袁成良[1]2003年在《17β-雌二醇对成骨细胞生成影响的实验研究》文中研究说明【研究背景】骨质疏松症（Osteoporosis,OP）是以骨量减少，骨的微观结构退化为特征，致使骨强度降低、脆性增加,易发生骨折的一种全身性骨骼疾病。骨质疏松症严重威胁人类健康，越来越引起人们的高度重视。对骨质疏松症的研究已经成为当前医学界研究最活跃的领域之一。目前全世界大约有2亿人患骨质疏松症，其发病率已跃居各种常见病的第七位。骨质疏松症在我国同样是一个严峻的公共卫生问题。绝经后骨量丢失多，速度快，骨吸收和骨形成均增加，呈高转换骨代谢。研究表明雌激素缺乏，成骨/基质细胞产生多种细胞因子如IL-6等增加，它们刺激成骨细胞（OB）和破骨细胞（OC）生成增多，引起高转换骨代谢。但目前对绝经后高转换骨代谢发生的始动环节―成骨细胞生成增加的分子机理研究甚少。虽然每个骨再建循环都是以破骨细胞的活化为起点，但成骨细胞是骨再建的中心环节，它不但直接参与骨形成，而且还调节破骨细胞的分化成熟及活性，间接参与骨吸收。本研究从影响成骨细胞生成的因素入手，探讨雌激素对它们表达的影响，试图揭示雌激素对成骨细胞生成的作用，阐明绝经后高转换骨代谢产生的始动机理。骨髓基质细胞具有多向分化潜能,受不同转录因子的调节可分化为成骨细胞、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞。成骨细胞的分化成熟受多种局部因子的调节，其中以骨形态发生蛋白受体（BMPR）、核结合因子α1 （Cbfα1）和过氧化物酶增殖体活化受体γ2（PPAR-γ2）尤为重要。Cbfα1是成骨细胞分化特异性转录因子，它活化成骨细胞特异基因如骨桥蛋白、骨涎蛋白、Ⅰ型胶原和骨钙素的表达。PPAR-γ2是脂肪细胞分化的关键性转录因子，但它与Cbfα1之间存在“交互关系”（reciprocal relationship）,正是这种“交互关系”决定着骨髓基质细胞的分化方向―成骨细胞或脂肪细胞。BMP-2诱导骨髓基质细胞向成骨细胞或脂肪细胞分化，决定于BMP-2与BMPR-ⅠA或BMPR-ⅠB结合。因此BMPR-Ⅰ的不同亚型在成骨细胞和脂肪细胞的特化过程中发挥重要作用。【目的】骨髓基质细胞在1,25(OH)2D3和地塞米松（DEX）的诱导下能分化为成骨细胞。本课题研究骨髓基质细胞在向成骨细胞分化的条件培养体系中，不同浓度17β-雌二醇（E2）对其BMPR-Ⅰ、Cbfα1和 PPAR-γ2基因表达的影响，探讨雌二醇对成骨细胞生成的作用，试图阐明绝经后高转换骨代谢发生始动环节的可能机制，为绝经后高转换骨代谢的防治及有针对性药物开发提供实验依据。【方法】取自3月龄雌性SD大鼠的骨髓基质细胞在生长培养基中培养传代后，用<WP=10>含1,25(OH)2D3(10-9mol/L)、地塞米松(10-7mol/L) 的分化培养基培养，同时用不同浓度E2(0,10-10 mol/L,10-8mol/L,10-6mol/L)处理，3天后进行下面的实验，每项实验重复4次。异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取细胞总RNA，用半定量逆转录PCR（RT-PCR）检测BMPR-ⅠA，ⅠB,Cbfα1和PPAR-γ2 mRNA的表达，并用Northern blot 给予证实，以防PCR中存在假阳性；用Western blot检测BMPR-ⅠA和PPAR-γ2蛋白的表达情况。ALP和Ⅰ型胶原是成骨细胞的重要标志物，本实验选择二者作为成骨细胞分化成熟的标志。ALP用化学酶法测定，Ⅰ型胶原用Van Gieson染色法显示。【结果】1. 雌二醇能明显抑制骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中ALP活性，随着E2浓度的增加，ALP活性降低，呈剂量依赖性，在上述E2浓度时，ALP活性分别为(715±37)nkat/g,(312±32)nkat/g,(187±25)nkat/g,(65±4)nkat/g(P<0.01)。ALP活性与E2浓度呈显着负相关（r=-0.945,P<0.01）2. E2能抑制骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中细胞Ⅰ型胶原的合成，随着E2浓度的增加，Ⅰ型胶原染色由鲜红、淡红、橙红到黄色，红色越深表明Ⅰ型胶原合成越多，成骨细胞分化越成熟。3. E2能明显抑制骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中BMPR-ⅠA mRNA及蛋白的表达，随着E2浓度的增加，BMPR-ⅠA mRNA的表达量从(27.0±3.4)% 降至(22.3±2.6)%,(17.0±1.8)%和（9.3±1.6）%(P<0.01)；Northern blot结果显示其表达量从0.42±0.031降至0.27±0.021,0.21±0.016和0.12±0.010(P<0.01)；BMPR-ⅠA蛋白的表达量从0.45±0.025降至0.25±0.017,0.19±0.014和0.11±0.011(P<0.01)。且有明显的剂量依赖性（r=-0.936,P<0.01）。4. E2能明显刺激骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中BMPR-ⅠB mRNA的表达，随着E2浓度的增加，其表达量从(2.0±0.4)%增至(4.8±1.2)%,(8.0±1.4)% 和(17.3±2.2)% (P<0.01)；Northern blot结果显示其表达量从0.17±0.018增至0.21±0.024,0.25±0.029和0.37±0.032(P<0.01)。5. E2能明显抑制骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中Cbfα1 mRNA的表达，随着E2浓度的增加，其表达量从(25.0±3.3)% 降至(19.8±2.2)%,(14.5±1.3)%和（6.5±1.0）%(P<0.01)；Northern blot结果显示其表达量从0.44±0.038降至0.25±0.022,0.19±0.016和0.11±0.010(P<0.01)。6. E2能明显刺激骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中PPAR-γ2 mRNA及蛋白的表达，随着E2浓度的增加，PPAR-γ2 mRNA的表达量从(1.8±0.3)%增至(5.5±1.3)%,(9.5±3.1)% 和(19.2±3.0)% (P<0.01)；Northern blot结果显示其表达量从0.1
