首页> 正文

卤醇脱卤酶红外及荧光探针标记及其结构动力学研究初探

2020-12-08阅读(881)

卤醇脱卤酶红外及荧光探针标记及其结构动力学研究初探

论文摘要

卤醇脱卤酶不仅能够降解环境中存在的有机卤化物,还能合成具有手性的环氧化物和β-取代醇,其催化机理和广泛的应用前景近年来备受关注。卤醇脱卤酶的动态结构变化与其生物功能紧密相连,是卤醇脱卤酶发挥功能的重要结构基础,对其结构动力学的研究有助于揭示卤醇脱卤酶的催化反应机理,以及提升酶的改造效率。众所周知,光谱技术在研究酶蛋白结构的动态性方面具有广泛应用,相关研究需要在酶蛋白中嵌入合适的光谱探针,因此探针对酶蛋白的标记就显得尤为重要。本研究结合了生物学技术和光谱技术,将红外、荧光探针位点特异性的嵌入卤醇脱卤酶中,探针标记卤醇脱卤酶的位点不受局限,对所处的微环境非常敏感,且能精准地反映出酶蛋白动态结构的微小变化,在蛋白质结构动力学研究中具有显著优势。本研究应用密码子扩展法将非天然氨基酸Naek引入HheC的K140,K161,P184三个位点,通过优化表达体系和亲和层析得到了叠氮基团修饰的酶蛋白,并进行了酶催化特性及红外光谱检测。实验结果表明:（1）184+突变体的酶活最佳,并且具有与野生型相当的热稳定性、最适反应温度;（2）由于探针所处微环境的极性不同,K140,K161,P184三个突变体的红外特征峰分别位于2131 cm-1,2137 cm-1,2183 cm-1波数处,并且叠氮的峰位会随着溶液极性的强弱而变化;（3）高浓度盐酸胍溶液使酶蛋白结构趋向统一,其红外特征峰变窄,分布更为集中。然而,红外光谱检测氯离子结合后酶的构象变化不够灵敏,因此在后续实验中尝试用荧光手段探究卤离子对卤醇脱卤酶构象的影响在上述研究基础上,通过SPAAC环加成点击反应,将含有炔烃的化学荧光染料DBCO-CY5位点特异性的连在卤醇脱卤酶上,进行了酶活力和荧光光谱检测;研究还通过定点突变构建了卤醇脱卤酶的单色氨酸突变体。实验结果表明:（1）卤醇脱卤酶的外源荧光嵌入效率可以达到49.03%,突变体在670 nm处有最大荧光发射峰,最大荧光强度为1469,并且点击反应过程不会损失酶活力;（2）在卤离子结合实验中,Cl-和Br-与卤醇脱卤酶的结合能够影响其外源相对荧光强度,而F-却不能影响酶蛋白的外源荧光强度,这也说明184位点参与了酶蛋白在行使催化功能时的构象变化。综上所述,本研究成功构建了卤醇脱卤酶的红外和荧光探针,为后续研究卤醇脱卤酶的结构动力学奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 中英文名称的对照及缩写
  • 第一章 绪论
  •   1.1 卤醇脱卤酶概述
  •   1.2 结构动力学概述
  •     1.2.1 结构动力学简介
  •     1.2.2 卤醇脱卤酶的结构动力学研究进展
  •     1.2.3 结构动力学研究方法
  •       1.2.3.1 计算机手段
  •       1.2.3.2 实验手段
  •   1.3 蛋白质的修饰及应用
  •     1.3.1 常见的蛋白质修饰方法
  •     1.3.2 非天然氨基酸
  •     1.3.3 密码子扩展法
  •     1.3.4 UAAs体外特异性修饰蛋白质
  •   1.4 点击化学反应在蛋白质正交标记中的应用
  •     1.4.1 叠氮基团-炔烃环加成反应（SPAAC）
  •     1.4.2 其他类型的点击化学反应
  •   1.5 论文的主要研究内容
  •     1.5.1 卤醇脱卤酶HheC位点特异性引入红外探针
  •     1.5.2 卤醇脱卤酶HheC位点特异性引入荧光探针
  •     1.5.3 应用傅里叶红外及荧光光谱法初步探究卤醇脱卤酶的结构动力学
  •   1.6 论文的研究意义及目的
  • 第二章 卤醇脱卤酶HheC位点特异性引入非天然氨基酸
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验材料
  •     2.2.1 材料和试剂
  •     2.2.2 仪器和设备
  •     2.2.3 试剂的配置
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 位点的选取及突变体的构建
  •       2.3.1.1 位点选取原则
  •       2.3.1.2 His-tag标签的添加以及引物设计
  •     2.3.2 双质粒转化及抗性筛选
  •       2.3.2.1 感受态制备
  •       2.3.2.2 pBad质粒和pEVOL质粒的转化
  •     2.3.3 Naek-HheC的表达优化
  •     2.3.4 卤醇脱卤酶的纯化
  •       2.3.4.1 离子交换法
