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环介导等温扩增技术对诺如病毒检测的研究

2020-12-02阅读(278)

环介导等温扩增技术对诺如病毒检测的研究

论文摘要

核酸等温扩增技术（Isothermal amplification technology）的反应过程始终维持在恒定温度,不需要精密的温度控制仪器,在体外核酸检测方面有独特的优势,是一种便利的体外核酸快速检测方法。而环介导等温核酸扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是在60-65℃条件下,通常在一小时内进行核酸扩增,是一种强大的等温核酸扩增方法,反应产生大量焦磷酸镁白色沉淀,所以可以通过肉眼观察来判断靶基因是否存在。但缺点是在反应过程中常发生非特异性扩增而产生假阳性信号。为了提高检测结果的准确性,本论文分别将LAMP扩增与一步链置换反应（One-step strand displacement,OSD）和杂交链式反应（Hybridization chain reaction,HCR）联用,并分别借流式细胞仪、血糖仪等最终实现了诺如病毒基因的多手段灵敏检测。在磁球协助的分离纯化后,实现了在外加粪便中检测到了30个拷贝的诺如病毒DNA。具体研究内容如下:LAMP与OSD联用,借助实时荧光定量PCR仪检测诺如病毒:普通的DNA染料（Evagreen）没有特异性识别DNA序列的功能,而OSD探针可对LAMP产物进行特异性识别。因而,通过LAMP-OSD的偶联,通过优化反应条件,可以避免假阳性问题。但是,在粪便溶液中检测诺如病毒或者加入具有干扰性的轮状病毒LAMP产物时,LAMP-OSD荧光信号易受影响,而不利于信号的检测。LAMP与HCR联用,借助流式细胞仪检测诺如病毒:本研究提出了LAMP与HCR联用型基因检测新技术,并对该联用技术的可行性、必要性和技术优势进行了验证。带有荧光基团的DNA在磁球表面发生LAMP-HCR扩增。将带有LAMP-HCR产物的磁球应用流式细胞仪进行检测,最低可检测到30拷贝的诺如病毒基因。由于磁球的分离纯化作用,即使加入不同百分比的粪便样品（0.1%2%）,检测效果完全没有受到影响。LAMP与HCR联用,借助血糖仪检测诺如病毒:带有蔗糖酶的DNA在上述的磁球表面发生LAMP-HCR扩增,然后将带有扩增产物的磁球与蔗糖混合,蔗糖酶会水解蔗糖为葡萄糖,进而可用血糖仪进行检测。在2%的粪便样品中,也可检测到30拷贝的诺如病毒基因,同时还可实现诺如病毒的现场快速诊断。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第1章 绪论
  •   1.1 引言
  •   1.2 核酸检测的分类及原理
  •   1.3 环介导等温扩增（LAMP）技术的原理及应用前景
  •     1.3.1 LAMP技术的原理
  •     1.3.2 LAMP技术的应用前景
  •   1.4 LAMP技术的检测方法
  •     1.4.1 琼脂糖凝胶分析法
  •     1.4.2 实时浑浊度检测法
  •     1.4.3 直接观察法
  •   1.5 杂交链反应
  •     1.5.1 杂交链反应的反应机理
  •     1.5.2 HCR在检测中的应用
  •   1.6 LAMP技术的国内外研究进展
  •     1.6.1 国外研究现状
  •     1.6.2 国内研究现状
  •   1.7 本论文的研究意义及主要内容
  •     1.7.1 研究意义
  •     1.7.2 主要内容
  • 第2章 LAMP-OSD扩增方法检测诺如病毒基因
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验过程
  •     2.2.1 药品与试剂
  •     2.2.2 实验仪器
  •     2.2.3 琼脂糖凝胶电泳分析方法
  •     2.2.4 应用扦插染料检测诺如病毒基因
  •     2.2.5 应用OSD探针法对LAMP反应条件的优化
  •     2.2.6 粪便中诺如病毒基因的检测
  •     2.2.7 LAMP-OSD方法的特异性研究
  •   2.3 实验结果与讨论
  •     2.3.1 LAMP引物设计的关键因素
  •     2.3.2 LAMP引物的模拟分析
  •     2.3.3 应用LAMP-Evagreen法对诺如病毒基因的检测
  •     2.3.4 诺如病毒OSD的设计及LAMP实验优化
  •     2.3.5 加入粪便的LAMP-OSD反应
  •     2.3.6 特异性考察
  •   2.4 本章小结
  • 第3章 应用流式细胞仪检测诺如病毒基因
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验过程
  •     3.2.1 药品与试剂
  •     3.2.2 实验仪器
  •     3.2.3 琼脂糖凝胶电泳验证HCR的设计实验
  •     3.2.4 验证LAMP-HCR的偶联
  •     3.2.5 流式细胞仪检测诺如病毒实验方法
  •     3.2.6 验证磁球表面非特异性吸附实验方法
  •     3.2.7 LAMP-OSD应用流式细胞仪检测
  •   3.3 实验结果讨论
  •     3.3.1 流式细胞仪检测诺如病毒机理图
  •     3.3.2 琼脂糖凝胶电泳验证HCR的设计
  •     3.3.3 丙烯酰胺凝胶电泳验证HCR反应
  •     3.3.4 流式细胞仪检测环模拟物
  •     3.3.5 流式细胞仪验证HCR的放大作用
  •     3.3.6 磁球非特异性吸附的验证
  •     3.3.7 HCR扩增的条件优化
  •     3.3.8 验证LAMP-HCR的杂交
  •     3.3.9 灵敏度和特异性
  •     3.3.10 应用流式细胞仪检测LAMP-OSD反应
  •   3.4 本章小结
  • 第4章 应用血糖仪检测诺如病毒基因
  •   4.1 引言
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 药品与试剂
  •     4.2.2 实验仪器
  •     4.2.3 H2-15 与蔗糖酶的连接
  •     4.2.4 血糖仪检测诺如病毒
  •     4.2.5 验证LAMP-HCR的发生
  •   4.3 结果与讨论
  •     4.3.1 血糖仪检测诺如病毒机理
  •     4.3.2 血糖仪检测环模拟物
  •     4.3.3 验证LAMP-HCR的发生
  •     4.3.4 特异性与灵敏度考察
  •   4.4 本章小结
  • 第5章 结论与展望
  •   5.1 结论
  •   5.2 主要创新点
  •   5.3 研究展望
  • 参考文献
  • 攻读学位期间取得的成果
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 董青

    导师: 马玉芹

    关键词: 诺如病毒,环介导等温扩增技术,一步链置换反应,杂交链式反应

    来源: 长春理工大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,化学

    单位: 长春理工大学

    分类号: O652;Q52

    总页数: 70

    文件大小: 2871K

    下载量: 309

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