产细菌素菌株的筛选及其所产细菌素Bacillocin TK1的功能研究

论文摘要

细菌素（bacteriocin）是细菌在代谢过程中由核糖体合成基因编码的一类具有生物活性的多肽或蛋白质类物质。与抗生素相比,细菌素具有靶向性强、安全和不容易产生耐药性等优点。乳酸菌作为最主要的益生菌来源,可改善宿主肠道屏障功能。但目前,对乳酸菌细菌素的益生作用研究较少。本论文从实验室前期分离保藏的12株乳酸菌中筛选出产细菌素的菌株,提取并高度纯化细菌素,通过体外试验研究细菌素对IPEC-J2细胞屏障及炎症调节的作用。研究内容和结果如下:试验1产细菌素菌株的筛选以金黄色葡萄球菌ATCC25923、产肠毒素大肠杆菌K88ac、猪霍乱沙门氏菌C78-1、单增李斯特菌1598和产气荚膜梭菌C型5株致病菌株为指示菌,采用牛津杯法从12株乳酸菌中筛选出抑菌效果最好的菌株TC23。排除有机酸和过氧化氢的干扰后,其发酵上清液对大肠杆菌K88ac仍具有抑菌活性,经蛋白酶处理后抑菌活性消失。通过菌体形态观察、生理生化鉴定及16SrDNA序列分析确定TC23为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）,并命名为Bacillus coagulans TK1。试验2细菌素的分离纯化将Bacillus coagulans TK1接种在MRS培养基中37℃培养18h,用饱和度为80%的硫酸铵沉淀培养上清中的细菌素,随后用SP Sepharose Fast Flow阳离子交换色谱和Sephadex G50凝胶过滤层析纯化细菌素。Tricine-SDS-PAGE分析显示其分子量大小在4.610 kDa。研究细菌素的生物学特性发现其对热稳定,在pH 48范围内有良好的稳定性。用LC-MS/MS分析细菌素,确定其分子量为11207Da,N端序列为GGAGMNPIDYDR,经BLAST比对确定其为一种新型细菌素,将其命名为Bacillocin TK1。试验3细菌素Bacillocin TK1对IPEC-J2细胞的影响⑴黏附试验。将细菌素Bacillocin TK1、产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic E.coli,ETEC）K88ac与培养10d后的IPEC-J2细胞共孵育,发现Bacillocin TK1可以显著抑制K88ac对IPEC-J2的黏附。为了检测Bacillocin TK1的添加顺序是否对抑制黏附效果有影响,我们做了如下试验:IPEC-J2细胞与Bacillocin TK1和K88ac共孵育,或者IPEC-J2细胞先与Bacillocin TK1共孵育,再与K88ac共孵育,或者IPEC-J2细胞先与K88ac共孵育,再与Bacillocin TK1共孵育,分别检测K88ac的黏附数。结果显示用Bacillocin TK1提前孵育IPEC-J2细胞,其抑制K88ac黏附细胞效果最显著。⑵Bacillocin TK1对IPEC-J2细胞分泌炎性因子的调节作用。首先,用Bacillocin TK1预处理细胞3h,之后更换新鲜的完全培养基,再加入诱炎因子K88ac处理细胞,之后检测细胞炎性因子的表达。结果发现Bacillocin TK1能够缓解K88ac诱导的IL-8和TNF-α的上调和TGF-β1的下调,并且促进IL-10的表达。⑶Bacillocin TK1对IPEC-J2细胞屏障的影响。将IPEC-J2细胞培养10d,待形成完整的膜结构开始试验。首先,用Bacillocin TK1预处理细胞18h,之后更换新鲜的完全培养基,再加入K88ac,在3、6、9、18h测量其跨膜电阻（TEER）。结果显示Bacillocin TK1能够保护IPEC-J2细胞膜结构的完整性,并能缓解K88ac对IPEC-J2细胞膜结构的破坏。用Western Blot检测Bacillocin TK1对k88ac诱导的IPEC-J2细胞中OCLN、CLDN1和ZO-1紧密连接蛋白表达的影响。结果显示Bacillocin TK1可以显著缓解k88ac诱导的细胞中3种紧密连接蛋白表达的下调。