王凌[2]2006年在《脱氢表雄酮及补肾宁心方对成骨细胞—免疫网络的调控作用》文中研究指明绝经后骨质疏松(Postmenopausal osteoporosis，PMO)是以绝经后骨量减少、骨微结构受损，导致骨脆性增加为特征的骨代谢性疾病。成骨细胞(osteoblast，OB)骨形成与破骨细胞(osteoclast，OC)骨吸收间的动态平衡构成了骨重建过程。自然绝经或去势手术后女性由于性激素缺乏导致骨丢失增加，骨质疏松症(osteoporosis)发生率高于同龄男性。PMO最主要与性激素紊乱及免疫失调密切关联。迄今为止，治疗PMO的方法主要是预防骨吸收。绝经后女性普遍应用的雌激素替代疗法也主要作用于骨吸收，但近来对长期运用雌激素治疗的安全性提出了质疑。作为骨形成细胞，OB在PMO的病理生理学及其导致的严重并发症—骨折中起关键作用。因而改善OB合成代谢的药物将是更有前景的围绝经期防治策略。脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone，DHEA)是体内最丰富的肾上腺甾体激素前体，其生物学功能并不能完全归结于其代谢产物。近年研究发现，绝经后女性的DHEA水平低于正常人群，并主张应用DHEA治疗PMO。但DHEA对骨代谢效应的生化和分子机制尚未阐明。近来研究提示中医药作为骨形成诱导药物具有良好前景。我们的补肾宁心方(Bushen Ningxin Decoction，BSNXD)，具有补。肾宁心作用，能有效地防治PMO。本研究拟通过如下体内外实验，以解析DHEA和BSNXD对OB增殖、凋亡及免疫功能的调控作用，以阐明DHEA和BSNXD防治PMO的分子机制。第一部分脱氢表雄酮对成骨细胞-免疫网络的调控作用目的探讨DHEA对骨组织形态、OB增殖和凋亡以及CD4~+T细胞Th1/Th2型细胞因子及协同刺激分子表达的调控作用；以及干预雌激素和雄激素受体信号及MAPK信号途径对DHEA效应的影响。方法建立BALB/c小鼠PMO模型，分为OVX组、OVX+DHEA组、OVX+E2组，另设Sham组为假手术对照。取腰椎和股骨行骨组织形态计量分析；并取椎骨植块法培养OB，流式细胞术(FCM)分析增殖细胞核抗原(PCNA)表达；FCM检测各组鼠脾脏CD4~+T细胞内IL-2、IFN-γ(Th1型)和IL-4、IL-10(Th2型)的表达。颅骨酶解法原代培养鼠OB，在有或无DHEA存在的情况下，透射电镜观察DHEA对OB超微结构的影响；原代OB以雌激素受体(ER)拮抗剂ICI 182，780、雄激素受体(AR)拮抗剂Flutamide或U0126预处理后给予系列浓度DHEA或E2孵育，FCM分析OB DNA含量，Annexin V-FITC/PI双标记FCM分析细胞早期凋亡，Western blotting分析OB ERK1/2磷酸化状态；原代OB分别给予系列浓度DHEA或E2处理，实时定量RT-PCR和Western blotting分析OB芳香化酶、ERα、ERβ和AR mRNA转录及蛋白表达水平；颅骨酶解法培养鼠OB；MACS法分离CD4~+T；将OB或CD4~+T分别以溶媒、ICI 182，780、Flutamide或CsA预处理后，予以DHEA或E2培养并以LPS刺激；以FCM分析OB表面CD80、CD86以及CD4~+T细胞表面CD28、CTLA-4表达。结果OVX组与Sham组相比，椎骨和股骨骨小梁面积显着下降(P＜0.01)，说明PMO模型成功建立；与OVX组相比，OVX+DHEA组及OVX+E2组腰椎、股骨骨小梁面积都明显增加(P＜0.01)。透射电镜可见经DHEA诱导后的OB细胞器明显增多，内质网扩张，线粒体丰富等形态学改变。OVX组OB的PCNA表达与Sham组相比显着增高(P＜0.05)；与OVX组相比，OVX+DHEA组OB核内PCNA的平均荧光强度和阳性细胞百分率皆显着增高(分别为P＜0.05和P＜0.01)；DNA含量分析显示，DHEA组的S期和G2/M期细胞百分率比对照组明显增加，G0/G1期细胞百分率明显下降，细胞增殖指数(PI)显着增加(P＜0.01)，而E2对OB细胞周期无显着影响；DHEA和E2可显着抑制血清饥饿诱导的OBs早期凋亡(分别为P＜0.01和P＜0.05)，并诱导OB中ERKs的磷酸化(P＜0.01)；U0126而非ICI 182，780或Flutamide能有效地阻滞DHEA的上述效应，而E2对OB凋亡及ERKs磷酸化的效应可被ICI 182，780或U0126而非Flutamide所阻滞。OB中稳定表达芳香化酶、ERα、ERβ和AR mRNA及蛋白。与对照组比较，DHEA和E2显着增加芳香化酶mRNA、ERα和ERβmRNA及蛋白表达水平(分别为P＜0.01和P＜0.05)；DHEA显着提高了ERβ/ERα比值；而E2则显着降低了ERβ/ERα比值(P＜0.05)；且DHEA而非E2可显着增加OB中芳香化酶、AR mRNA和蛋白表达水平(P＜0.01)。经LPS刺激后，DHEA及E2组OB表达CD80、CD86(平均荧光强度和阳性细胞百分率)显着增加(分别为P＜0.05和P＜0.01)；CsA可显着降低对照组及DHEA处理组受LPS刺激后OB表面CD80、CD86的表达(P＜0.01)，而ICI 182，780或Flutamide则无此效应；但E2对OB表面CD80、CD86表达的影响可被CsA或ICI 182，780而非Flutamide抑制。OVX组脾脏CD4~+T细胞内Th1型细胞因子(IL-2、IFN-γ)表达显着低于Sham组(P＜0.05)；而OVX+DHEA组和OVX+E2组显着高于OVX组(分别为P＜0.01和P＜0.05)。同时，OVX+DHEA组Th2型细胞因子(IL-4、IL-10)表达显着低于OVX组(P＜0.01)。OVX组IFN-γ/IL-4比值明显低于Sham组(P＜0.05)；OVX+DHEA组和OVX+E2组IFN-γ/IL-4比值均显着高于OVX组(P＜0.01)；且OVX+DHEA组OB PCNA表达与CD4+T细胞IFN-γ水平呈明显正相关(相关系数r=0.931，P＜0.05)；与IL-4水平呈负相关(r=-0.815，P＜0.05)。无论有无LPS刺激，E2组CD4~+T细胞表面CD28和CTLA-4(平均荧光强度和阳性细胞百分率)表达无显着改变(P＞0.05)；DHEA组在LPS刺激后CD4~+CD28~+T细胞百分比增加(P＜0.05)，而CD28，CTLA-4的平均荧光强度及CTLA-4的阳性细胞百分率无显着改变(P＞0.05)。结论DHEA可显着改善骨形态，并有效促进OB合成代谢有关的细胞器增加。DHEA经ER或AR非依赖途径促进OB增殖并抑制其凋亡，提示它可能直接经DHEA特异性受体发挥效应，而并非经转化为雄激素或雌激素后发挥作用；磷酸化ERK1/2参与介导这一作用。DHEA显着增加OB芳香化酶表达，有助于增加骨组织局部雌激素浓度；DHEA可显着增加鼠OB ERα、ERβ和AR水平，使OB对雌激素等配体的反应性增加。DHEA在体外经ER或AR非依赖途径，上调受LPS刺激的鼠OB协同刺激分子CD80、CD86表达，该作用可被CsA阻滞；DHEA可显着升高CD4~+T细胞Th1型细胞因子并降低Th2型细胞因子表达，形成Th1型免疫偏移，从而显着改善PMO的免疫状态；DHEA还可上调CD4~+T细胞CD28的表达，提示可改善骨—免疫调节网络。第二部分补肾宁心方对成骨细胞-免疫网络的调控作用目的探讨BSNXD对骨组织形态、OB增殖和凋亡以及CD4~+T细胞Th1/Th2型细胞因子及协同刺激分子表达的调控作用；并探讨干预雌激素和雄激素受体信号以及MAPK信号途径对中药血清效应的影响。