尹健[1]2003年在《外周造血干细胞纯化、体外扩增及多药耐药基因转染的实验研究》文中提出目的：本研究的目的是寻找最佳细胞因子组合，以及利用RetroNectin提高逆转录病毒介导的多药耐药基因的转染效率，从而为临床治疗做准备。 实验材料和方法：外周血标本均来自2001年15月至2002年5月在天津医科大学附属肿瘤医院住院接受自体外周血干细胞移植的恶性肿瘤患者。标本共22份，男女患者各11人，平均年龄38.8岁。采用CE(卡铂+足叶乙甙)+G-CSF+GM-CSF方案动员后采集。利用磁性细胞分离器对造血干细胞进行分选后，在不同细胞因子组合下进行体外培养：①对照组，不加任何细胞因子；②SCF+IL-3+GM-CSF+TPO；③FL+GM-CSF+IL-4；④SCF+IL-3+FL+TPO；⑤SCF+IL-3+IL-6+FL+GM-CSF；⑥SCF+IL-3+FL+TPO+EPO。观察培养不同时间的细胞总数、CD34+细胞比例及集落形成能力。利用逆转录病毒作载体将多药耐药基因导入造血干细胞，在转染中予细胞因子支持，并利用RetroNectin以提高转染效率。通过Rhodamine 123排出法、RT－PCR、竞争性PCR、集落形成和抗性实验、细胞增殖实验(MTT)检测基因的转染效率及效果。 结果：22份外周血标本中CD34+细胞的比例为1.3±0.28％，分选后CD34+细胞的纯度为90.3±4.35％，回收率为62.39±5.21％。第6组细胞因子组合(SCF+IL-3+FL+TPO 天津医科大学博士学位论文十EPO)支持下，CD34+细胞的增殖能力最强，所占比例最高。在该组细胞因子组合支持下，利用RetroNectin可使逆转录病毒介导的基因转染效率超过20%，转染组的耐药性较未转染组增强。 结论:在SCF+IL一3+FL+TPO+EPO的支持下，利用RetroNectin可以使逆转录病毒介导的多药耐药基因的转染效率达到20%，基本满足了临床治疗的需要。
梁雪[2]2009年在《人脐血源基质细胞新型微环境对残留白血病细胞的作用及机制探讨》文中研究说明残留白血病细胞或称白血病微小残留病(minimal residual disease;MRD)是白血病治疗达到完全缓解后体内残留的白血病细胞,多处于G0期,对化疗药物不敏感,是白血病难治、复发的主要根源。目前,尚未发现真正的白血病细胞特异性抗原,虽然采用多种方法联合但均不能满意杀灭和有效清除患者体内的MRD,而且采用化疗新药和更强烈的联合化疗方案多对正常造血功能造成严重的损伤。针对MRD,目前尚缺乏有效低毒的清除措施,已成为严重束缚白血病治疗取得突破性进展的关键性障碍之一。探索不同来源基质细胞所构建造血微环境对MRD的作用及机制,对进一步降低白血病复发、提高白血病长期生存率,具有重要的理论和实践意义。造血微环境(hematopoietic inductive microenvironment, HIM)是调控造血干/祖细胞生长发育的“土壤”,骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)是构成造血微环境的重要成分。白血病细胞是恶性克隆性增殖的造血细胞,其生存、分化、增殖同样依赖HIM的调控,白血病骨髓基质细胞微环境有助于白血病细胞的庇护、生长和逃避化疗药物的杀伤,是MRD产生的重要机制之一,因此从造血微环境入手探索清除MRD的有效方法是白血病治疗的新的切入点。本课题组的既往研究证实:在适当的细胞因子组合的条件下,可成功培养、扩增人脐血来源的基质细胞(human umbilical cord blood-derived stromal cells, hUCBDSCs);扩增后的hUCBDSCs在细胞组成和免疫表型上与人骨髓基质细胞(human bone marrow stromal cells, hBMSCs)相似,可以分泌多种细胞因子,具有与hBMSCs相似的支持和重建造血功能的物质基础,可称为人脐血源基质细胞造血微环境(hematopoietic inductive microenvironment from human umbilical cord blood-derived stromal cells, hUCBDSC-HIM)。人急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat细胞分别与hUCBDSC-HIM和正常人骨髓基质细胞造血微环境(hBMSC-HIM)共培养发现:hUCBDSC-HIM具有较hBMSC-HIM对Jurkat细胞更强的抑制作用和促凋亡作用。