林志雄[1]2004年在《胶质瘤细胞和血管内皮细胞相互作用对胶质瘤微生态系统与组织重构影响的初步研究》文中认为目的 通过研究FN和VEGF对胶质瘤细胞和血管内皮细胞相互作用的影响及与侵袭的关系;同时,采用基因工程技术把胶质瘤细胞和血管内皮细胞相互作用的刺激因子VEGF和抑制因子内皮抑素分别或同时转染至C_6细胞上,通过观察其阳性克隆子在裸鼠皮下移植瘤的微生态系统及重构后的肿瘤组织的形态学特征,来初步探讨胶质瘤细胞和血管内皮细胞相互作用对肿瘤微生态系统与组织重构的影响及规律。 方法 ①在体外建立不同的C_6细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的共培养系统,利用电镜技术研究胶质瘤细胞和血管内皮细胞相互作用的特征性结构—血瘤屏障的形态特征及与人体胶质瘤组织中血瘤屏障的区别;免疫细胞化学技术鉴定胶质瘤细胞和血管内皮细胞相互作用后的层粘连蛋白(Laminin,LN)在血管内皮细胞上的表达变化,,以期建立一种既可以排除体内复杂因素的影响,又接近于肿瘤体内生长的内环境的,同时又能满足研究要求的胶质瘤细胞和血管内皮细胞的相互作用系统。②在体外利用Transwell共培养系统对HUVECs和C_6胶质瘤细胞进行共培养;RT—PCR和免疫细胞化学方法检测经共培养后C_6细胞和HUVECs上FN的基因转录及蛋白的表达情况;采用体外快速侵袭力测定法检测不同功能状态的HUVECs对C_6细胞侵袭力的影响及在FN抗体封闭下的变化;同样的方法检测不同状态的C_6细胞对HUVECs迁移力的影响及在VEGF和FN抗体封闭下对HUVECs迁移力的影响。③利用RT—PCR法从1日龄大鼠脑组织中扩增出内皮抑素和正义或反义VEGF_(164)基因,并将获得的基因依次重组入真核表达载体pBud4.1CE上。重组子鉴定后利用脂质体方法转染C_6细胞,Zeocin抗性筛选,Western-blot方法和ELISA方法检测鉴定阳性克隆子。把鉴定后的阳性克隆子接种裸鼠皮下,观察内皮抑素基因和/或反义/正义VEGF对C_6胶质瘤体内生长的影响,光镜和电镜技术系统观察比较了转染有内皮抑素和反义/正义VEGF的C_6胶质瘤细胞在裸鼠皮下的移植瘤标本中重构的TMES的形态学特
黄纯海[2]2008年在《EGFL7基因在人脑胶质瘤中的表达、作用及机制研究》文中研究说明背景:胶质瘤是最常见的脑部恶性肿瘤,尽管目前在外科治疗及肿瘤基因治疗上取得了一些进展,但是总的来说其预后仍然很差,尤其是胶质母细胞瘤尚无有效的措施从根本上改善其预后。所以,深入研究其发生发展的细胞及分子机制具有重大现实意义。血管新生是生理性及病理性血管生成的主要形式,研究发现实体性肿瘤的生长高度依赖于血管的新生,因而关于血管新生与恶性肿瘤的发生、发展及转移的关系近年来已逐渐成为研究热点。目前国内外学者也进行了一系列针对肿瘤血管新生的实验及临床研究,并取得了一些可喜的成果。绝大部分脑胶质瘤属于实体性肿瘤,研究表明它亦具有高度血管化的的特征,它通过新生的血管供应必需的O_2及营养物质而不断增殖并向周围组织侵袭。因此,抗血管生成是治疗胶质瘤极具希望的策略之一,但其血管新生的调节机制目前尚不太清楚,寻找和识别在这一过程中的关键性调控因子将是抗胶质瘤血管生成的有效途径,具有重要意义。EGFL7是一新发现的内皮细胞源性分泌性因子。它在胚胎及富血管组织存在高表达,而在大多数成熟组织中表达水平均很低。研究表明,当沉默EGFL7基因表达后胚胎血管形成过程中其血管不能形成管状结构,提示它是血管新生过程中的管状结构形成的关键调控因子。由于管状结构的形成对于新生血管发挥其正常功能至关重要,所以EGFL7将有望成为抗血管生成治疗的关键性靶点。