  •       2.3.4.2 亲和层析法
  •     2.3.5 卤醇脱卤酶的浓度测定及SDS-PAGE检测
  •       2.3.5.1 Bradford法测蛋白质浓度
  •       2.3.5.2 Naek-HheC粗提液及纯酶的SDS-PAGE检测
  •     2.3.6 Naek-HheC的催化特性研究
  •       2.3.6.1 CL-离子法检测酶活力
  •       2.3.6.2 Naek-HheC的热稳定性比较
  •       2.3.6.3 Naek-HheC的最适温度检测
  •     2.3.7 非天然氨基酸Naek的回收利用
  •       2.3.7.1 回收利用Naek的原因
  •       2.3.7.2 回收利用Naek的方法
  •   2.4 实验结果
  •     2.4.1 Naek-HheC突变体的构建
  •     2.4.2 Naek-HheC的表达优化
  •     2.4.3 Naek-HheC的亲和层析
  •     2.4.4 Naek-HheC的催化特性研究
  •       2.4.4.1 Naek-HheC的酶活力检测
  •       2.4.4.2 Naek-HheC的热稳定性比较
  •       2.4.4.3 Naek-HheC的最适温度检测
  •     2.4.5 非天然氨基酸Naek的回收利用
  •   2.5 分析与讨论
  •   2.6 本章小结
  • 第三章 卤醇脱卤酶HheC的傅里叶变换红外光谱检测
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验材料
  •     3.2.1 材料和试剂
  •     3.2.2 仪器和设备
  •     3.2.3 试剂的配置
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 傅里叶变换红外光谱的检测
  •     3.3.2 红外光谱的差减、基线校正
  •     3.3.3 去卷积和光谱拟合
  •   3.4 实验结果
  •     3.4.1 傅里叶变换红外光谱法检测HheC中的叠氮探针
  •     3.4.2 不同极性溶液对HheC红外光谱的影响
  •     3.4.3 HheC的多种构象对其红外光谱的影响
  •     3.4.4 CL-对卤醇脱卤酶红外光谱的影响
  •   3.5 分析及讨论
  •   3.6 本章小结
  • 第四章 卤醇脱卤酶HheC荧光探针的构建
  •   4.1 引言
  •   4.2 实验材料
  •     4.2.1 材料和试剂
  •     4.2.2 仪器和设备
  •     4.2.3 试剂的配置
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 Naek-HheC与DOCO-Cy5的SpAAC反应
  •     4.3.2 DBCO-Cy5-HheC的紫外吸光光谱检测
  •     4.3.3 荧光嵌入效率的计算
  •     4.3.4 DBCO-Cy5-HheC的酶活力检测
  •     4.3.5 DBCO-Cy5-HheC的外源、内源荧光光谱检测
  •     4.3.6 内源荧光探针的构建及酶活检测
  •   4.4 实验结果
  •     4.4.1 DBCO-Cy5-HheC的紫外吸光光谱检测
  •     4.4.2 DBCO-Cy5-HheC的酶活力检测
  •     4.4.3 DBCO-Cy5-HheC的外源荧光光谱检测
  •     4.4.4 卤离子对DBCO-Cy5-HheC外源荧光光谱的影响
  •       4.4.4.1 CL-对卤醇脱卤酶外源荧光强度的影响
  •       4.4.4.2 CL-对卤醇脱卤酶内源荧光强度的影响
  •       4.4.4.3 Br-对卤醇脱卤酶外源荧光强度的影响
  •       4.4.4.4 Br-对卤醇脱卤酶内源荧光强度的影响
  • -1对卤醇脱卤酶外源荧光强度的影响'>      4.4.4.5 F-1对卤醇脱卤酶外源荧光强度的影响
  •     4.4.5 有机溶剂对荧光光谱的影响
  •     4.4.6 色氨酸突变体的酶活特性
  •   4.5 分析及讨论
  •   4.6 本章小结
  • 第五章 总结与展望
  •   5.1 总结
  •   5.2 展望
  •     5.2.1 时间停留荧光技术
  •     5.2.2 飞秒二维红外
  •     5.2.3 分子动力学模拟
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻硕期间的研究成果