论文目录

摘要

Abstract

缩略表（Abbreviation）

第一章前言

1 研究背景

2 文献综述

2.1 细菌素

2.1.1 细菌素的概念及分类

2.1.2 抑菌作用机制

2.1.3 细菌素的提取和纯化

2.1.4 细菌素在畜牧行业中的应用

2.2 肠上皮细胞

2.3 益生菌代谢物改善肠道防御功能的研究进展

3 研究目的与意义

第二章产细菌素菌株的筛选与鉴定

1 引言

2 试验材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 主要试剂

2.1.3 试剂配制

2.1.4 主要仪器设备

2.2 试验方法

2.2.1 菌种活化及培养

2.2.2 抑菌效果的测定

2.2.3 抑菌物质的初步鉴定

2.2.4 菌株TC23的鉴定

2.2.5 菌株TC23生长曲线、p H和抑菌能力的关系

3 结果与分析

3.1 产细菌素菌株的筛选

3.2 抑菌物质的初步鉴定

3.2.1 有机酸的排除

3.2.2 酶的敏感性试验

3.3 菌株TC23的鉴定

3.3.1 形态学鉴定及生理生化鉴定

3.3.2 16Sr DNA基因序列同源性分析

3.4 菌株TC23生长曲线、p H和抑菌能力的关系

4 讨论

4.1 抑菌试验方法的选择

4.2 乳酸菌产细菌素的鉴定

4.3 凝结芽孢杆菌及其抑菌作用

5 小结

第三章细菌素的分离纯化与鉴定

1 引言

2 试验材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 菌种与培养基

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器设备

2.1.4 试剂配制

2.2 试验方法

2.2.1 硫酸铵粗提细菌素

2.2.2 纯化细菌素

2.2.3 Tricine-SDS-PAGE电泳检测

2.2.4 细菌素的结构鉴定

2.2.5 细菌素的稳定性研究

3 结果与分析

3.1 硫酸铵沉淀法提取细菌素

3.2 SP Sepharose Fast Flow纯化细菌素

3.3 Sephadex G50凝胶过滤层析细菌素

3.4 Tricine-SDS-PAGE电泳结果

3.5 LC-MS/MS鉴定细菌素结构

3.6 温度对Bacillocin TK1抑菌活性的影响

3.7 p H对Bacillocin TK1抑菌活性的影响

4 讨论

5 小结

第四章 Bacillocin TK1对ETEC感染IPEC-J2细胞保护作用的研究

1 引言

2 试验材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 菌株和细胞

2.1.2 主要试剂

2.1.3 试剂配制

2.1.4 主要仪器

2.2 试验方法

2.2.1 细胞复苏和培养

2.2.2 细菌培养和处理

2.2.3 细菌素Bacillocin TK1的浓度测定

2.2.4 Bacillocin TK1对IPEC-J2细胞毒性的检测

2.2.5 Bacillocin TK1抑制K88ac黏附IPEC-J2细胞试验

2.2.6 Bacillocin TK1对IPEC-J2细胞炎性因子的调节作用

2.2.7 Bacillocin TK1对IPEC-J2细胞屏障功能的影响

2.2.8 Bacillocin TK1对IPEC-J2细胞紧密连接蛋白表达的影晌

3 试验数据处理和分析

4 结果与分析

4.1 BCA法测定Bacillocin TK1浓度

4.2 Bacillocin TK1对IPEC-J2细胞的毒性影响

4.3 Bacillocin TK1对K88ac黏附IPEC-J2细胞的影响

4.4 Bacillocin TK1对IPEC-J2细胞炎性因子表达的影响

4.5 Bacillocin TK1对IPEC-J2细胞TEER的影响

4.6 Bacillocin TK1对IPEC-J2细胞紧密连接蛋白表达的影响

5 讨论

5.1 Bacillocin TK1对K88ac黏附IPEC-J2细胞的影响

5.2 Bacillocin TK1对IPEC-J2细胞炎性因子表达的影响

5.3 Bacillocin TK1对IPEC-J2细胞屏障的影响

6 小结

参考文献

附录

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 师帅

导师: 毕丁仁,肖运才

关键词: 细菌素,分离纯化,炎性因子,紧密连接蛋白

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 华中农业大学

基金: 国家重点研发计划(2017YFD0501000)

分类号: S852.6

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000509

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