目前关于EGFL7的报道研究尚不多,而且主要集中于胚胎发育及血管损伤等生理性血管新生方面。它在肿瘤等病理性血管新生中的表达及作用尚未见报道;在人脑胶质瘤中的表达及其作用机制目前国内外亦无相关研究报道。我们推测其在胶质瘤的血管生成中亦起着关键性调控作用,但是这一推测尚待在体内外胶质瘤模型中去研究证实。目的:探讨EGFL7基因在人脑胶质瘤组织中的表达情况;并通过RNAi沉默EGFL7基因在人胶质母细胞瘤细胞株U251及人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC中的表达,探讨了EGFL7在胶质瘤血管新生过程中的可能作用及机制。方法:收集36例新鲜胶质瘤标本,其中包括21例低度恶性(Ⅰ～Ⅱ级)及15例高度恶性者(Ⅲ～Ⅳ级),用RT-PCR检测其EGFL7mRNA的表达。另收集45例胶质瘤石蜡标本,其中包括24例低度恶性(Ⅰ～Ⅱ级)及21例高度恶性者(Ⅲ～Ⅳ级),用免疫组织化学检测EGFL7蛋白、Ⅷ因子及Ki-67的表达情况。并分析EGFL7蛋白的表达与胶质瘤的病理分级、胶质瘤Ki-67标记指数(LI)及微血管密度(MVD)的关系。构建针对人EGFL7的小RNA干扰序列以研究其对胶质瘤血管生成的影响:设计选取四对不同的RNAi序列及一对普适性阴性对照序列构建短发夹结构RNA,然后将其克隆入pGCL-GFP载体并进行PCR及DNA测序鉴定。同时,构建含有增强型绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)的人EGFL7-flag过表达的重组质粒载体pEGFP-C1以用于外源性筛靶。用Lipofectamin脂质体法将重组pGCL-GFP及pEGFP-C1共转染293T细胞,然后用Western Blot检测各shRNA序列对EGFL7的基因沉默效率。选取基因沉默作用最明显的序列进行慢病毒包装,命名为pGCL-GFP-vshEGFL7。通过检测GFP的表达来测定包装的慢病毒滴度。先用real-time quantitative PCR及免疫组织化学方法检测EGFL7 mRNA及其蛋白在人胶质母细胞瘤细胞株U251及人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC中的表达情况,然后用慢病毒载体pGCL-GFP-vshEGFL7感染该两种细胞。用real-time quantitative PCR验证shRNA对U251细胞及HUVEC中EGFL7基因的沉默作用。为研究体内胶质瘤微环境中肿瘤细胞对内皮细胞的作用,用Transwell技术体外建立了U251细胞与HUVEC共培养模型。然后沉默EGFL7基因表达,用MTT检测U251细胞及HUVEC的增殖活性;流式细胞仪检测HUVEC的细胞周期分布及凋亡率;结晶紫染色法检测HUVEC的粘附及迁移能力;体外毛细胞血管样结构形成实验分析HUVEC成血管能力变化。结果:①检测到EGFL7mRNA及其蛋白在人脑胶质瘤中存在表达,EGFL7蛋白表达主要定位于肿瘤细胞及血管内皮细胞的胞浆,且其表达与肿瘤的恶性程度(t=4.399,P＜0.01),Ki-67 LI(r=0.793,P＜0.01)及MVD(r=0.684,P＜0.01)有明显的相关性;EGFL7在正常脑组织中没有表达。②含针对EGFL7的shRNA慢病毒载体pGCL-GFP及EGFL7真核过表达载体pEGFP-C1经PCR及测序鉴定完全正确;pEGFP-C1转染293T细胞后能够强烈表达报告基因EGFP;pGCL-GFP与pEGFP-C1共转染293T细胞后,Western Blot检测发现四对shRNA序列中,序列5′-CCGAACCATC7ATAGGACC-3′(512～530)对EGFL7基因特异性沉默作用最为显着;进行病毒包装后经检测干扰组及普适性阴性对照组慢病毒滴度分别为4.8×10~7TU/ml及5.0×10~7TU/ml以上。