抗牛PD-1抗体制备及PD-1多抗阻断对BVDV感染PBL细胞增殖和凋亡的影响

论文摘要

牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV）可感染世界范围内的反刍动物,每年可造成约20亿美元的经济损失。BVDV主要在淋巴细胞群中复制,导致动物体内白细胞的数量严重减少,引起免疫抑制,并且淋巴细胞衰竭程度与BVDV毒株的毒力有关,具有可逆性。已知程序性细胞死亡蛋白-1（Programmed cell death protein-1,PD-1）参与机体外周免疫耐受和抗原特异性免疫抑制,导致T细胞耗尽。PD-1在慢性病毒感染的T细胞上高度表达,并且阻断PD-1与PD-L1的结合,能够恢复T细胞功能。然而在BVDV急性感染期间,阻断PD-1/PD-L1途径是否可以恢复淋巴细胞的水平尚不明确。本研究通过克隆表达牛PD-1胞外区蛋白,制备多抗和单克隆抗体,确定抗体阻断对BVDV感染PBL细胞增殖和凋亡的影响。首先,本研究通过PCR技术克隆牛PD-1胞外区基因,插入pET-28a原核表达载体,构建重组质粒pET-28a-PD-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,SDS-PAGE和Western-blot检测IPTG诱导的蛋白表达情况。结果表明,序列比对发现与NCBI上发布的牛PD-1序列同源性为100%,成功构建了牛pET-28a-PD-1重组质粒。在37℃、0.8 mmol·L-1IPTG条件下诱导获得大量约19 kDa牛PD-1蛋白,能够与抗His标签的单克隆抗体反应,具有良好的反应原性。其次,纯化牛PD-1重组蛋白与等量弗氏佐剂乳化制备免疫原,免疫BALB/C小鼠制备抗牛PD-1多抗。分离牛PBL细胞,体外感染CP和NCP型BVDV,加入多抗阻断PD-1/PD-L1通路,检测BVDV病毒拷贝数、淋巴细胞增殖和凋亡情况。结果表明,牛PD-1多抗能够识别牛PD-1胞外区蛋白,PD-1多抗阻断恢复了淋巴细胞增殖,抑制细胞凋亡,降低了BVDV病毒拷贝数。多抗阻断对CP型BVDV感染诱导的细胞增殖比NCP型具有更显著的恢复作用。最后,应用杂交瘤细胞融合技术制备牛PD-1单克隆抗体,通过有限稀释法筛选单克隆细胞株,使用SDS-PAGE、ELISA、蛋白印迹和间接免疫荧光检测抗牛PD-1单克隆抗体的效价和特异性。结果表明,单克隆抗体效价达到1:26,并且获得的单克隆抗体能够识别外源性牛PD-1蛋白。综上所述,成功获得了牛PD-1胞外区重组蛋白,研制了针对牛PD-1胞外区的多克隆抗体和单克隆抗体,证实了抗牛PD-1多抗阻断能够恢复BVDV体外感染淋巴细胞的增殖能力,减少了细胞凋亡,提高了淋巴细胞清除BVDV病毒的能力,为探索PD-1抗体在急性BVDV感染中的作用机制奠定了基础。

