山东省猪瘟流行病学调查及分离毒株E2基因的遗传变异分析

论文摘要

猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus,CSFV）引起的一种急性、热性、接触性传染病,具有高度传染性和致死性,猪是该病的唯一天然宿主。CSF对世界养猪业造成了巨大的经济损失,是对世界养猪业危害最大的猪病之一。猪瘟最早于1833年在美国俄亥俄州出现,并迅速传播到世界各大洲。1954年,我国科学家研制出了高效猪瘟兔化弱毒疫苗,使我国的猪瘟疫情得以迅速控制,并帮助许多国家根除了CSFV的威胁。上世纪90年代末期,涂长春等学者对中国各地区的CSFV进行了系统性流行病学调查,并通过基因测序等方法对中国的猪瘟毒株进行了分型,为世界猪瘟病毒数据库的完善做出了巨大的贡献。经调查发现,中国同时存在基因Ⅰ型（1.1亚型）、基因Ⅱ型（2.1、2.2、2.3亚型）和基因Ⅲ型（3.4亚型）,目前我国流行的毒株主要为2.1亚型,基因Ⅲ型仅在台湾地区存在。本研究基于对2016年-2018年本实验室接收的来自山东各地的CSF临床样品检测分析,对山东省CSF疫情进行了系统的流行病学调查,包括临床病例的发病情况调查,送检样品的病理组织学检测、病原学检查、CSFV的分离鉴定以及CSFV-E2抗体的检测,并对E2基因进行了序列的测定及遗传变异分析。调查结果显示,发病猪的症状表现不尽相同,急性病例以高热、神经症状、皮肤斑点状出血、高死亡率为主要特征,妊娠母猪会引起流产、死胎等症状;公猪表现为包皮炎、阴鞘积尿等症状;仔猪多有神经症状,表现为磨牙、后退、转圈、强直、侧卧及游泳状,甚至昏迷等。慢性病例主要表现持续发热、精神沉郁、腹泻、消瘦等症状,还会因继发或并发细菌或其他病毒感染使症状复杂化。该病的发生无明显的季节性,从冬春多发转为目前的四季常发。急性病例的剖检病变主要表现为淋巴结、肾脏、胃肠道黏膜等全身组织器官广泛性出血,脾脏边缘出血性梗死;慢性病例除出血性病变外,特征病变为肠道黏膜溃疡。猪瘟组织病理学的特征病变为淋巴组织出血性坏死、病毒性脑炎及组织器官的广泛性出血。在送检的1716份样品中,经RT-PCR检测有207份CSFV阳性,阳性率为12.06%（207/1716）。CSFV-E2抗体检测结果显示,在12709份血清中,阳性为9767份,占76.85%。经分群统计发现,种公猪、经产母猪、后备母猪、仔猪、育肥猪的抗体阳性率分别为89.34%、84.44%、83.25%、70.94%、67.66%。抗体检测结果表明,各猪场均高度重视种公猪、母猪的疫苗免疫,抗体阳性率和抗体水平都比较高,但对于仔猪和育肥猪的免疫多存在一定的问题,免疫状态欠佳,这可能是造成目前猪瘟多发的主要原因,当然生物安全措施不到位也是现在传染性疾病多发的重要原因。对分离到的41株CSFV进行了E2基因序列的测定,经同源性比对、遗传进化分析和突变位点分析发现,分离株大多为猪瘟病毒2.1d亚型,仅有1株为2.1b亚型;与参考株之间的核苷酸同源性及推导氨基酸同源性分别为81.1%-96.2%和88.2%-98.4%,与2.1亚型的同源性最高;通过突变位点分析,发现糖基化位点发生了986NYAK-NYTE989的突变,推测是E2蛋白在疫苗免疫的压力下发生了与疫苗株HCLV相同的突变;抗原位点“717TTWKEYSH724”、“771LLFDGTNP778”、“829TAVSPTTLR837”均发生了突变,但突变后产生的影响需进一步研究,抗原表位“995YYEP998”未发生变化。综合上述研究结果,目前山东省CSFV的感染压力仍然很大,猪瘟疫苗的使用虽能够对猪群产生有效的保护力,但未彻底消除疫病发生风险,各规模猪场应加大疫苗免疫效果监测,调整优化疫苗免疫程序,健全生物安全措施,在综合防控的基础上,最终实现核心猪群的监测净化。本研究进一步丰富了山东省CSF的流行病学资料,对于新型疫苗的研发亦具有一定的指导意义。

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ABSTRACT

前言

1.1 猪瘟概述

1.2 病原学

1.2.1 猪瘟病毒的粒子结构及理化性质

1.2.2 猪瘟病毒的基因组结构

1.2.3 猪瘟病毒的蛋白结构及其功能

1.2.3.1 结构蛋白

1.2.3.2 非结构蛋白

1.3 猪瘟的流行病学

1.3.1 猪瘟的传播途径

1.3.2 猪瘟的国内外流行情况

1.3.3 猪瘟病毒分子的流行情况

1.4 猪瘟的临床症状及病理变化

1.5 猪瘟的检测方法

1.5.1 病原学检测方法

1.5.2 血清学检测方法

1.6 猪瘟的疫苗免疫情况

1.7 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 样品的收集

2.1.2 主要仪器设备

2.1.3 主要实验材料

2.1.4 相关溶剂的配制

2.1.5 引物的设计与合成

2.2 实验方法

2.2.1 病原检测

2.2.1.1 病料样品的处理

2.2.1.2 病料样品的鉴定

2.2.2 组织病理学检测

2.2.2.1 玻片处理

2.2.2.2 石蜡切片的制备

2.2.2.3 切片的HE染色

2.2.3 病毒的分离鉴定及序列测定

2.2.3.1 PK-15 细胞的准备

2.2.3.2 病毒的分离

2.2.3.3 E2 基因的扩增

2.2.3.4 扩增产物的纯化回收

2.2.3.5 阳性样品E2 基因序列的测定

2.2.3.6 E2 基因序列及推导氨基酸序列的分析

2.2.4 血清样品抗体含量的检测

2.2.4.1 血液样品的处理

2.2.4.2 CSFV抗体含量的检测

3 结果与分析

3.1 CSF病例的临床症状及剖检变化

3.2 CSF组织病理学的检测结果与分析

3.3 CSFV的 PCR检测结果与分析

3.4 CSFV的分离鉴定结果与分析

3.5 CSFV分离株E2 基因的同源性分析及遗传演化分析

3.5.1 CSFV分离株E2 基因的同源性比对结果与分析

3.5.2 CSFV分离株E2 基因的遗传演化分析结果

3.5.3 CSFV分离株E2 基因推导氨基酸序列的主要突变位点分析

3.6 血清样品抗体检测结果与分析

3.6.1 山东省各地区CSFV抗体检测结果与分析

3.6.2 不同生长阶段猪群的抗体检测结果与分析

4 讨论

4.1 山东省猪瘟的流行病学调查

4.2 CSFV-E2 基因的遗传变化分析

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王宏宇

导师: 刘思当

关键词: 山东省,猪瘟,流行病学调查,遗传变异分析,突变位点分析

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学,畜牧与动物医学

单位: 山东农业大学

基金: 国家重点研发计划项目课题(编号:2017YFD0500605)

分类号: S858.28;S852.651

总页数: 59

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山东省猪瘟流行病学调查及分离毒株E2基因的遗传变异分析

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