斑马鱼aggf1基因在淋巴管发育过程中的关键功能研究

论文摘要

脊椎动物的淋巴管网络主要由毛细淋巴管、淋巴管和淋巴导管组成,几乎遍布全身,在维持组织液稳态、脂肪吸收、免疫细胞运输和免疫应答调节中发挥着重要作用。淋巴管发育异常会导致如淋巴水肿、免疫失调和肿瘤预后不良等一系列问题。淋巴管对维持生物体的正常机能十分重要,但与血管研究相比,目前人们对淋巴管的发育机制和调控网络的了解还远远不够。因此,发现并研究淋巴管分化与成熟过程中的新关键基因对完善淋巴管发育过程的分子信号通路和调控网络具有重要意义。先天性静脉畸形肢体肥大综合征（Klippel-Trenaunay syndrome,以下简称为KTS）是一种少见的先天性脉管畸形疾病,主要临床表现有毛细管发育畸形、静脉曲张、组织肥大和淋巴管发育畸形等。AGGF1是从一位发生染色体平衡易位的KTS患者中克隆出来的血管生成因子。体外研究证实,AGGF1不仅具有与VEGFA相似的促血管生成的能力,同时还参与细胞的凋亡、癌症细胞的生长与转移、机体炎症等重要过程。在斑马鱼的体内研究中发现,aggf1基因作用于scl和fli基因上游,调控血液血管母细胞的分化,影响血管系统和造血系统的发育;此外,aggf1基因还通过AKT信号通路影响静脉血管和体节间血管的发育。在小鼠的体内研究中发现,Aggf1通过调控细胞凋亡、自噬和内质网应激等影响心脏中血管的生成和心功能状态。然而,AGGF1基因与淋巴管发育的关系尚未有研究报道。在KTS发病群体中有许多病人表现出淋巴管畸形,因此推测AGGF1可能是淋巴管发育过程中的一个关键调控因子。本研究以斑马鱼为主要模式生物,借助吗啉代反义寡核苷酸（morpholino,MO）和TALEN基因编辑技术,分别构建斑马鱼aggf1基因敲低（knock down,KD）和敲除（knock out,KO）模型,采用Affymetrix表达谱芯片、荧光实时定量PCR、整胚原位杂交和m RNA回补实验等手段,研究了斑马鱼aggf1基因在淋巴管分化与发育中的作用,并探讨其调控淋巴管发育的分子机制。首先,我们通过显微注射aggf1 MO特异性抑制aggf1基因的表达,发现斑马鱼胚胎的脊索旁淋巴母细胞（parachordal lymphangioblasts,PLs）的分化受到了抑制,并且位于背主动脉（dorsal aorta,DA）和后主静脉（posterior cardinal vein,PCV）之间的胸导管（thoracic duct,TD）的发育也出现了异常。接着,我们利用TALEN基因编辑技术构建了aggf1基因纯合敲除斑马鱼,发现aggf1-/-斑马鱼的淋巴管表型与aggf1morphants相似——胚胎的脊索旁淋巴母细胞几乎完全消失,胸导管结构的完整性被破坏。随后,我们通过免疫组化实验检测小鼠皮肤组织中淋巴管特异性标记物LYVE-1的表达,发现与野生型小鼠相比,Aggf1+/-小鼠皮肤组织中LVYE-1的阳性表达显著降低,淋巴管密度明显减少。这些结果说明aggf1基因在淋巴管的发育和形成过程中发挥着十分重要的作用。为进一步探索aggf1基因影响淋巴管发育的分子机制,我们应用Affymetrix表达谱芯片分析并验证了aggf1基因下游的靶基因网络。结合通路分析软件Clue GO和IPA,我们发现aggf1的下游靶基因参与了一系列重要的生物过程与信号通路,比如淋巴管发育、细胞命运分化、p53信号通路、细胞凋亡等。其中,在aggf1下游的淋巴管发育相关基因簇中,我们特别关注了nr2f2基因。在内皮细胞中,nr2f2与prox1直接结合,决定淋巴内皮细胞（lymphatic endothelial cells,LECs）的命运分化,是淋巴管发育过程中的一个重要因子。为研究nr2f2是否参与aggf1对淋巴管发育的调控,我们首先使用nr2f2 MO特异性抑制斑马鱼胚胎中nr2f2基因的表达,随后观察淋巴管的发育情况。结果显示在nr2f2 morphants中淋巴管的发育出现了障碍。接着,我们采取回补实验的策略,在aggf1 morphants与aggf1-/-斑马鱼中过表达nr2f2基因全长Capped m RNA。结果发现,由敲低或敲除aggf1基因导致的淋巴管发育缺陷被nr2f2基因回补,这说明nr2f2的确参与了aggf1对淋巴管发育的调控。淋巴内皮细胞来源于静脉血管,而PI3K/AKT是aggf1调控静脉发育过程中的一个重要信号通路。为了研究akt是否也参与aggf1对淋巴管发育的调控,我们首先使用2种PI3K/AKT信号通路的抑制剂LY294002和MK-2206处理斑马鱼胚胎,结果发现抑制akt的表达后,斑马鱼淋巴管的发育出现了异常。随后,我们采用人源AKT m RNA在aggf1 morphant与aggf1-/-斑马鱼体内进行回补实验,结果显示其能成功修复因aggf1表达量不足导致的淋巴管发育障碍,这表明akt也参与aggf1对淋巴管发育的调控。接着,我们在斑马鱼胚胎中抑制akt的表达,结果发现nr2f2基因的表达量发生了下调,这提示akt可能作用于nr2f2基因的上游。本研究首次报道了aggf1基因表达量下调会抑制斑马鱼和小鼠淋巴管的发育,并证实斑马鱼aggf1通过介导PI3K/AKT信号,调控nr2f2的表达,从而影响静脉来源的淋巴内皮细胞的分化、出芽与迁移,最终影响淋巴管系统的发育。此外,我们发现虽然同为淋巴管发育的调控因子,aggf1并不影响vegfc的表达。本研究构建了斑马鱼aggf1基因敲除模型,鉴定了aggf1下游的靶基因与信号通路网络,并初步阐明aggf1基因在斑马鱼淋巴管发育过程中的作用与调控机制,证实aggf1是一个新的调控淋巴管发育的关键基因,从一定程度上解释了KTS患者表现出淋巴管畸形的原因。本研究为探讨和治疗淋巴管发育畸形、淋巴水肿、肿瘤细胞生长转移和抗肿瘤淋巴管生成疗法等提供了新的思路和靶点。

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文章来源

类型: 博士论文

作者: 李嘉

导师: 王擎

关键词: 淋巴管发育,斑马鱼,表达谱芯片

来源: 华中科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 华中科技大学

分类号: Q344

DOI: 10.27157/d.cnki.ghzku.2019.004824

总页数: 128

文件大小: 24764k

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