论文目录

摘要

英文摘要

英文缩略语表

1 文献综述

1.1 研究背景

1.2 牛病毒性腹泻-粘膜病的研究进展

1.2.1 分布与危害

1.2.2 BVDV种属和分型

1.2.3 流行病学

1.2.4 临床症状

1.2.4.1 BVDV急性感染

1.2.4.2 BVDV持续性感染

1.2.5 BVDV与机体免疫应答

1.3 程序性细胞死亡蛋白-1的概述

1.3.1 PD-1/PD-L1 蛋白生物学特性

1.3.2 PD-1/PD-L1 通路研究进展

1.3.2.1 PD-1 在病毒感染中的作用

1.3.2.2 PD-1 在肿瘤免疫中的作用

1.3.3 抗PD-1/PD-L1 抗体的应用价值

1.3.3.1 抗PD-1/PD-L1 抗体产品的临床应用

1.3.3.2 抗PD-1/PD-L1 抗体的抗病毒感染治疗

1.3.4 兽用抗PD-1/PD-L1 抗体的研究与应用

1.4 展望

1.5 研究目的和意义

2 牛外周血淋巴细胞PD-1 胞外区蛋白的原核表达及鉴定

2.1 材料

2.1.1 载体和细胞

2.1.2 试剂

2.1.3 仪器与设备

2.2 方法

2.2.1 目的基因片段的扩增与纯化

2.2.2 牛PD-1 胞外区基因片段与PMD18-T克隆载体连接

2.2.3 构建牛PET-28A（+）-PD-1 原核表达载体

2.2.4 牛PD-1 胞外区蛋白的表达及可溶性分析

2.2.5 牛PD-1 胞外区蛋白WESTERN-BLOT鉴定

2.2.6 牛PD-1 胞外区蛋白纯化

2.2.7 牛PD-1 胞外区蛋白的复性和浓缩

2.3 结果

2.3.1 牛PD-1 胞外区基因的PCR鉴定及序列分析

2.3.2 PMD18-T-PD-1 重组克隆质粒的构建

2.3.3 牛PD-1 胞外区的生物信息学分析

2.3.3.1 牛PD-1 胞外区的理化性质

2.3.3.2 氨基酸的组成和疏水性分析

2.3.3.3 氨基酸的磷酸化位点分析

2.3.3.4 牛PD-1 胞外区蛋白的高级结构预测

2.3.4 PET-28A（+）-PD-1 重组表达质粒的构建

2.3.5 PD-1-PET-28A（+）重组蛋白的表达及可溶性分析

2.3.6 PD-1-PET-28A（+）重组蛋白的纯化与WESTERN BLOT鉴定

2.4 讨论

2.5 小结

3 抗PD-1 多抗阻断对BVDV感染的外周血淋巴细胞增殖和凋亡的影响

3.1 材料

3.1.1 毒株和细胞

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器

3.2 方法

3.2.1 牛PD-1 胞外区重组蛋白多抗的制备和鉴定

3.2.2 Q-PCR检测病毒拷贝数

3.2.2.1 BVDV Q-PCR标准品的制备

3.2.2.2 BVDV标准曲线的建立

3.2.2.3 BVDV拷贝数检测

3.2.3 CCK-8 细胞增殖检测

3.2.4 细胞凋亡检测

3.2.5 数据分析

3.3 结果

3.3.1 PD-1-PET-28A（+）重组蛋白多抗效价检测

3.3.2 PD-1-PET-28A（+）重组蛋白多抗抗原性检测

3.3.3 BVDV标准曲线的建立及BVDV病毒量检测

3.3.4 CCK-8 细胞增殖检测淋巴细胞活性

3.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡

3.4 讨论

3.5 小结

4 抗牛PD-1 胞外区蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

4.1 材料

4.1.1 细胞和动物

4.1.2 主要试剂

4.1.3 主要仪器

4.2 方法

4.2.1 免疫原的制备和免疫动物

4.2.2 小鼠血清抗体效价检测

4.2.3 骨髓瘤细胞SP2/0 的扩增培养

4.2.4 饲细胞的制备

4.2.5 细胞融合

4.2.6 单抗的杂交瘤细胞株的建立

4.2.7 杂交瘤上清单抗效价的测定

4.2.8 单克隆抗体鉴定

4.2.8.1 杂交瘤上清WESTERN-BLOT检测

4.2.8.2 牛PD-1 全长基因的克隆

4.2.8.3 牛PD-1-PCDNA-3.1（+）重组质粒构建

4.2.8.4 牛PD-1-PCDNA-3.1（+）重组质粒转染CHO细胞

4.2.8.5 细胞间接免疫荧光检测

4.3 结果

4.3.1 小鼠血清抗体效价检测

4.3.2 杂交瘤细胞株的建立

4.3.3 杂交瘤细胞上清单抗SDS-PAGE检测

4.3.4 杂交瘤上清单抗WESTERN-BLOT检测

4.3.5 牛PD-1 全长基因的克隆

4.3.6 牛PD-1-PCDNA-3.1（+）重组质粒鉴定

4.3.7 细胞间接免疫荧光检测

4.4 讨论

4.5 小结

5 结论

参考文献

致谢

附录

个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘珊珊

导师: 朱战波

关键词: 牛病毒性腹泻病毒,程序性细胞死亡蛋白,原核表达,多克隆抗体,单克隆抗体

来源: 黑龙江八一农垦大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 黑龙江八一农垦大学

分类号: S852.4

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