铁蛋白在维持家蝇氧化还原平衡中的作用

2020-12-09阅读(1069)

论文摘要

铁是生物体不可或缺的金属元素,在DNA合成、细胞分裂等生物过程中发挥重要作用。然而,生物体内游离的铁含量异常增高则会诱发芬顿反应（Fenton reaction）,即诱导H2O2产生羟基自由基（·OH）,对机体造成氧化损伤。铁蛋白（ferritin）是生物体内储存铁的蛋白质,在维持体内铁稳态和免疫防御中发挥重要作用。铁蛋白含量变化可以衡量机体对外界胁迫环境的反应程度。家蝇生活周期短、抗病抗逆能力强,已经成为研究昆虫先天免疫的理想模式生物。本实验室前期对家蝇铁蛋白基因（MdFers）进行了克隆和原核表达,并对其组织分布和应对细菌刺激的表达模式进行了初步探究。本文在上述研究基础上,对家蝇铁蛋白在免疫方面的功能以及转铁蛋白（transferrin）在体内铁平衡中发挥的作用进行探究,研究内容如下:1、通过Western blot技术对家蝇MdFerH和MdFerL在氧化应激条件下的表达模式进行分析,发现机体在遭受氧化应激时显著上调铁蛋白表达。2、通过注射dsRNA成功干扰了家蝇幼虫体内MdFers的表达。结果显示,敲低MdFers表达会引起家蝇体内氧化应激反应,机体抵抗细菌侵染能力明显下降。3、利用构建的MdFers原核表达系统来探究家蝇铁蛋白对抗氧化应激的能力,发现表达家蝇铁蛋白能有效提高宿主菌对H2O2的抗性。4、通过PCR和RACE技术（Rapid-amplification of cDNA ends）获得了家蝇转铁蛋白基因的全长cDNA序列,并将其命名为MdTf。该序列包含一个1128 bp的完整开放阅读框（Open Reading Frame）,编码375个氨基酸,MdTf蛋白的理论分子量为42.8 kDa。对MdTf进行保守结构域预测,结果显示其存在转铁蛋白结构域,属于转铁蛋白超家族成员。通过原核表达得到了纯化的家蝇转铁蛋白,可为后续探究转铁蛋白功能奠定基础。

论文目录

摘要

abstract

第一章文献综述

1.1 前言

1.2 铁蛋白简介

1.3 铁蛋白生物学功能

1.3.1 铁蛋白抗氧化应激功能

1.3.2 铁蛋白与转铁蛋白之间的联系

1.4 铁蛋白的合成调控机制

1.5 转铁蛋白

1.6 顺乌头酸酶

1.7 无脊椎动物免疫系统

1.7.1 体液免疫

1.7.2 细胞免疫

1.7.3 昆虫免疫系统信号通路

1.8 本研究的目的及意义

第二章家蝇MdFers在免疫中的作用

2.1 实验材料

2.1.1 家蝇

2.1.2 引物

2.1.3 家蝇总RNA的提取以及c DNA的制备

2.2 实验方法

2.2.1 MdFers干扰载体的构建

2.2.2 MdFers基因RNAi及干扰效果检测

2.2.3 干扰MdFers后大肠杆菌刺激家蝇幼虫

2.3 实验结果

2.3.1 MdFers基因RNAi效果检测

2.3.2 干扰MdFers后家蝇抗菌能力降低

2.4 讨论

第三章家蝇MdFer的抗氧化功能

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.2.1 氧化应激条件下MdFers的表达分析

3.2.2 dsRNA干扰MdFers后家蝇体内氧化应激水平检测

3.2.3 干扰MdFers后家蝇体内顺乌头酸酶活性检测

2O₂ 的耐受分析'> 3.2.4 大肠杆菌对H₂O₂的耐受分析

3.3 实验结果

3.3.1 家蝇氧化应激条件下MdFers的表达分析

3.3.2 dsRNA干扰MdFers后家蝇体内氧化应激水平检测

3.3.3 dsRNA干扰MdFers后家蝇体内顺乌头酸酶活性检测

2O₂ 能力的影响'> 3.3.4 MdFers对大肠杆菌抗H₂O₂能力的影响

3.4 讨论

第四章家蝇MdTf的生物信息学分析及原核表达

4.1 实验材料

4.1.1 菌种、质粒

4.1.2 引物

4.2 实验方法

4.2.1 家蝇总RNA的提取以及c DNA的制备同上

4.2.2 家蝇MdTf基因的搜索与克隆

4.2.3 家蝇MdTf序列的生物信息学分析

4.2.4 构建原核表达载体

4.2.5 家蝇MdTf融合蛋白的原核表达

4.2.6 家蝇MdTf融合蛋白的可溶性分析及纯化

4.2.7 蛋白质定量以及标准曲线的制作

4.3 实验结果

4.3.1 家蝇MdTf基因的序列分析

4.3.2 家蝇MdTf蛋白的一级结构分析

4.3.3 家蝇MdTf的高级结构分析

4.3.4 家蝇MdTf蛋白的功能序列分析

4.3.5 MdTf重组蛋白的表达与纯化

4.3.6 蛋白质浓度标准曲线

4.4 讨论

第五章结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

致谢

攻读学位期间取得的科研成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李永保

导师: 柳峰松,张玉明

关键词: 家蝇,铁蛋白,转铁蛋白,氧化应激,先天免疫

来源: 河北大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 河北大学

分类号: Q51

总页数: 48

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标签：家蝇论文; 铁蛋白论文; 转铁蛋白论文; 氧化应激论文; 先天免疫论文;

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