糖基转移酶在海藻糖制备中的应用性能表征、分子改造及其发酵优化

论文摘要

海藻糖是一种安全无毒的非还原性二糖,具有稳定和保护生物体或生物大分子等特殊性质,可应用于食品、化妆品、生物制剂、医药和农业等行业。海藻糖能够以淀粉为底物,在麦芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase）的催化作用下制得,成本低廉,生产潜力大。然而,在反应体系中常常会残留麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖等低分子量麦芽寡糖副产物,制约着海藻糖产量的提升。添加糖基转移酶,通过其糖基转移反应延长这些低分子量麦芽寡糖的链长,使之能够被MTSase和MTHase进一步催化利用,从而能够提高海藻糖产率。本研究选取了7种不同来源的糖基转移酶应用于海藻糖的制备,从中获得了应用效果最佳的源自Bacillus circulans的环糊精葡萄糖基转移酶（BcCGT）。考察了酶反应结束后的体系组分,发现仍剩余较多以麦芽糖为主的低分子量麦芽寡糖。为了继续提高底物利用率,进一步通过定向进化获得了对麦芽糖受体亲和性增强的突变体M234I,提升了海藻糖产率。在此基础上,将突变体M234I在枯草芽孢杆菌进行重组表达,并在3 L罐水平上实现了突变体M234I的高效制备。主要研究结果如下:（1）合成了源自Arabidopsis thaliana、Archaeoglobus fulgidus和Corynebacterium glutamicum的三种4-α-糖基转移酶（4αGTase）基因并以大肠杆菌为宿主进行异源表达。考察了其与本实验室前期重组表达的源自Paenibacillus macerans、Bacillus stearothermophilus和Bacillus circulans的三种环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）和源自Thermus aquaticus的4-α-糖基转移酶对海藻糖制备的影响,并进行了各酶添加量的优化。结果表明,以浓度为150 g·L-1,DE值16的麦芽糊精为底物时,加入1.8 U·mL-1的源自Bacillus circulans的环糊精葡萄糖基转移酶（BcCGT）时海藻糖产率最高,达到了74.1%,相比对照提高了24.0%。分析酶转化液组分发现,当在反应体系中加入糖基转移酶时,海藻糖含量越高,则葡萄糖含量越多,而麦芽糖和麦芽三糖等低分子量麦芽寡糖越少,同时发现麦芽糖在这些低分子麦芽寡糖中占比最高。（2）为进一步提高海藻糖产率,以大肠杆菌E.coli BL21（DE3）为表达宿主,设计和构建了以提高BcCGT对麦芽糖受体亲和力为目的的高通量筛选体系。经过多批筛选后,获得了一株对麦芽糖受体亲和力提高的突变体M234I,并对野生型酶和突变体进行了分离纯化和酶学定性,发现突变体M234I以麦芽糖为受体的Km降低至野生型的54.4%。将突变体M234I用于多酶复配体系生产海藻糖,海藻糖转化率进一步提高至77.2%,分析酶反应结束后的组分,发现体系内的葡萄糖和海藻糖含量增加,麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖等低分子麦芽寡糖减少。（3）构建带有突变体M234I基因的质粒pHY300PLK-bccgtM234I的枯草芽孢杆菌重组菌B.subtilis WS11/pHY300PLK-bccgtM234I,并优化了重组菌的摇瓶发酵培养基,确认最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为比例为7:1的隆科特玉米浆与大豆蛋白胨。对重组菌在3 L发酵罐中进行发酵并优化了补料培养基的碳氮比,当碳氮比为3:1,最高酶活达到1423.2 U·mL-1。

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摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 海藻糖的概述

1.1.1 海藻糖的结构、性质和功能

1.1.2 海藻糖的制备

1.1.3 海藻糖的应用

1.2 环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）概述

1.2.1 CGTase的来源

1.2.2 CGTase的结构与功能

1.2.3 CGTase的制备

1.2.4 CGTase的应用

1.3 4-α-糖基转移酶（4αGTase）概述

1.3.1 4αGTase的来源

1.3.2 4αGTase的结构与功能

1.3.3 4αGTase的制备

1.3.4 4αGTase的应用

1.4 枯草芽孢杆菌表达系统

1.4.1 枯草芽孢杆菌概述

1.4.2 提高重组蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达

1.5 立题依据及意义

1.6 本论文的主要研究内容

第二章材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌种、质粒及基因

2.1.2 试剂

2.1.3 主要仪器

2.1.4 培养基

2.2 基因工程相关操作方法

2.2.1 质粒抽提、产物纯化、琼脂糖凝胶回收

2.2.2 BcCGT基因的易错PCR

2.2.3 E.coli感受态细胞的制备

2.2.4 E.coli感受态细胞的热激转化

2.2.5 ClonExpress II无缝克隆连接体系

2.2.6 B.subtilis WS11 感受态细胞的制备

2.2.7 B.subtilis表达载体质粒的构建

2.2.8 B.subtilis WS11 感受态细胞的转化

2.3 BcCGT的高通量筛选方法

2.3.1 突变文库的构建

2.3.2 突变体的培养与表达

2.3.3 高通量筛选

2.4 发酵方法

2.4.1 重组大肠杆菌的发酵

2.4.2 重组枯草芽孢杆菌的发酵

2.5 分析方法

2.5.1 菌体生物量OD600的测定

2.5.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析

2.5.3 发酵液中葡萄糖浓度的测定

2.5.4 CGTase歧化活力测定

2.5.5 4αGTase歧化活力测定

2.5.6 重组蛋白的分离纯化

2.5.7 蛋白含量的测定

2.5.8 重组蛋白的酶学性质研究

2.5.9 重组蛋白的动力学常数的测定

2.6 糖基转移酶及突变体制备海藻糖应用探究

2.7 酶转化产物检测

2.8 分子模拟

第三章结果与讨论

3.1 糖基转移酶的重组表达及其在海藻糖制备中的应用性能表征

3.1.1 糖基转移酶表达重组菌的构建与表达

3.1.2 糖基转移酶在海藻糖制备中的应用性能表征

3.2 BcCGT定向进化提高其对麦芽糖受体的亲和性

3.2.1 BcCGT的高通量筛选

3.2.2 BcCGT及其突变体的蛋白纯化

3.2.3 BcCGT及其突变体的酶促反应动力学分析

3.2.4 BcCGT及其突变体的酶学性质研究

3.2.5 突变体M234I应用于海藻糖制备中的研究

3.2.6 突变位点M234I影响酶动力学性质的理论分析

3.3 BcCGT在枯草芽孢杆菌中的表达

3.3.1 重组菌B.subtilis WS11/pHY300PLK-bccgtM234I的构建

3.3.2 碳源对重组菌生长和产酶的影响

3.3.3 氮源对重组菌生长和产酶的影响

3.3.4 重组菌的3L罐补料分批发酵实验

主要结论和展望

主要结论

展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杜立

导师: 吴敬

关键词: 海藻糖,环糊精葡萄糖基转移酶,葡萄糖基转移酶,定向进化,发酵优化

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,有机化工,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: TQ920.6;TQ281

总页数: 57

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糖基转移酶在海藻糖制备中的应用性能表征、分子改造及其发酵优化

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