方法建立BALB/c小鼠PMO模型，分为OVX组、OVX+BSNXD组、OVX+DHEA组、OVX+E2组。另设Sham组为假手术对照。取腰椎和股骨行骨组织形态计量分析；并取椎骨植块法培养OB，FCM分析PCNA表达；FCM检测各组鼠脾脏CD4~+T细胞内IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的表达。颅骨酶解法培养OB，在对照鼠血清或中药血清存在的情况下，透射电镜观察BSNXD药物血清对OB超微结构的影响。原代OB以ICI 182，780、Flutamide或U0126预处理后给予系列浓度对照鼠血清或中药血清孵育，FCM分析DNA含量，Annexin V-FITC/PI双标记FCM分析细胞早期凋亡；原代OB分别予以5-30％系列浓度的对照鼠血清或中药血清培养，实时定量RT-PCR分析OB芳香化酶、ERα、ERβ和AR mRNA转录水平；颅骨酶解法培养鼠OB，MACS法分离CD4~+T；将OB或CD4~+T分别以溶媒、ICI 182，780、Flutamide或CsA预处理后，予以系列浓度对照鼠血清、中药血清或E2培养并以LPS刺激；以FCM分析OB表面CD80、CD86以及CD4~+T细胞表面CD28、CTLA-4表达。结果与OVX组相比，OVX+BSNXD组腰椎、股骨骨小梁面积明显增加(P＜0.05)。透射电镜可见经20％药物血清诱导后的OB呈现典型的细胞器明显增多，内质网扩张，线粒体丰富等形态学改变。与OVX组相比，OVX+BSNXD组OB核内PCNA的平均荧光强度和阳性细胞百分率皆显着增高(P＜0.05)；DNA含量分析显示与相应对照组相比，10-20％药物血清组的S期和G2/M期细胞百分比明显增加，G0/G1期细胞百分比明显下降，PI显着增加(分别为P＜0.05和P＜0.01)；10-20％的药物血清还可显着抑制血清饥饿诱导的OBs早期凋亡(分别为P＜0.05和P＜0.01)；U0126，ICI 182，780或Flutamide都只能部分地阻滞BSNXD药物血清的上述效应。与相应对照组比较，10-20％BSNXD药物血清显着增加OB中芳香化酶、ERα、ERβ和AR mRNA表达水平(分别为P＜0.01和P＜0.05)，且20％BSNXD药物血清显着提高了ERβ/ERα比值(P＜0.01)。经LPS刺激后，BSNXD药物血清OB表达CD80、CD86(平均荧光强度和阳性细胞百分率)显着增加(P＜0.01)；CsA可显着降低对照组及中药血清组受LPS刺激后OB表面CD80、CD86表达(P＜0.01)，而ICI 182，780或Flutamide则无此效应。OVX+BSNXD组脾脏CD4~+T细胞内Th1型细胞因子(IL-2、IFN-γ)表达显着高于OVX组(P＜0.05)。同时，OVX+BSNXD组Th2型细胞因子(IL-4、IL-10)表达显着低于OVX组(P＜0.05)。OVX+BSNXD组IFN-γ/IL-4比值均显着高于OVX组(P＜0.01)。且OVX+BSNXD组OBPCNA表达与CD4+T细胞IFN-γ水平呈明显正相关(相关系数r=0.943，P＜0.05)，与IL-4水平呈负相关(r=-0.934，P＜0.05)。无论有无LPS刺激，BSNXD药物血清组CD4~+T细胞表面CD28和CTLA-4表达无显着改变。结论BSNXD可有效促进OB增殖，显着改善骨形态。BSNXD药物血清在体外可经ER和AR等依赖途径促进OB增殖并抑制其凋亡，提示BSNXD在小鼠体内代谢新生的内生性成分含有ER和AR信号通路中的活性物质；多种信号转导途径包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径，磷酸化ERK1/2参与介导这一作用。BSNXD药物血清显着增加OB芳香化酶转录，有助于增加骨组织局部雌激素浓度；BSNXD药物血清还可显着增加鼠OB ERα、ERβ和AR转录，使OB对雌激素等配体的反应性增加。BSNXD药物血清在体外经ER或AR非依赖途径上调受LPS刺激后OB CD80、CD86表达，该作用可被CsA阻滞；BSNXD可显着升高Th1型细胞因子并降低Th2型细胞因子表达，形成Th1型免疫偏移，从而显着改善PMO的免疫状态，从而显着改善骨免疫内环境。因此，BSNXD与DHEA联合应用可能是一种更理想的PMO防治方案。
费蓓蓓[3]2017年在《雌激素对“铁蓄积导致骨代谢异常”的影响及作用机制的研究》文中指出绝经后女性是原发性骨质疏松症(Ι型)的高危人群,近年的研究发现,原发性骨质疏松症(Ι型)发生除了与雌激素缺乏有关,还可能与铁蓄积有关。女性随年龄增长雌激素下降,铁蓄积增加,同时骨质疏松症发生率也增高,那么,铁蓄积是雌激素下降导致还是机体独立因素导致?雌激素、铁元素及骨代谢叁者关系如何?明确雌激素、铁元素对骨代谢的影响及相互关系对解释“铁蓄积是否独立影响骨质疏松”有深刻意义。在此研究背景下,本课题结合临床资料、动物实验及细胞实验分层研究雌激素存在及缺乏情况下,铁蓄积对骨代谢的影响及相关的作用机制,旨在阐明雌激素、铁元素及骨代谢叁者关系。本课题具体研究内容如下:第一部分子宫切除的年轻女性铁代谢指标及骨代谢指标的临床观察。子宫切除的年轻女性与绝经后女性的共同点是停止月经排出,不同点是年轻女性的雌激素水平正常,绝经后女性是雌激素缺乏的,这部分的研究目的:子宫切除的年轻女性血清铁代谢及骨代谢变化,以及卵巢功能正常情况下,铁代谢指标与骨代谢指标之间的相互关系。第二部分雌激素对“铁蓄积”小鼠骨代谢的影响及相关机制。为了进一步论证临床资料的结果进行详细的动物实验的研究。本部分的研究目的:观察雌激素的有无对铁蓄积小鼠骨量、骨转换指标及氧化应激的影响,初步探讨可能的机制,进一步明确雌激素、铁及骨代谢叁者的关系。第叁部分雌激素与铁的联合作用对成骨细胞、破骨细胞分化及增值活性的影响及相关机制研究。为了进一步论证动物实验的结果及可能的机制,进一步进行细胞实验的研究,研究成骨细胞、破骨细胞在铁与雌激素的共同干预下,各自生物活性指标变化,并探讨活性氧ROS在其中的作用。第一部分子宫切除的年轻女性铁代谢指标及骨代谢指标的临床观察目的:研究子宫切除的年轻女性血清铁代谢及骨代谢变化,以及卵巢功能正常情况下,铁代谢指标与骨代谢指标之间的相互关系。方法:以2002年06月至2010年10月因子宫肌瘤行子宫切除术而保留双侧附件的女性41例为研究组对象,年龄38~44岁,平均年龄(41.78±2.13)岁;子宫切除时间3~11年,平均(5.31±1.79)年。另随机抽取无子宫和卵巢手术史,有规律月经的生育期女性35例为对照组。检测性激素相关指标[包括雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)]、铁代谢相关指标[包括铁蛋白(FER)、总铁结合力]和骨代谢相关指标[包括Ⅰ型原胶原氨基端延长肽(P1NP)、Ⅰ型胶原C端肽β降解产物(β-CTX)、股骨颈及腰椎骨密度]。采用t检验、多元逐步回归分析,探讨铁代谢指标与骨代谢指标在子宫切除年轻女性中的现象和关系。结果:两组女性年龄、身高、体重、血红蛋白、白细胞计数、肝功能、肾功能、血脂、血糖比较,无统计学意义(P>0.05)。