SRSF3调控CTLA-4外显子3的可变剪接的研究

论文摘要

背景:细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4）是一个重要的免疫负调节因子,在对免疫反应的调节和肿瘤的免疫治疗中都具有重要的作用。CTLA-4外显子3的可变剪接可以产生两种剪接异构体:全长型CTLA-4（full length CTLA-4,flCTLA-4）、可溶性CTLA-4（soluble CTLA-4,sCTLA-4）,他们均可以和抗原提呈细胞（antigen presenting cell,APC）表面配体CD80和CD86结合来调节免疫反应[1]。由于sCTLA-4发现较晚,关于CTLA-4的研究主要针对flCTLA-4,sCTLA-4作用机制及功能还未完全研究清楚,但是许多证据表明sCTLA-4参与了CTLA-4的免疫调节过程,在免疫反应过程中有着重要的作用[2]。目前许多研究正在探索CTLA-4外显子3可变剪接产生的两种剪接异构体的功能差异和作用机制,然而CTLA-4外显子3可变剪接的调节机制尚不明确。丝氨酸/精氨酸富集剪接因子3（Serine/arginine-rich splicing factor 3,SRSF3）是一个具有多种功能的可变剪接调控因子,同时SRSF3也被证实为一种原癌基因,在许多肿瘤中发现有过表达[3]。目的:本研究旨在探索CTLA-4外显子3的可变剪接调节机制。方法:1.应用PCR技术扩增c57小鼠CTLA-4外显子1至外显子4的基因组序列,将其连接到真核表达载体pEGFP-N1上,构建出可表达CTLA-4外显子1到外显子4的野生型minigene。以CTLA-4野生型minigene为模板,软件分析CTLA-4外显子3序列,将外显子3上三至四个碱基为一个单位进行突变,构建10个CTLA-4外显子3的突变minigene。将CTLA-4野生型minigene和突变minigene分别转染293细胞,通过逆转录-聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）观察CTLA-4外显子3可变剪接产生的两种亚型表达变化,筛选CTLA-4外显子3可变剪接关键的调控位点。2.使用软件预测五种可能调控CTLA-4外显子3可变剪接的剪接因子,应用转染技术将它们分别和CTLA-4野生型minigene表达质粒共转染293细胞,通过RT-PCR观察CTLA-4两种可变剪接亚型表达变化并筛选CTLA-4外显子3可变剪接可能的调节因子。3.应用RNA干扰技术来敲低SRSF3蛋白的表达,应用转染技术使SRSF3蛋白过表达,通过RT-PCR来观察CTLA-4外显子3可变剪接产生的两种剪接亚型表达的变化,通过免疫印迹实验验证SRSF3的敲低和过表达情况。结果:CTLA-4外显子3的可变剪接与SRSF3密切相关。当过表达SRSF3时发现,flCTLA-4的表达减少,而sCTLA-4表达增加;抑制SRSF3的表达时,flCTLA-4的表达增加,sCTLA-4的表达减少。初步说明SRSF3对CTLA-4外显子3的可变剪接有调控作用,并促进sCTLA-4的表达。同时筛选出CTLA-4外显子3上关键的三个调控位点:mt3突变位点、mt5突变位点、mt9突变位点（图2.2）。其中SRSF3调控CTLA-4外显子3可变剪接的结合位点可能位于mt5的突变位点上,有待进一步实验验证。结论:初步证明SRSF3参与调控CTLA-4外显子3的可变剪接,它能抑制flCTLA-4的表达、促进sCTLA-4的表达。SRSF3调控CTLA-4外显子3可变剪接的结合位点可能位于mt5突变位点上,有待进一步的实验验证。CTLA-4抗体作为免疫检查点抑制剂可以有效控制肿瘤发展,而SRSF3作为一个重要的原癌基因,它对CTLA-4外显子3可变剪接的调控为肿瘤免疫治疗提供了新的方向。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 黄珺

导师: 樊明文

关键词: 可变剪接

来源: 武汉大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 武汉大学

分类号: Q75

总页数: 59

文件大小: 1598K

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标签：可变剪接论文;