小管福寿螺Cu2+抗性相关基因筛选及其抗性机制初探

论文摘要

目的:小管福寿螺(Pomaceacanaliculata是一种典型的入侵性食草生物,更是一种重要热带病传播相关媒介生物。其在广州管圆线虫病的发生和传播过程中起到了非常重要的作用,对我国居民健康构成了巨大的威胁。目前,我国小管福寿螺的防制效果不太理想。该物种易于入侵、难于防制的重要原因之一是其极强的环境适应能力。开展对小管福寿螺的环境适应性机制的研究,有助于深入了解该重要热带病传播相关入侵媒介生物的生物学特性,对于制定和完善我国今后的小管福寿螺防制策略具有重要意义。野外调查显示,小管福寿螺对重金属污染严重水体适应性较强。相比于Fe,Cd等重金属,重金属Cu在电镀冶金、机械制造、消毒剂及农药生产等诸多方面有着更为广泛的应用,更易进入水体造成污染,水体中的Cu主要以CLu2+形式存在,其生物毒性显著,污染情况日益严峻。研究表明,小管福寿螺的Cu2+耐受能力显著高于其他淡水螺群。但是对小管福寿螺Ca2+适应性较强这一现象的研究,目前仅限于小管福寿螺自身趋避行为和病理生理学变化,相关功能基因的研究尚未见有涉及。因此,本研究着眼于筛选出一批小管福寿螺Cu2+抗性相关功能基因,为深入研究小管福寿螺Cu2+胁迫适应的分子机制提供有价值的候选基因。此外,本研究对候选基因中的金属硫蛋白基因（PcMT）和谷胱甘肽硫转移酶基因（PcGST1和PcGST2）的基本特征、与其他物种同源基因的遗传进化关系、组织表达本底水平、Cu2+胁迫前后表达量变化情况和Cu2+抗性功能进行分析,并构建原核表达载体,获得纯化的PcMT和PcGST2蛋白,初步探索小管福寿螺可能的Cu2+耐受机制。方法:①在Cu2+胁迫下小管福寿螺血液转录组测序获得的结果基础上,筛选出一批Cu2+抗性相关功能基因,对这些基因的可靠性通过实时荧光定量PCR方法验证。②选择其中的PcMT、PcGST1和PcGST2基因开展进一步研究,通过PCR方法扩增基因编码区,利用生物学信息学方法分析基因基本特征,利用MEGA 7.0软件构建进化树分析与其他物种同源基因的遗传进化关系,利用实时荧光定量PCR方法分析组织（肝脏、肾脏、鳃、血液和肠）基因的本底表达水平和Cu2+（50、100、150 μg/L）胁迫下（0、1、7、14d）组织中（肝脏、肾脏、鳃）基因的表达量变化情况。③选择pET28a为表达载体,构建pET28a-PcMT和pET28a-PcGST2质粒,利用IPTG诱导PcMT和PcGST2蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,利用Ni-NDA亲和层析法纯化PcMT和PcGST2蛋白。分析OD600值变化,比较含pET28a-PcMT和pET28a-PcGST2质粒的转化菌株与含pET28a空载体的非转化菌株在Cu2+胁迫下生长情况,初步验证PcMT和PcGST2基因Cu2+抗性功能。结果:小管福寿螺体内金属硫蛋白、热休克蛋白、谷胱甘肽硫转移酶、复肌球蛋白和天冬氨酸氧化酶等17个基因的差异表达与Cu2+胁迫存在一定的相关性。②研究的PcMT基因编码区全长272bp,共编码87个氨基酸,不含芳香族氨基酸和组氨酸,其末端序列CQCGKGCTGADSCKCDRKCSCK与软体动物MT特征保守序列CXCXXXCTGXXXCXCXXXCXCK完全一致,属于软体动物金属硫蛋白家族2:亚家族mog:腹足纲金属硫蛋白。PcMT蛋白含有较高的Cys残基（22个,25.3%）和较多的巯基金属簇的特征保守结构Cys-X（1-3）-Cys（17个）,可能具有很强的金属结合能力,经氨基酸序列对比,PcMT与同属另一种福寿螺Pomacea bridgesi的金属硫蛋白同源性最高,为93%。③以未经Cu2+胁迫的小管福寿螺肝脏组织样本第一次实验获得的结果为对照1.0±0.0,发现PcMT基因的表达具有组织差异性,在小管福寿螺各组织中的表达量分别为:鳃2.4±0.4>肝1.0±0.1>肠0.9±0.1>肾脏0.7±0.1>血液0.5±0.09。④小管福寿螺PcT基因对环境中Cu2+敏感,以未经Cu2+胁迫的小管福寿螺对应组织样本第一次实验结果作为对照1.0±0.0,50μg/L即可诱导该基因在肝脏、鳃和肾组织中表达,且诱导表达的效果与胁迫时间呈较好的正相关,14d时基因表达量分别为2.03±0.3,3.4±0.4,2.8±0.6。100μg/LCu2+胁迫下,小管福寿螺肝脏组织中PcMT基因表达量与胁迫时长呈正相关,14d时基因表达量为2.3±0.3。而在肾组织和鳃组织中,表达量与胁迫时间呈现倒U型的特征,峰值均出现在第7d,分别为5.2±0.6和8.5±1.1。150 μ g/L Cu2t胁迫下,小管福寿螺肝脏、鳃和肾组织中PcMT基因的表达量与胁迫时间均呈现倒U型的特征,肝脏组织峰值出现在第7d,为3.3±0.8,鳃和肾组织峰值出现在第1d,分别为7.001±0.4、9.1±0.8。⑤研究的PcGST1和PcGST2基因编码区全长分别为591bp和603bp,分别编码196和200个氨基酸,末端分别含有GST-C-3和GST-C-σ超家族结构域,可与重金属胁迫产生的活性氧自由基等有害亲电子底物结合,两者N末端均为GST-N-σ结构域超家族,可与还原型谷胱甘肽结合。