两组女性的性激素、铁代谢及骨代谢指标比较,研究组铁代谢相关指标血清FER值(119.75±43.72)ng/m L,显着高于对照组(27.66±23.62)ng/m L(t=11.004,P<0.01),总铁结合力(51.07±8.82)umol/L显着低于对照组(56.99±3.90)umol/L(t=-3.673,P<0.01)。两组E2、LH、FSH、P1NP、β-CTX、股骨颈及腰椎骨密度T值均在正常范围内,校正混杂因素后,血清铁蛋白仅与子宫切除时间呈正相关(?=13.673,P<0.01),与E2、LH、FSH、PINP、?-CTX、ALP无显着相关性(?=0.40,2.171,-1.093,-0.436,-0.068,0.469,P=0.652,0.094,0.990,0.819,0.416,0.144)。结论:子宫切除的女性出现铁蓄积现象,子宫切除后停止月经排血是导致铁蓄积的重要原因之一,在雌激素正常情况下,铁蓄积对骨代谢无明显作用。第二部分雌激素对“铁蓄积”小鼠骨代谢的影响及作用机制目的:观察雌激素的有无对铁蓄积小鼠骨量、骨转换指标及氧化应激的影响。方法:建立高铁小鼠模型,将小鼠随机分为对照组(Con组)、雌激素正常的高铁组(F组)、雌激素缺乏的去势组(OVX组)、雌激素缺乏的高铁去势组(F+OVX组)。Con组及OVX组注射生理盐水,其余两组注射的是枸橼酸铁(FAC),4周后对股骨远端进行了普鲁士蓝铁染色,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清的铁蛋白(Fer)、碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(osteocalcin)、骨转换指标I型胶原C端肽(CTX)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP-5b)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD);股骨远端行Micro-CT叁维分析,提取各组小鼠股骨的骨髓细胞进行破骨细胞的培养,抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞分化活性。反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测小鼠胫骨相关基因表达。结果:F组[(335.30±44.10)μg/L]及F+OVX组[(324.80±38.60)μg/L]血清铁蛋白的含量明显升高(P<0.001),且股骨远端铁染色着色明显。ELISA结果示:雌激素正常的F组与Con组比较,CTX、TRAP-5b、MDA、SOD组间差异无统计学意义(P>0.05),F组ALP及osteocalcin表达量较Con组明显降低(P<0.001,P=0.002);而雌激素缺乏的两组,铁剂干预后,MDA、TRAP-5b、CTX明显升高(P=0.004,P<0.001,P<0.001),SOD、ALP、osteocalcin则降低(P<0.001,P<0.001,P=0.002)。Micro-CT分析表明:雌激素存在时,对照组与铁干预组骨密度及相关指标差异无统计学意义(P>0.05);雌激素缺乏时,与OVX组比较,F+OVX组骨量下降更为严重(P<0.001)。TRAP染色显示雌激素正常时,各组小鼠破骨细胞数无明显差异(P=0.501);雌激素缺乏时,F+OVX组破骨细胞数明显高于OVX组(P<0.001)。结论:雌激素存在情况下,FAC对骨量、骨吸收影响甚微;雌激素缺乏情况下,FAC能显着增强破骨活性,使骨量下降。第叁部分雌二醇与铁的联合作用对成骨细胞及破骨细胞分化、增殖活性的影响及作用机制目的:研究成骨细胞、破骨细胞在铁与雌二醇的共同干预下,成骨细胞及破骨细胞分化、增殖生物活性各指标变化,并探讨活性氧ROS在其中的作用。方法:1、成骨细胞选取小鼠颅骨原代细胞,分组如下:对照组(Con组)、铁干预组(FAC组)、雌二醇干预组(E2组)、铁&雌二醇干预组(FAC+E2组),各组用相应的10μM枸橼酸铁胺(FAC)及10n M雌二醇(E2)干预,3d后行碱性磷酸酶(ALP)染色,10d后取培养基上清检测ALP活性;反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测成骨相关基因[Runt相关转录因子2(Runx2)、成骨细胞特异性转录因子(osterix)、骨保护素(OPG)、骨钙素(Bglap)]差异。2、破骨细胞选取细胞系RAW264.7,分组同成骨细胞,以50μM FAC及10n M E2干预,TRAP染色及噬骨陷窝实验检测破骨细胞分化差异,RT-PCR检测破骨相关基因[组织蛋白酶(CTSK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、降钙素受体(CALCR)]差异,荧光酶标仪检测成骨细胞及破骨细胞活性氧(ROS)。结果:1、成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)染色检测结果示,雌激素存在或缺乏情况下,FAC均能抑制碱性磷酸酶(ALP)活性;基因水平上,FAC显着下调Runx2、osterix基因表达水平(P<0.05),该作用与雌激素无关。2、破骨细胞TRAP染色结果示:FAC能显着增加TRAP染色阳性细胞数(P<0.05),而当雌二醇存在时,该作用被抑制。噬骨陷窝的实验也得同样的结果。RT-PCR结果:无雌二醇干预情况下,铁剂能显着上调MMP9、TRAP、CTSK、CALCR基因表达水平(P<0.05),当雌二醇存在时,两组基因的表达无明显统计学差异。活性氧ROS检测结果:在成骨细胞及破骨细胞中,FAC均能增加ROS活性(P<0.05),而雌二醇则能下调活性氧水平(P<0.05)。结论:雌二醇与铁在骨代谢中的拮抗作用可能与骨吸收过程相关,而与骨形成过程无关。仅当雌二醇缺乏情况下,铁才能通过上调ROS,进而促进破骨细胞分化。