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 堵瑄

    导师: 汤丽霞

    关键词: 非天然氨基酸,红外光谱,荧光光谱,结构动力学

    来源: 电子科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 电子科技大学

    分类号: Q814

    总页数: 72

    文件大小: 4068K

    下载量: 34

    相关论文文献

    • [1].复杂机械结构动力学参数优化设计[J]. 包装工程 2017(03)
    • [2].关于研究生结构动力学课程的几点思考[J]. 河南建材 2018(06)
    • [3].中外土木工程防灾专业结构动力学课程比较研究[J]. 高等建筑教育 2018(04)
    • [4].《计算结构动力学》新书出版[J]. 强度与环境 2009(04)
    • [5].加权残值法在非线性结构动力学的应用(英文)[J]. 苏州大学学报(自然科学版) 2011(02)
    • [6].高校《结构动力学》教学改革探索[J]. 课程教育研究 2019(35)
    • [7].《结构动力学》本科课程中数值计算内容调研:国际研究型高校土木工程专业比较[J]. 教育教学论坛 2019(26)
    • [8].《结构动力学及其在航天工程中的应用》新书出版[J]. 强度与环境 2015(04)
    • [9].结构动力学的前沿问题与教学研究[J]. 教育现代化 2019(38)
    • [10].细胞结构动力学——实时调控细胞力学的因素分析[J]. 生物化学与生物物理进展 2015(06)
    • [11].淀粉样蛋白片段结构动力学与酰胺-Ⅰ带振动光谱示踪[J]. 光谱学与光谱分析 2018(S1)
    • [12].可展开空间结构动力学与控制专题·编者按[J]. 中国科学:物理学 力学 天文学 2017(10)
    • [13].受限体相分子的超快微观结构动力学[J]. 光谱学与光谱分析 2018(S1)
    • [14].基于多层次权重系数的结构动力学模型修正[J]. 上海交通大学学报 2017(12)
    • [15].航天装备结构动力学问题总结[J]. 强度与环境 2016(02)
    • [16].溶液相靛蓝分子结构动力学研究[J]. 光谱学与光谱分析 2016(S1)
    • [17].主动结构动力学特征与频响特性研究[J]. 振动与冲击 2014(22)
    • [18].结构动力学在建筑结构中的减震隔振应*用[J]. 阴山学刊(自然科学) 2010(03)
    • [19].中国航空工业结构动力学专业组简介[J]. 装备环境工程 2018(09)
    • [20].结构动力学与运载火箭技术发展[J]. 力学与实践 2016(01)
    • [21].电子与光电产品设计中的结构动力学问题[J]. 力学与实践 2012(06)
    • [22].高速铁路插板式声屏障结构动力学性能分析[J]. 铁道标准设计 2009(06)
    • [23].结构动态分析方法的发展与研究现状[J]. 建材与装饰 2017(30)
    • [24].基于增广SVM的结构动力学模型修正方法研究[J]. 振动与冲击 2017(15)
    • [25].工程索结构动力学:非线性建模与分析[J]. 力学与实践 2016(02)
    • [26].建筑结构动力学教学与实践的新模式探索[J]. 蚌埠学院学报 2014(01)
    • [27].风力机结构动力学新模型与动态响应求解计算[J]. 机械设计与制造 2020(03)
    • [28].复杂锥壳结构动力学相似模型设计技术研究[J]. 机械设计 2015(11)
    • [29].基于ICM准则法的结构动力学边界拓扑优化设计[J]. 振动工程学报 2013(01)
    • [30].卷积型最小二乘法求解梁的动力学问题[J]. 力学与实践 2013(04)

    标签：;  ;  ;  ;  

    卤醇脱卤酶红外及荧光探针标记及其结构动力学研究初探
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕论降 版权所有 鄂ICP备12018319号-6