鉴于此,本实验将系统、深入地研究不同来源基质细胞所模拟造血微环境对残留耐药Jurkat细胞的细胞周期分布、增殖、分化、凋亡及药物敏感性等生物学特性的影响,并对其机制进行初步探讨。研究内容及方法:1.不同来源骨髓基质细胞微环境对Jurkat细胞生物学特性的影响实验分组:①Jurkat细胞悬浮培养组;②Jurkat细胞/正常hBMSCs共培养组;③Jurkat细胞/白血病hBMSCs共培养组。倒置显微镜和扫描电镜观察Jurkat细胞与BMSCs的位相关系;MTT法检测Jurkat细胞的黏附率;Transwell法检测Jurkat细胞迁移侵袭功能变化;CCK-8法、Real-time Q-PCR法、Western blot法检测Jurkat细胞增殖特性的变化;流式细胞仪法检测Jurkat细胞周期及DNR摄药量变化;流式细胞仪法、透射电镜、Real-time Q-PCR法、Western blot法检测Jurkat细胞的凋亡;NBT还原法检测Jurkat细胞分化水平变化。2.残留耐药Jurkat细胞的培养及其耐药机制的初步探讨体外分离培养初发急性淋巴细胞白血病患者BMSCs以模拟骨髓造血微环境,在与Jurkat细胞长期共培养的过程中选用含DNR 50ng/ml的培养液进行培养,随着培养时间的延长,绝大部分Jurkat细胞漂浮死亡。极少数残留的Jurkat细胞逐渐恢复活力并获得抗药能力,可以在DNR终浓度为50ng/ml的培养液中存活、增殖,将该细胞记为Jurkat/DNR细胞。CCK-8法检测Jurkat及Jurkat/DNR细胞的增殖特性及对多种化疗药物的耐药系数;流式细胞仪法检测Jurkat及Jurkat/DNR细胞周期及DNR摄药量;通过检测Caspase-Glo 3/7活性、Real-time Q-PCR法、Western blot法检测Jurkat及Jurkat/DNR细胞的凋亡相关指标;Real-time Q-PCR法检测Jurkat及Jurkat/DNR细胞多药耐药相关基因:MDR1及MRP mRNA的表达。3.人脐血源基质细胞对残留耐药Jurkat细胞的作用实验分组:①Jurkat/DNR细胞悬浮培养组;②Jurkat/DNR细胞/正常hBMSCs共培养组;③Jurkat/DNR细胞/hUCBDSCs共培养组;④Jurkat/DNR细胞/白血病hBMSCs共培养组(仅在检测对IDA敏感性时设定)。收集悬浮培养及共培养10d的Jurkat/DNR细胞,检测其增殖、细胞周期分布、凋亡、分化、对IDA药物敏感性及多药耐药基因MRD1 mRNA表达水平的变化。结果:1.倒置显微镜及扫描电镜观察:随培养时间延长,正常hBMSCs及白血病hBMSCs黏附、龛合、包裹Jurkat细胞,对共培养的Jurkat细胞具有一定的屏蔽作用,在一定程度上影响其生物学特性:1.1黏附、迁移作用:白血病hBMSCs对Jurkat细胞的黏附、趋化作用强于正常hBMSCs;1.2增殖曲线:正常hBMSCs对Jurkat细胞的增殖抑制作用强于白血病hBMSCs;1.3细胞周期分布:白血病hBMSCs共培养组Jurkat细胞G0/G1+G2/M期细胞比例明显增高;正常hBMSCs共培养组S+G2/M期细胞比例明显增高;1.4凋亡:白血病hBMSCs抑制Jurkat细胞凋亡,而正常hBMSCs促Jurkat细胞凋亡;1.5细胞分化:白血病hBMSCs对共培养Jurkat细胞的促分化作用弱于正常hBMSCs;1.6对DNR的摄药量:共培养组Jurkat细胞的摄药量显着低于悬浮培养组,其中白血病hBMSCs共培养组Jurkat细胞的摄药量最低。2嵌合于基质细胞层中的Jurkat细胞在DNR的持续刺激作用下逐步产生耐药性,获得残留耐DNR的Jurkat细胞。Jurkat/DNR细胞与Jurkat细胞相比有以下特点:2.1增殖曲线:Jurkat/DNR细胞较Jurkat细胞的增殖速度明显减缓2.2细胞周期分布:G0/G1期细胞比例增高;异二倍体细胞比例增高;2.3凋亡:发生自发凋亡的细胞明显减少;2.4 DNR摄药量:单个Jurkat/DNR细胞内平均药物浓度明显减低;2.5对多种化疗药物产生多药耐药;2.6多药耐药相关基因:Jurkat/DNR细胞内可检测到MDR1 mRNA表达;MRP mRNA表达水平升高。3.