郭文清[4]2016年在《骨疏颗粒对骨质疏松大鼠骨代谢指标及炎症因子的影响》文中研究说明研究目的:通过动物实验观察骨疏颗粒(经验方)对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢指标(骨吸收、骨形成标志物)及炎症因子的影响,探讨骨疏颗粒对绝经后骨质疏松症(PMPO)骨吸收、骨形成的调节作用以及对炎症因子表达的干预作用,为中医药防治PMPO的临床应用提供理论依据。研究方法:1、造模与分组:选择3月龄清洁级健康雌性未孕SD大鼠90只,随机抽取15只作为假手术组(空白对照组),假手术组仅手术切除卵巢周围少量脂肪组织;其余75只作为手术造模组,通过手术切除双侧卵巢复制绝经后骨质疏松症模型。术后第12周,假手术组与手术造模组各随机抽取2只大鼠,取其左后肢股骨进行病理组织切片检测,通过病理观察确定造模成功。造模成功后,将手术造模组大鼠随机分为5组:模型组、戊酸雌二醇组、骨疏颗粒高中低剂量组,每组12只。2、给药治疗:空白对照组、模型组给予生理盐水10ml/(kg.d)灌胃;戊酸雌二醇组给予戊酸雌二醇片0.09mg/(kg.d)灌胃;骨疏颗粒高、中、低剂量组分别按照高剂量5.4g/(kg,d),中剂量2.7g/(kg.d),低剂量1.35g/(kg.d)灌胃。连续灌胃12周。3、检测指标:连续不同药物干预12周后,处死大鼠前收集各组大鼠尿液离心待检;股动脉采血离心待检。(1)血钙、血磷、尿钙(Ca)、尿肌酐(Cr)使用生化法进行检测;(2)骨形成标志物血清骨钙素(OC)、血清碱性磷酸酶(ALP)及骨吸收标志物抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、尿脱氧吡啶啉(DPD)检测和炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α均采用ELISA进行分析;(3)大鼠股骨骨病理检测骨小梁数、骨小梁面积百分数、骨小梁分离度、骨小梁厚度。4、研究结果:(1)抽样大鼠骨组织形态学检测:骨小梁数、骨小梁面积百分数、骨小梁分离度、骨小梁厚度4项指标假手术组与手术造模组间之间差异有统计学意义(P<0.01)。(2)血清矿物质(磷、钙):戊酸雌二醇组、骨疏颗粒高剂量组血磷浓度明显高于模型组(P<0.01),骨疏颗粒高剂量组血磷水平明显高于低、中剂量组(P<0.01):骨疏颗粒高剂量组血钙浓度与戊酸雌二醇组无差异(P>0.05),骨疏颗粒高剂量组血钙浓度明显低于低、中剂量组(P<0.01)。(3)骨形成标志物(OC、ALP):骨疏颗粒高剂量组OC高于戊酸雌二醇组(P<0.05),骨疏颗粒高剂量组OC低于中、低剂量组(P<0.05);骨疏颗粒高剂量组ALP浓度与戊酸雌二醇组无差异(P>0.05),骨疏颗粒高剂量组ALP浓度低于中、低剂量组(P<0.05)。(4)骨吸收标志物(TRACP、DPD、Ca/Cr):骨疏颗粒高剂量组与戊酸雌二醇组组间TRACP无差异(P>0.05),骨疏颗粒高剂量组TRACP浓度低于低、中剂量组(P<0.05);骨疏颗粒不同剂量组与戊酸雌二醇组DPD均有统计学意义(P<0.05),骨疏颗粒高剂量组DPD浓度低于低、中剂量组(P<0.05);骨疏颗粒高剂量组与戊酸雌二醇组组间Ca/Cr)无差异(P>0.05),高剂量组降低Ca/Cr水平优于低、中剂量组(P<0.05)。(5)炎症因子(IL-1、IL-6、TNF-α):骨疏颗粒高剂量组与戊酸雌二醇组组间IL-1无差异(P>0.05),高剂量组降低L-1水平优于低、中剂量组(P<0.05);骨疏颗粒高剂量组与戊酸雌二醇组组间IL-6无差异(P>0.05),高剂量组降低L-6水平优于低、中剂量组(P<0.05);骨疏颗粒高剂量组与戊酸雌二醇组组间TNF-α差异有统计学意义(P<0.05),骨疏颗粒不同剂量组间比较,高剂量低、中、高剂量组组间无差异(P>0.05)。(6)骨组织形态学检测:骨疏颗粒高剂量组与戊酸雌二醇组组间骨小梁数无差异(P>0.05),骨疏颗粒高剂量组增加骨小梁数优于低、中剂量组(P<0.05);骨疏颗粒高剂量组与戊酸雌二醇组组间骨小梁面积百分数无差异(P>0.05),高剂量组增加骨小梁面积百分数优于低、中剂量组(P<0.05);骨疏颗粒高剂量组与戊酸雌二醇组组间骨小梁分离度无差异(P>0.05),高剂量组骨小梁分离度低于低、中剂量组(P<0.05);骨疏颗粒高剂量组与戊酸雌二醇组组间骨小梁厚度无差异(P>0.05),高剂量组骨小梁厚度高于低、中剂量组(P<0.05)。结论:1、该绝经后骨质疏松大鼠模型复制成功;2、使用骨疏颗粒与戊酸雌二醇治疗后血磷水平上升、血钙水平下降,推测骨疏颗粒能有效抑制骨吸收,从而抑制骨钙流向血液;3、使用骨疏颗粒与戊酸雌二醇治疗后大鼠OC、ALP均降低,说明骨疏颗粒能有效抑制绝经后大鼠骨高转换状态;4、两药均能降低TRACP、DPD、Ca/Cr,推测骨疏颗粒能抑制骨吸收水平。5、两药均能抑制IL-1、IL-6、TNF-α的表达,推测骨疏颗粒可通过抑制炎症反应影响骨质疏松进程;6、两药均能升高骨质疏松模型大鼠骨小梁数、骨小梁面积百分数和骨小梁厚度,降低骨小梁厚度,推测骨疏颗粒具有间接促进骨形成的作用。上述结果表明,骨疏颗粒通过调节骨代谢,影响骨炎症反应,对绝经后骨质疏松症产生治疗效应,其疗效与戊酸雌二醇相当。
黄宏兴[5]2011年在《去卵巢大鼠肌骨线粒体活性变化及骨康方干预的实验研究》文中指出目的：研究线粒体活性变化及骨康方对其调控作用,探讨肌肉-骨骼组织质与量的改变和骨质疏松形成的作用机制。方法：选用6月龄SD大鼠48只,随机分为空白组、模型组、观察组、对照组,各12只。造模2周后,空白组、模型组予蒸馏水,观察组予骨康方对照组予戊酸雌二醇灌胃。12周后,收集血清和左侧股骨、股直肌分别行BMD测量和MPTP、Cyt C、SDH及SOD、MDA检测。选用3月龄新西兰兔4只,随机分为观察组和对照组,各2只。观察组予骨康方、对照组予戊酸雌二醇灌胃,连续7天灌胃后,采血制备含药血浆。选用1日龄SD大鼠培养成骨细胞,成骨细胞分3组培养：空白组不添加任何血浆、观察组加骨康方含药血浆、对照组加戊酸雌二醇含药血浆培养1周后,行MPTP、SDH检测。结果：1.股骨BMD值：模型组低于空白组(P<0.01)；观察组、对照组分别与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。2.骨骼肌方面：在MPTP活性方面,空白组、观察组、对照组的OD比值均低于模型组(P<0.05)；各组Cyt C含量变化不大(P>0.05)；在SDH方面,观察组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)3.血清SOD和MDA方面：空白组、观察组、对照组与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。4.成骨细胞方面：空白组、观察组的MPTP荧光强度分别与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)；但SDH含量在各组中的变化不大(P>0.05)。结论：骨康方具有提高去势大鼠BMD的作用；能够有效调控骨骼肌和成骨细胞MPTP的开放,提高线粒体SDH的活力和血清SOD的含量,降低血清MDA的活性,起到预防线粒体损伤的作用,从而抑制细胞凋亡,达到防治骨质疏松症的目的。为从“肾主骨,脾主肌,脾肾相关”角度防治骨质疏松症,筛选以线粒体为作用靶点的药物提供了科学依据。