PcGST1和PcGST2与同腹足纲的加州海兔（Aplysia californic）和光滑双脐螺（Biomphalariaglabrata）亲缘关系较近,聚为一支,而与双壳纲软体动物夷虾扇贝（Mizuhopecten yessoensis）、栉孔扇贝（Azumapectenfarreri）和海湾扇（Argopecten irradianm）等的 GSTs蛋白亲缘关系较远,分支较长,σ型GST蛋白可能在软体动物腹足纲和双壳纲形成过程中出现了一定程度的分化。⑥同亚型不同谷胱甘肽硫转移酶基因之间组织本底表达水平不完全相同,以未经Cu2+胁迫的小管福寿螺肝脏组织样本第一次实验结果作为对照1.0±0.0,PcGST1基因本底表达水平为:血液8.5±0.3>鳃1.4±0.2>肝脏1.1±0.2>肠1.03±0.1>肾脏0.4±0.08,PcGST2基因本底表达水平为:血液5.8±0.9>肠 1.6±0.4>肝脏0.8±0.1>鳃0.2±0.02>肾脏0.2±0.01。⑦同亚型不同的谷胱甘肽硫转移酶基因之间Cu2+胁迫下表达模式不完全相同,以未经Cu2+胁迫的小管福寿螺对应组织样本第一次实验结果作为对照1.0±0.0,Cu2+胁迫对PcGST1基因表达的影响为:肝组织中,50μg/L和100μg/LCu2+胁迫下PcGST1基因表达量0-14d持续上升,14d时表达量分别为2.1±0.1和5.2±0.7,而150μg/Lu2+胁迫下,1d达到峰值,为11.3±1.8。鳃组织中,50μg/L浓度Cu2+胁迫下基因表达量变化不明显,而150 u g/L浓度Cu2+胁迫时1d即可达到表达量峰值,为15.8±8.3。肾组织中50μg/L、100μg/L和1500μg/L浓度均可诱导表达,但50 μμg/L诱导期较短为7d,表达峰值较低,为3.1±0.3,150 μg/L诱导期较长为14d,但表达峰值较高,为5.6±2.6。⑧以未经Cu2+胁迫的小管福寿螺对应组织样本第一次实验结果作为对照1.0±0.0,Cu2胁迫对PcGST2基因表达的影响为:肝组织中,50μg/LCu2+胁迫下0-14d基因表达量持续上升,14d时表达量为4.9±0.5,100、150 μg/LCu2+胁迫下,PcGST2基因的相对表达量在0-7d呈上升趋势,7d时表达量分别为13.01士3.03和12.2±2.2,随后呈下降趋势。鳃组织中,50、100 ug/LCu2+胁迫下,PcGST2基因的相对表达量的峰值均于7d达到峰值,分别为5.3±0.7、23.3±16.5,150 μg/LCu2+胁迫下,PcGST2基因的相对表达量于1 d达到峰值,为9.8±3.3。肾组织中,50 μg/LCu2+胁迫下,PcGST2基因的相对表达量随时间变化不显著,100 μg/LCu2+胁迫下,PcGST2基因的相对表达量前期随时间变化不显著,约于14 d时出现显著增加,表达量为3.9士1.04;150 μg/LCu2+胁迫下,PcGST2基因的相对表达量呈持续上升趋势,14d表达量为18.02±0.8。⑨成功构建了含pET28a-PcMT和pET28a-PcGST2质粒的BL21（DE3）大肠杆菌,在1mmol/LIPTG、20℃诱导下,分别可表达出17 000的PcMT蛋白和27 000的PcGST2蛋白,经Ni-NDA亲和层析纯化,最终获得了PcMT和PcGST2蛋白。⑩含pET28a-PcMT、pET28a-PcGST2质粒的转化菌株与含pET28a空载体的非转化菌株在正常的ILB液体培养基中,生长曲线接近,差异无统计学意义。而在含0.2mmol/LCuSO4的LB液体培养基中,转化菌株Cu2+的耐性较强,生长曲线优于非转化菌株,差异有统计学意义。结论:①小管福寿螺Cu2+适应的分子机制非常复杂,涉及到众多基因的协调参与,经实时荧光定量PCR验证的17个差异表达基因可靠性较高,可作为深入研究小管福寿螺Cu2+胁迫适应分子机理的候选基因。②Cu2+胁迫可以显著诱导小管福寿螺体内金属硫蛋白基因和谷胱甘肽硫转移酶基因的表达,金属硫蛋白基因和谷胱甘肽硫转移酶基因可能在小管福寿螺Cu2+胁迫适应过程中发挥了一定的作用。③小管福寿螺金属硫蛋白基因和谷胱甘肽硫转移酶基因可赋予转化菌株一定的Cu2+抗性能力,具有Cu2+抗性功能,这为下一步获得“金属硫蛋白基因和谷胱甘肽硫转移酶基因可提高小管福寿螺Cu2+耐受能力”直接证据奠定了基础。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 茅光耀

导师: 肖宁,郭云海,党志胜

关键词: 小管福寿螺,抗性相关基因,金属硫蛋白,谷胱甘肽硫转移酶,表达特征分析

来源: 中国疾病预防控制中心

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 中国疾病预防控制中心

基金: 国家重点研发计划项目“重要热带病传播相关的入侵媒介及其病原体的生物学特性研究(No.2016YFC1200500)

分类号: R384

总页数: 98

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