棉铃虫核多角体病毒膜融合蛋白F的结构生物学研究

论文摘要

包膜病毒侵染细胞是由病毒包膜融合糖蛋白的一系列结构变化触发。杆状病毒出芽病毒粒子（BV）的囊膜顶端存在膜融合蛋白——GP64或F蛋白。已经获得了 GP64的晶体结构,而F蛋白的晶体结构至今仍未被解析。已知GP64蛋白是组Ⅰ型核多角体病毒（group Ⅰ NPV）的膜融合蛋白,属于Class Ⅲ型病毒膜融合蛋白;F蛋白则是组Ⅱ型核多角体病毒（group Ⅱ NPV）与颗粒体病毒（GV）的膜融合蛋白,通过模拟结构特征将F蛋白归类为ClassⅠ型病毒膜融合蛋白。F蛋白先表达出前体F0,之后F0被Furin蛋白酶剪切成F1、F2片段并由二硫键连接装配成具有融合功能的成熟F蛋白。本篇论文以棉铃虫核多角体病毒（Helicoverya armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HearNPV）的膜融合F蛋白作为研究对象,实验通过果蝇表达系统（DES）S2细胞稳定表达HearNPV F蛋白的膜外结构域HaFect（31-611aa）。利用Ni-NTA亲和层析、MonoQ离子交换层析等纯化蛋白的方法获得了可用于结晶实验的高纯度目的蛋白,并在结晶实验前对目的蛋白进行去糖基化实验以提高其均一性,使之更有利于结晶。经过不断优化结晶条件并采用soaking硒代尿素、重金属衍生物及卤素原子等方法获得具有反常散射信号的衍射数据,再通过SAD等方法解析出F蛋白结构。为了证明F蛋白在溶液中的状态,我们进行了静态光散射和X射线小角散射（SAXS）等实验验证。我们完成了对杆状病毒F蛋白的膜外区域结构的解析,在该领域取得了较大的进步。

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摘要

Abstract

1 前言

1.1 病毒膜融合概述

1.2 包膜病毒膜融合的作用机制

1.3 病毒膜融合蛋白

1.3.1 Class Ⅰ膜融合蛋白

1.3.2 Class Ⅱ膜融合蛋白

1.3.3 Class Ⅲ膜融合蛋白

1.4 三类膜融合蛋白的特征对比

1.5 病毒膜融合蛋白的融合肽

1.6 膜融合的触发机制

1.7 杆状病毒

1.7.1 杆状病毒概述

1.7.2 杆状病毒的进化分类

1.8 杆状病毒的膜融合蛋白

1.8.1 GP64结构和功能研究

1.8.2 F蛋白研究进展

1.9 DES果蝇表达系统

1.10 结构生物学

1.10.1 结构生物学研究方法

1.10.2 蛋白质结晶的过程

1.10.3 蛋白质结晶的方法

1.10.4 相位的获得

1.11 研究内容及意义

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 主要仪器

2.1.2 主要试剂

2.1.3 质粒和细胞系

2.1.4 配制的常用试剂

2.1.4.1 分子克隆试剂

2.1.4.2 细菌培养和蛋白质表达相关试剂

2.1.4.3 蛋白纯化相关试剂及缓冲液

2.1.4.4 SDS-PAGE蛋白电泳相关试剂

2.2 实验方法

2.2.1 载体及细胞培养

2.2.1.1 载体

2.2.1.2 S2细胞培养

2.2.1.3 S2细胞复苏

2.2.1.4 S2细胞冻存

2.2.1.5 瞬时转染

2.2.1.6 稳定转染

2.2.2 目的蛋白的表达

2.2.3 重组蛋白的纯化

2.2.3.1 Ni-NTA亲和层析

2.2.3.2 离子交换柱层析

2.2.4 结晶条件的优化

2.2.5 X射线晶体衍射法

2.2.6 重原子引入的方法

2.2.7 X射线小角散射法（SAXS）

3 结果与讨论

3.1 HearNPV F蛋白前期研究

3.2 F611的表达与纯化

3.2.1 F611 Ni-NTA亲和层析

3.2.2 F611 MonoQ阴离子交换柱层析

3.3 F611蛋白结晶实验

3.3.1 沉淀剂浓度及缓冲液pH的优化

3.3.2 改变盐浓度的优化

3.3.3 结晶条件增加重原子的优化

3.3.3.1 结晶条件中增加NaI

3.3.3.2 结晶条件中增加NaBr

3.3.4 改变沉淀剂的优化

3.3.5 改变盐种类的优化

3.3.6 结晶条件中添加甘油的优化

3.4 F611晶体衍射前处理

3.5 F611晶体衍射数据的采集及处理

3.6 F611晶体结构解析

3.7 探索F蛋白在溶液中的聚集状态

3.7.1 静态光散射实验

3.7.2 X射线小角散射实验

4 总结

参考文献

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 翁梦婷

导师: 林天伟

关键词: 杆状病毒,蛋白,晶体结构

来源: 厦门大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 厦门大学

分类号: Q936

DOI: 10.27424/d.cnki.gxmdu.2019.000383

总页数: 73

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