包蕾[6]2011年在《大豆苷原对骨形成的量效作用及ERs/PPARγ的调节机制》文中提出研究背景绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMOP)发病率逐年增高,雌激素替代治疗(estrogen replacement therapy, ERT)虽能减少绝经后妇女的骨丢失及骨折发生率,但由于长期使用可能导致乳腺癌和子宫内膜癌的危险性增加等安全问题使其应用受到限制。大豆苷原(daidzein, DAI)是一种常见的植物雌激素(phytoestrogen, PE),有雌激素样效应而无雌激素样副作用,近年来引起了人们广泛关注。最近的研究提示植物雌激素的骨保护作用具有剂量依赖性的双相作用特点,其机制尚不清楚,雌激素受体(estrogen receptors, ERs)和过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors gamma, PPARy)可能参与介导调节机制,但相关研究报道较少,具体作用机制也不清楚。第一部分大豆苷原防治去卵巢大鼠骨质疏松症的量效作用及其对骨髓细胞ERs和PPARγ表达的影响目的研究不同剂量大豆苷原对去卵巢大鼠血清E2、ALP、脂联素(adiponectin)、瘦素(leptin),骨密度(BMD),以及对骨髓细胞ERα、ERβ和PPARγmRNA和蛋白表达水平的影响,探讨大豆苷原防治去卵巢大鼠骨质疏松症的量效作用,及其对骨髓细胞ERs和PPARγ表达的影响。方法将3月龄SD (Sprague Dawley)雌性大鼠(由复旦大学实验动物科学部提供)随机分为6组：假手术组(sham)、去卵巢组(行双侧卵巢切除ovariectomy, OVX)、去卵巢+戊酸雌二醇组(E2,戊酸雌二醇800μg/kg·d)、去卵巢+高剂量大豆苷原组(H-DAI,大豆苷原200 mg/kg·d)、去卵巢+中剂量大豆苷原组(M-DAI,大豆苷原50 mg/kg·d)和去卵巢+低剂量大豆苷原组(L-DAI,大豆苷原10 mg/kg·d),除假手术组外,其余大鼠均切除卵巢,术后4周开始以相应的药物灌胃,3月后处死大鼠。取血清检测E2、ALP、脂联素及瘦素水平；取腰椎骨L1.5和左股骨检测骨密度后,脱钙行骨切片HE染色观察骨组织形态。从右股骨骨髓腔内提取出骨髓细胞,Realtime-RT-PCR方法检测骨髓细胞ERα、ERβ和PPARγmRNA表达,western blot法检测ERα、ERβ和PPARγ蛋白表达水平。结果1、E2组和L-DAI组血清E2、ALP、adiponectin及leptin浓度显着高于OVX组(P<0.05)；除了leptin浓度外,L-DAI组血清E2、ALP、adiponectin浓度显着高于E2组(P<0.05)、H-DAI和M-DAI组间血清E2、ALP、adiponectin及leptin浓度无显着差异(P>0.05),均显着低于E2和L-DAI组(P<0.05)。2、sham组大鼠的左股骨及腰椎BMD均显着高于其他各组(P<0.05)。L-DAI组大鼠左股骨及腰椎BMD均比OVX组显着增高(P<0.05),且E2组无显着性差异(P>0.05)。M-DAI组大鼠股骨BMD显着高于OVX组(P<0.05),与E2及L-DAI组无显着性差异(P>0.05)；M-DAI组腰椎BMD与OVX组无显着性差异(P>0.05)。H-DAI组大鼠的左股骨及腰椎BMD显着低于L-DAI组(P<0.05),与OVX组无明显差异(P>0.05)。3、大鼠左股骨及腰椎骨组织形态：与sham组比较,OVX组骨小梁数量显着降低,脂肪细胞显着增多。E2可增加骨小梁数量,减少脂肪细胞。大豆苷原叁个剂量组中,L-DAI组可显着增加骨小梁数目及抑制脂肪生成；随着大豆苷原剂量的增加,骨小梁数量显着递减,脂肪细胞显着递增。4、L-DAI组大鼠骨髓细胞的ERαmRNA及蛋白表达量均显着高于M-DAI和H-DAI组(P<0.05),较E2、OVX和sham组增高,但差异不显着(P>0.05)。各组ERβmRNA及蛋白表达量均低于ERa表达量,6组的ERβmRNA及蛋白表达水平未见明显组间差异。H-DAI组大鼠骨髓细胞的PPARγmRNA及蛋白表达水平显着高于M-DAI和L-DAI组(P<0.05)。结论1、大豆苷原对骨产生雌激素样作用,对去卵巢大鼠骨质疏松症有防治作用,且呈现剂量依赖性关系,低剂量时效果与雌二醇相当,高剂量时无骨保护作用。2、大鼠骨髓细胞均表达ERa和ERβ,但以ERa为主,提示ERa在骨保护作用中可能发挥主要作用。3、大豆苷原叁个剂量组中,低剂量组大鼠骨髓细胞ERa表达显着高于中、高剂量组,提示低剂量大豆苷原对骨的保护作用可能是通过ERa来介导的。高剂量组大鼠骨髓细胞PPARγ表达显著高于中、低剂量组,提示高剂量大豆苷原可能通过作用于PPARγ,导致骨量减少及骨髓腔内脂肪细胞增多。4、本实验结果显示大豆苷原低剂量时可显着提高血清脂联素与瘦素水平,提示脂联素及瘦素可能参与了对骨质疏松症的防治作用。第二部分大豆苷原对人类成骨细胞骨形成的量效作用及ERs/PPARγ的调节机制目的研究不同浓度大豆苷原(daidzein, DAI)对成骨细胞骨形成的量效作用,及雌激素受体(estrogen receptors, ERs)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)对DAI骨形成的调节作用。方法①以培养的未经处理的人类胎儿成骨细胞(human fetal osteoblast, hFOB)为对照组(Ctrl组),用17β-戊酸雌二醇(β-estradiol-17-valerate, E2)和不同浓度DAI分别处理hFOB 72小时后,MTT法测定细胞增殖情况,PNPP法测定成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性。②用ERs拮抗剂ICI182780、ERa拮抗剂MPP、PPARγ拮抗剂GW9662分别阻断受体ERs、ERα和PPARγ后,再给予E2及不同浓度的DAI处理,MTT法检测成骨细胞增殖情况并计算细胞增殖率,PNPP法测定ALP水平。③选用高低浓度的大豆苷原分别处理hFOB后,实时定量RT-PCR法检测ERα、ERβ和PPARγmRNA表达水平,western blot法检测ERαERβ和PPARγ蛋白表达水平。结果1、随着DAI剂量的增加,成骨细胞增殖率递减,DAI 10-9mol/L组较对照组显着升高,DAI 10-5mol/L组较对照组显着降低(P<0.05)。随着DAI剂量的增加,成骨细胞ALP水平递减；但差异无统计学意义(P>0.05)。2、ICI阻滞ERs后,E2、DAI 10-9mol/L、10-7mol/L、10-5 mol/L组的细胞增殖率分别为88.16%、76.30%、81.18%、83.19%,均显着低于阻滞前(P<0.05)；MPP单纯阻滞ERa后,E2、DAI 10-9mol/L、10-7mol/L、10-5 mol/L组的细胞增殖率分别为69.78%、63.31%、70.71%、78.43%,均显着低于阻滞前(P'<0.05)。MPP阻滞后,DAI 10-9mol/L组的ALP水平显着低于阻滞前(P<0.05)。3、GW阻滞PPARγ后,E2、DAI 10-9mol/L、10-7mol/L、10-5 mol/L组的细胞增殖率分别是103.14%、96.99%、112.88%和122.22%,其中DAI 10-7、10-5 mol/L组均较阻滞前显着升高(P<0.05),D9组轻度降低但差异无统计学意义(P>0.05)。DAI 10-5 mol/L组的ALP水平较阻滞前显着增加(P<0.05)。4、E2及DAI 10-9 mol/L组的ERαmRNA表达量无明显差异(P>0.05),均显着高于DAI 10-5mol/L组(P<0.05)。