2020(02)
- [5]罗非鱼皮胶原降解反应行为及肽钙螯合物制备研究[D]. 张玲. 华南理工大学, 2020(02)
- [6]质谱鉴定中药阿胶的胶原蛋白和糖胺聚糖及研究糖胺聚糖与趋化因子的相互作用[D]. 李雪. 山东大学, 2020(11)
- [7]昆虫受体氨肽酶-N仿生聚合物纳米颗粒的设计及对Bt蛋白的选择性识别[D]. 李雨欣. 华中农业大学, 2020
- [8]用于药物高效负载和肿瘤特异性药物递送的聚合物纳米载体及其抗肿瘤治疗研究[D]. 吴宇辰. 苏州大学, 2020(02)
- [9]人源化半合成纳米抗体文库的构建及CD47纳米抗体的研制[D]. 郭瑞峰. 华东理工大学, 2021(08)
- [10]皱皮木瓜籽活性物的分离、结构特征及生物活性研究[D]. 邓叶俊. 中国林业科学研究院, 2020