③U251细胞及HUVEC中均存在EGFL7mRNA及其蛋白的表达。EGFL7免疫阳性产物主要位于该两种细胞的胞浆中。与普适性对照及正常对照组相比,pGCL-GFP-vshEGFL7对U251细胞及HUVEC中EGFL7mRNA表达有显着的沉默作用(P＜0.01);而两对照组之间无明显差异(P＞0.05).④EGFL7基因沉默48h后,U251细胞的增殖活性亦明显低于普适性对照及正常对照组(P＜0.01),而后两组无明显差异(P＞0.05);EGFL7基因沉默对单纯培养的HUVEC增殖活性、迁移能力、细胞周期及凋亡率无明显影响(P＞0.05);其对胶质瘤微环境中HUVEC迁移能力亦无明显影响(P＞0.05),但是EGFL7基因沉默后48h至4d时HUVEC细胞增殖活性与两对照组相比明显下降(P＜0.01),第5d后又恢复至正常(P＞0.05);无论单纯培养还是与U251共培养,EGFL7基因沉默均可导致HUVEC的粘附能力明显下降,并且均不能形成毛细血管样结构,与普适性阴性对照及正常对照组相比差异显着(P＜0.01),而后两组无明显差异(P＞0.05)。结论:1.人脑胶质瘤中肿瘤细胞及其血管内皮细胞均可表达EGFL7。HUVEC及U251细胞亦可合成和分泌EGFL7蛋白。在胶质瘤组织中EGFL7的表达与肿瘤恶性程度、KI-67 LI及MVD具有明显相关性。提示EGFL7在胶质瘤的生长、侵袭中发挥重要作用。2.本研究筛选出了针对人EGFL7基因的siRNA有效靶序列;并成功构建了针对EGFL7基因的慢病毒介导的shRNA载体;并证明该shRNA可显着地沉默U251细胞及HUVEC中EGFL7基因的表达。3.慢病毒介导的EGFL7基因沉默可以明显抑制HUVEC的粘附能力、成管能力及U251细胞的增殖活性。提示EGFL7在胶质瘤血管内皮细胞管状结构形成过程中起着关键性调控作用,并可直接促进肿瘤细胞的增殖活性。提示EGFL7可能是胶质瘤基因治疗一潜在靶点,并且以shRNA为基础针对EGFL7基因RNAi可能是一新的极具希望的治疗策略。
周椿昊[3]2013年在《血管内皮细胞对胶质瘤侵袭性生长的影响及其与Notch信号通路关系》文中研究表明研究背景和目的：胶质瘤是最常见而又最难治愈的中枢神经系统恶性肿瘤，占成人颅内肿瘤的５０％，手术治疗难度大，术后复发率高[1-2]。过去几十年间，尽管手术方法不断改进及放疗、化疗、免疫疗法、基因疗法等多种辅助疗法的综合应用，临床疗效取得一定进展，但其总体预后改善欠佳。胶质瘤无论分化高低均具有浸润性生长、富血管化、无包膜形成的生物学特性[3]。一般认为胶质瘤的高侵袭性、富血管化及肿瘤细胞与血管内皮细胞的相互作用影响正是胶质瘤难根治、易复发的根本原因[4]。有研究表明，胶质瘤的侵袭性生长与其所处的微环境密切相关[5-6]。血管内皮细胞与胶质瘤细胞的相互作用可促进胶质瘤的侵袭生长[8]，但其具体机制不明。Notch信号通路在中枢系统发育及新生血管生成过程中均发挥关键作用，Notch信号的激活与血管新生和胶质瘤细胞增殖关系密切[9]。由此我们提出假设，在血管内皮细胞促进胶质瘤的侵袭迁移过程中，Notch信号通路可能起着重要的调控作用。我们拟通过观察血管内皮细胞对胶质瘤细胞侵袭力的影响及Notch信号通路相关因子在其中的相应变化情况来探讨血管内皮细胞对胶质瘤细胞侵袭性生长作用的相关机制。