DAI 10-5mol/L组PPARγmRNA表达量显着高于E2组(P<0.05)。5、与其余各组比较,DAI 10-9mol/L组ERα蛋白表达水平显著增加,DAI 10-5mol/L组PPARγ蛋白表达水平明显增加。6, ERβmRNA及蛋白表达量在Ctrl、DAI 10-9mol/L、DAI 10-5mol/L组中均低量表达,各组间均无明显差异。结论1、DAI的骨保护作用具有剂量依赖性的双相作用特点：低剂量DAI促进成骨细胞增殖和分化,高剂量DAI抑制成骨细胞增殖和分化。2、低剂量DAI可能主要通过作用于ERα促进成骨细胞增殖和分化,对PPARγ的作用不明显。3、高剂量DAI可能主要通过作用于PPARγ抑制成骨细胞增殖和分化,同时也可通过作用于ERs产生一定促进成骨细胞增殖的作用。4、E2对PPARγ无作用；低剂量大豆苷原可能通过ERβ对成骨细胞增殖产生负性作用。总结1、大豆苷原对骨质疏松症有防治作用,呈现剂量依赖性关系,低剂量时效果明显,高剂量无明显作用。2、低剂量大豆苷原可能主要作用于ERα,表现为骨生成增加,脂肪生成减少。3、高剂量大豆苷原可能主要作用于PPARγ,表现为脂肪生成增加,骨生成减少。4、ERα和PPARγ之间可能存在一种交叉对话的关系,介导大豆苷原防治骨质疏松症的量效作用。
牛雯[7]2009年在《淀粉型可吸收多聚糖止血粉促骨愈合作用的研究》文中研究说明骨手术往往造成较大的创面出血,目前尚无确切的止血手段,除手术输血外,一般是应用骨蜡封闭骨折断面,但骨蜡本身不被机体吸收,妨碍骨质愈合。最新研制出的止血剂淀粉型可吸收性多聚糖止血粉(Starch-derived Absorbable Polysaccharide Hemostat, SAPH)是较为理想的术中止血材料,其为一种来源于淀粉的可吸收性多聚糖止血粉,目前已广泛应用于各种外科手术。SAPH作为一种快速、安全、高效的止血材料,在骨手术中可以有效地减少出血量,以往临床和基础的研究大多是对其止血效果的评价,但SAPH对骨质愈合有无影响、机制又如何,一直是研究的盲点。本研究将观察SAPH对骨质愈合的影响,初步探讨其可能机制。目的:1、观察SAPH对家兔颅骨愈合的影响;2、观察SAPH对成骨细胞增殖和分化的影响;3、初步探讨骨形成蛋白-2(BMP-2)在SAPH促进骨质愈合中的作用。方法:1、SAPH对家兔颅骨愈合的影响以直径6mm钻头在家兔顶骨开深达全层的圆形标准缺损,用SAPH或骨蜡止血并填充缺损处。术后6周,通过骨愈合评分、CT、矿物质沉积速率、骨小梁面积等指标,观察SAPH对骨愈合的影响。2、SAPH对成骨细胞增殖和分化的影响体外培养小鼠颅骨成骨细胞MC3T3-E1系,通过MTT实验绘制细胞生长曲线,以17β-雌二醇为对照,观察不同浓度或不同作用时间的SAPH对成骨细胞增殖的影响;检测细胞碱性磷酸酶和培养上清液中的骨钙素,以反映SAPH对成骨细胞成熟和分化的影响。3、SAPH对骨组织和成骨细胞BMP-2蛋白表达的影响通过免疫组化、Western-blotting的方法,在动物标本和细胞上分别观察SAPH对于骨形态发生蛋白-2表达量的影响。结果:1、家兔颅骨标准化缺损模型建立并处理6周后,SAPH可以明显降低骨愈合评分(评分越低,愈合越好);CT片显示使用SAPH的动物颅骨缺损面积减小;颅骨缺损处边缘矿物质沉积速度增加;丽春红染色示颅骨钻孔区域骨小梁面积增加、有大量骨髓腔形成、缺损区面积减小。而使用骨蜡的动物,愈合评分高,缺损面积大,钻孔区域鲜有骨髓腔和骨小梁形成,甚至出现大片缺如。2、MTT细胞增殖实验结果显示,SAPH和17β-雌二醇均可以抬高细胞生长曲线,17β-雌二醇的作用优于SAPH,细胞增殖在72h时达到顶峰;当SAPH浓度大于0.1μg/ml时,增加浓度并不能加速细胞增殖;反映成骨细胞成熟和分化的碱性磷酸酶和骨钙素在SAPH和17β-雌二醇的作用下明显增加。3、组织和细胞的免疫组化结果提示,应用SAPH的动物颅骨缺损区域BMP-2表达增多;加入SAPH的成骨细胞胞浆内有大量BMP-2的表达,Western-blotting显示该蛋白表达量显着增加。结论:1、SAPH能促进家兔颅骨的愈合,而骨蜡妨碍骨质愈合;2、SAPH可以加速体外培养的成骨细胞的增殖、成熟和分化;3、应用SAPH可以增加家兔颅骨缺损部位和成骨细胞BMP-2的表达,这可能是其促进骨质愈合的机制之一。本研究证明了SAPH在发挥快速、高效止血功能的同时,还可以促进骨质愈合,促进成骨细胞成熟分化,促进BMP-2表达,其效果远优于常用的骨蜡。因此,SAPH可以作为一种安全的骨手术止血剂,并且有望开发成为新型的人工骨替代材料。研究还观察到成骨细胞能在高浓度的SAPH中能正常生长,说明其具有良好的生物相容性,有进一步改良剂型使之成为骨组织工程材料的价值。
李少春[8]2010年在《植物雌激素α-玉米赤霉醇对去卵巢大鼠骨质疏松症的防治作用》文中研究说明目的:本研究采用去卵巢大鼠作为绝经后骨质疏松症模型,研究植物雌激素α-玉米赤霉醇对绝经后骨质疏松症的防治作用并初步探讨其机制。方法:40只6月龄雌性SD大鼠随机分为4组:假手术组(Sham)、模型组(OVX)、雌二醇组(OVX+E_2)、α-玉米赤霉醇组(OVX+α-ZAL)。术后叁周灌胃给予假手术组和模型组生理盐水1mL/100g·d,雌二醇组给予戊酸雌二醇1mg/kg·d,α-玉米赤霉醇组给予α-玉米赤霉醇1mg/kg·d。12周后处死动物,分离血清、子宫及左侧股骨、胫骨,检测以下指标:称量子宫重量计算子宫指数;采用全自动生化分析仪检测大鼠血清的Ca、P和ALP等骨代谢指标;双能X线骨密度仪测定左侧股骨骨密度(BMD);放射免疫法测定血清E_2、CT、PTH及TNF和IL-1水平;RT-PCR法检测骨组织ERα和ERβmRNA表达情况。结果:1、大鼠血清Ca、P水平各组之间无显着差异,而血清ALP模型组明显高于假手术组,经过E_2和α-玉米赤霉醇治疗后ALP明显下降,但其水平仍高于假手术组。BGP水平去卵巢组亦明显高于假手术组,E_2和α-玉米赤霉醇治疗后血清BGP水平有下降趋势。2、去卵巢组大鼠E_2水平显着低于假手术组、雌二醇组和α-玉米赤霉醇组,雌二醇组和α-玉米赤霉醇组之间无显着差异;去卵巢组血清CT水平与假手术组、雌二醇组和α-玉米赤霉醇比较有降低趋势,差异有显着性;PTH水平模型组明显高于假手术组、雌二醇组和α-玉米赤霉醇组。3、大鼠去势后血清IL-1水平较假手术组有升高的趋势,经过E_2和α-玉米赤霉醇治疗后IL-1水平明显下降,但较假手术组仍高。模型组TNFα水平较假手术组明显升高,经E_2和α-玉米赤霉醇治疗后水平下降。4、模型组大鼠BMD明显低于其余各组,经过E_2和α-玉米赤霉醇治疗后BMD明显改善,与假手术组之间无显着差异,E_2组和α-玉米赤霉醇组之间BMD无明显差异。5、模型组大鼠骨组织ERα和ERβmRNA与假手术组相比明显降低,经E_2治疗后ERα和ERβmRNA表达增加,而α-玉米赤霉醇可以使ERαmRNA表达增加。结论:1、α-玉米赤霉醇能明显增强去卵巢大鼠骨密度,提高体内雌激素水平,调节激素水平,影响细胞因子,提示其对绝经后骨质疏松症可能具有较好的防治作用。2、α-玉米赤霉醇能调节骨骼细胞的雌激素受体表达,上调ERα的表达,这可能是其防治绝经后骨质疏松症的机制之一。