研究内容和方法：1、在体外建立人脑胶质瘤母细胞U87及人脐静脉内皮细胞（HUVECs）共培养模型：将U87及HUVEC细胞均置于含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养，在37℃、5％CO2、湿度95％的恒温培养箱孵育。按实验要求将细胞分组，分别为单独培养U87细胞培养组，U87细胞与血管内皮细胞正常共培养组和DAPT阻断血管内皮细胞Notch信号通路与U87细胞共培养组。2、观察血管内皮细胞对胶质瘤侵袭性生长的影响。在体外利用Transwell共培养系统对人脐静脉内皮细胞和胶质瘤细胞U87进行共培养，采用体外快速侵袭力测定法检测胶质瘤细胞侵袭力在不同状态的血管内皮细胞作用下的变化。3、Real-Time PCR检测不同培养状态胶质瘤U87细胞Cathepsins B、MMP-9、MMP-2、Notch-1、Notch-2、Hes-1、Dll4基因表达。在体外利用Transwell共培养系统对人脐静脉内皮细胞和U87胶质瘤细胞进行共培养，使用荧光定量PCR检测共培养组的U87细胞的Notch基因及相关侵袭因子的表达与单独培养条件下比较的变化情况；4、观察不同培养状态下胶质瘤细胞体外血管拟态现象结果1、发现与血管内皮细胞共培养时，可致胶质瘤细胞U87侵袭力增加，而当阻断血管内皮细胞Notch信号通路后，可降低胶质瘤细胞的侵袭力增加幅度。穿膜数量分别为单独培养组40.0±3.92个，正常共培养组平均81.5±2.89个，DAPT抑制组为61.8±4.72个（P<0.05）。2、RT-PCR结果显示，与血管内皮细胞共培养后，胶质瘤细胞的CathepsinsB、MMP-9、Notch-1、Notch-2、Hes-1、Dll4基因mRNA表达上调，阻断血管内皮细胞的Notch信号通路后，Cathepsins B、MMP-9、Notch-1、Notch-2、Hes-1基因的上调幅度受限（P均<0.05），但DLL4无明显改变，而各组间MMP-2基因的表达无明显异同，不具有统计意义。其中Notch1mRNA的2-ΔΔCT分别为1、6.87、1.82；Notch2mRNA的2-ΔΔCT分别为1、22.78、14.52； Hes1mRNA的2-ΔΔCT分别为1、3.89、3.20；MMP-9mRNA的2-ΔΔCT分别为1、16.45、2.33；Cathepsins B mRNA的2-ΔΔCT分别为1、29.24、13.00；DLL4mRNA的2-ΔΔCT分别为1、9.38；3、在胶质瘤体外血管拟态中，胶质瘤细胞与血管内皮细胞共培养后，正常共培养组U87细胞可见细胞变为条索状且相互融合．连接成网络样结构。在对照组中，U87细胞单独培养12h后仍生长紊乱．无明显规律．但是在DAPT抑制共培养组中，U87细胞开始变形，有部分细胞出现互相连接，形成网络样结构，但远较正常共培养组少。结论：(1)与血管内皮细胞的共培养可促进胶质瘤细胞的侵袭性，并上调相应Notch信号通路相关基因及侵袭因子的表达；(2)阻断血管内皮细胞的Notch信号通路可抑制共培养条件下的胶质瘤侵袭程度，并降低共培养条件下相关基因的上调量；(3)胶质瘤的侵袭性生长可能是胶质瘤细胞和血管内皮细胞相互作用所引发的细胞外基质改变所致的结果。
参考文献：
[1]. 胶质瘤细胞和血管内皮细胞相互作用对胶质瘤微生态系统与组织重构影响的初步研究[D]. 林志雄. 苏州大学. 2004
[2]. EGFL7基因在人脑胶质瘤中的表达、作用及机制研究[D]. 黄纯海. 中南大学. 2008
[3]. 血管内皮细胞对胶质瘤侵袭性生长的影响及其与Notch信号通路关系[D]. 周椿昊. 南昌大学. 2013
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