俞钶[9]2008年在《雌二醇对多发性骨髓瘤成骨细胞病理机制的干预作用》文中研究指明第一部分多发性骨髓瘤患者血清OPG检测及临床意义【目的】护骨素(osteoprotegerin,OPG)是近来研究发现在多发性骨髓瘤骨病发生发展中起重要作用的因子。本研究旨在探讨OPG在多发性骨髓瘤患者血清中的表达水平及其与骨病、预后的关系,初步探索其在多发性骨髓瘤骨病和预后判断中的作用。【方法】收集28名多发性骨髓瘤患者试验组和28名眼科患者对照组的血清,采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)技术分别检测血清中的OPG水平。【结果】多发性骨髓瘤患者的血清OPG水平为(222.4±114.8)pg/ml,与对照相比明显降低(P<0.01)。骨损0-1个组患者血清OPG水平为(312.4±129.6)pg/ml,而2-3个组为(179.0±59.4)pg/ml,0-1组明显高于2-3组(P<0.01)。多发性骨髓瘤患者血清OPG水平与β2-微球蛋白有关(P<0.01),与白蛋白可能有关(P=0.0696),与球蛋白相关(P<0.01),与临床分期、免疫学分型、血红蛋白、血钙未发现有相关性。【结论】多发性骨髓瘤患者血清OPG水平明显低于对照,且其降低程度与骨损害的严重程度密切相关;同时,OPG水平与β2-微球蛋白呈负相关,而β2-微球蛋白是反映多发性骨髓瘤预后的明确指标,提示血清OPG水平可能对多发性骨髓瘤的预后具有重要意义。第二部分雌二醇对多发性骨髓瘤成骨细胞病理机制的干预作用【目的】本研究旨在探讨17β-雌二醇(17β-oestradiol,E2)对体外培养的多发性骨髓瘤共培养条件下的成骨细胞增殖、碱性磷酸酶活性、矿化结节形成能力和基因表达的作用,探索其在多发性骨髓瘤骨病的治疗中的作用。【方法】以含20%多发性骨髓瘤细胞条件培养基的DMEM常规培养原代成骨细胞,以各浓度的17β-雌二醇作用于成骨细胞,24小时后用MTT法检测细胞的增殖变化;48小时后检测ALP活性;14天后茜素红染色测定矿化结节形成情况。将MM细胞与成骨细胞共培养,以E2作用成骨细胞,48小时后用RT-PCR法检测成骨细胞RANKL与OPG的基因表达,培养上清中的RANKL与OPG浓度用ELISA法测定。【结果】在多发性骨髓瘤条件下,成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶活性、矿化能力均受到抑制,RANKL表达分泌增强,OPG则降低。10-5～10-8mol/L的雌二醇均能够逆转多发性骨髓瘤对成骨细胞增殖的抑制作用,剂量依赖性的改善MM细胞对成骨细胞生成ALP的抑制;10-6～10-8mol/L的E2能够改善成骨细胞被抑制的矿化能力。在共培养条件下,E2能够抑制RANKL的表达和分泌,增强成骨细胞OPG的表达和分泌,逆转多发性骨髓瘤细胞对RANKL/OPG率的影响。【结论】在多发性骨髓瘤条件下,E2对成骨细胞有促生长增殖的作用;能够增强ALP的分泌和矿化;抑制RANKL的表达和分泌、增强OPG表达和分泌,从而可能抑制成骨细胞对破骨细胞的促进功能,提示E2可能成为治疗多发性骨髓瘤骨病的一种潜在药物。
孟洁[10]2010年在《α-玉米赤霉醇对体外培养成骨细胞的影响及机制》文中研究说明目的:利用体外细胞培养的方法观察α-ZAL对大鼠成骨细胞增殖、成骨细胞内NO含量以及成骨细胞内c-jun基因的表达情况等,探讨α-ZAL对大鼠成骨细胞的影响,为其应用于绝经后骨质疏松症的治疗提供理论依据。方法:取新生SD大鼠(24h),断头处死后,用75%的酒精浸泡消毒10分钟,酒精中取出大鼠,从颈部沿头盖骨剥离皮肤,取下头盖骨,剔净、漂洗、剪碎。加入0.25%胰蛋白酶消化20min后,用PBS洗涤;加入0.1%胶原酶放入CO2培养箱中1h后,加细胞培养液,吹打均匀;实验时将细胞以10~5个/m1的密度接种于培养板,置培养箱中培养;待细胞贴壁,吸去培养液,换上新的培养液。将细胞分四组:正常组(加入正常培养液)、雌激素组(加入含雌激素10~(-10) mol/L培养液)、10~(-7) mol/Lα-ZAL浓度组和10~(-10) mol/Lα-ZAL浓度组,加入相应药物,然后在不同时间检测以下指标:(1)流式细胞术检测不同浓度α-ZAL对成骨细胞凋亡的影响。(2)试剂盒检测各组成骨细胞内NO含量的变化。(3)免疫组化方法检测各组成骨细胞内c-jun基因的表达情况。结果:(1)雌激素组、α-ZAL10~(-7) mol/L组和α-ZAL10~(-10) mol/L组成骨细胞凋亡率均低于正常组,其中α-ZAL对成骨细胞的影响要低于雌激素。(2)各浓度α-ZAL均使成骨细胞NO含量明显增加, 24h时随α-ZAL浓度增加,NO含量也逐渐增加, 10~(-10)mol/L时升高作用明显。48h结果显示:α-ZAL10~(-7) mol/L和α-ZAL10~(-10) mol/L均能增加细胞中NO含量,但α-ZAL10~(-10) mol/L对成骨细胞的影响要弱与α-ZAL10~(-7) mol/L。(3)10~(-10) mol/L E2组,10~(-7) mol/Lα-ZAL浓度,10~(-10)mol/Lα-ZAL浓度组较正常组在胞质表达深,正常组表达较浅,说明10~(-7) mol/Lα-ZAL浓度,10~(-10) mol/Lα-ZAL浓度组可以通过c-jun来抑制成骨细胞的凋亡。结论:(1)α-ZAL能抑制成骨细胞的凋亡,促进其增殖。(2)α-ZAL能调节成骨细胞内NO含量,可能与其对成骨细胞的调节作用有关。(3)α-ZAL能上调成骨细胞内c-jun基因的表达。
参考文献：
[1]. 17β-雌二醇对成骨细胞生成影响的实验研究[D]. 袁成良. 第叁军医大学. 2003
[2]. 脱氢表雄酮及补肾宁心方对成骨细胞—免疫网络的调控作用[D]. 王凌. 复旦大学. 2006
[3]. 雌激素对“铁蓄积导致骨代谢异常”的影响及作用机制的研究[D]. 费蓓蓓. 苏州大学. 2017
[4]. 骨疏颗粒对骨质疏松大鼠骨代谢指标及炎症因子的影响[D]. 郭文清. 云南中医学院. 2016
[5]. 去卵巢大鼠肌骨线粒体活性变化及骨康方干预的实验研究[D]. 黄宏兴. 湖南中医药大学. 2011
[6]. 大豆苷原对骨形成的量效作用及ERs/PPARγ的调节机制[D]. 包蕾. 复旦大学. 2011
[7]. 淀粉型可吸收多聚糖止血粉促骨愈合作用的研究[D]. 牛雯. 第四军医大学. 2009
[8]. 植物雌激素α-玉米赤霉醇对去卵巢大鼠骨质疏松症的防治作用[D]. 李少春. 河北大学. 2010
[9]. 雌二醇对多发性骨髓瘤成骨细胞病理机制的干预作用[D]. 俞钶. 华中科技大学. 2008
[10]. α-玉米赤霉醇对体外培养成骨细胞的影响及机制[D]. 孟洁. 河北大学. 2010
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