人脐血源基质细胞对残留耐药Jurkat/DNR细胞的作用3.1增殖曲线:hUCBDSCs对Jurkat/DNR细胞的增殖抑制作用强于正常hBMSCs;3.2细胞周期分布:hUCBDSCs及正常hBMSCs均可促Jurkat/DNR细胞进入细胞周期,hUCBDSCs共培养组G0/G1期细胞比例最低;共培养组Jurkat/DNR细胞中异二倍体比例显着降低;3.3凋亡和分化:hUCBDSCs对共培养Jurkat/DNR细胞自发凋亡及分化的促进作用均强于正常hBMSCs;3.4对IDA的敏感性:hUCBDSCs及hBMSCs均可提高Jurkat/DNR对IDA的敏感性,而hUCBDSCs要优于hBMSCs;3.5 MDR1 mRNA的表达:共培养组Jurkat/DNR细胞MDR1 mRNA表达水平低于悬浮培养组,其中hUCBDSCs共培养组的表达水平最低。结论:1.白血病骨髓基质细胞微环境有助于白血病细胞的庇护、生长和逃避化疗药物的杀伤;正常骨髓源基质细胞较白血病源骨髓基质细胞对Jurkat细胞具有更强的促凋亡、分化及抑制增殖的作用。同时,正常hBMSCs可以增加Jurkat细胞对DNR的敏感性。2.白血病骨髓基质细胞模拟的造血微环境可诱导Jurakt细胞产生多药耐药,是残留耐药形成的一个重要原因,提示可能通过改造白血病患者造血微环境以抑制残留白血病的形成及减少复发。3.骨髓源基质细胞和脐血源基质细胞均可改造白血病造血微环境,在一定程度上逆转Jurkat/DNR细胞的耐药性。4.脐血源基质细胞对白血病造血微环境的改造作用及逆转Jurkat/DNR细胞耐药的作用更强。
杨超[3]2010年在《乳腺癌干细胞分离鉴定及免疫治疗研究》文中研究指明目的:肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中具有自我更新和分化潜能的细胞,是肿瘤形成的起始细胞,维持肿瘤生长,是肿瘤复发转移的根源。通过对肿瘤干细胞的分选鉴定可以使我们能更清晰认识其特征,从而寻找新的方法来治疗肿瘤,提高治愈率。肿瘤干细胞理论认为肿瘤是由肿瘤干细胞异常增殖、分化而形成的,常规治疗仅能消灭增殖期的非致瘤性肿瘤细胞,从而使肿瘤缩小甚至消失,但是当治疗停止后,具有耐药性的肿瘤干细胞再次增殖形成肿瘤,并像“蒲公英”一样到处播散。如果我们能去除乳腺癌干细胞,肿瘤将会永远消退,从而达到根治肿瘤的目的。近年来,免疫治疗正逐渐成为肿瘤综合治疗的研究热点,有望成为肿瘤治疗的又一主要手段。免疫治疗中常用的活性细胞有:淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)和特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)。有报道提出,利用树突状细胞(dendritic cell, DC)的高抗原递呈活性,将乳腺癌细胞抗原肽负载DC,从而激活机体免疫反应,可促进抗瘤效应和特异性。树突状细胞作为唯一的专职抗原递呈细胞(antigen processing cell, APC),处于免疫反应的中心地位。非成熟的DC捕获抗原后被激活成为成熟的DC,其细胞表面表达MHCⅠ类和Ⅱ类分子、共刺激分子B7-1(CD80)和B7-2(CD86)、黏附分子CD54(ICAM-1)和CD50(ICAM-3)等,并将抗原肽递呈给CD4+和CD8+T细胞,诱导其成为特异性细胞毒性T细胞(CTL),分泌细胞因子(如IL-12等),产生Th1型免疫应答而发挥抗肿瘤作用。本研究拟采用流式细胞仪测定乳腺癌MCF-7细胞系中CD55高表达(CD55hig)细胞平均荧光密度值,并分选CD55hig细胞,分析其是否具有肿瘤干细胞特性,并以此来检测原发性乳腺癌组织中乳腺癌干细胞的比例,从而寻找一种从乳腺癌组织中分离肿瘤干细胞的方法;术中摘取乳腺癌患者腋窝淋巴结,从腋窝区域引流淋巴结单个核细胞中,诱导培养DCs和肿瘤抗原特异性CTLs,通过体外杀伤实验,为乳腺癌干细胞的治疗提供新的方法和理论依据。方法:第一部分乳腺癌MCF-7细胞系中CD55hig亚群生物学特性分析培养乳腺癌MCF-7细胞系,加入核酸染料Hoechst33342和Verapami,流式细胞仪检测SP亚群和MP亚群细胞比例,并分离SP亚群和MP亚群细胞,以CD55单克隆抗体标记SP干细胞和MP亚群细胞,测定SP干细胞和MP亚群细胞的CD55平均荧光密度值,再以CD55单克隆抗体标记未分选MCF-7细胞,测定CD55hig细胞所占比例,并分选收集CD55hig细胞,检测其细胞贴壁率、克隆形成率和细胞周期等生物学特性,测定CD55hig细胞是否具备肿瘤干细胞特性。第二部分化学药物及免疫治疗对乳腺癌MCF-7细胞系中CD55hig亚群的杀伤研究用不同血药浓度(10%、25%、50%、75%和100%)的化疗药物多西他赛、表阿霉素和氟尿嘧啶杀伤乳腺癌MCF-7细胞,以杀伤效果最高的血药浓度的药物来杀伤CD55hig细胞和CD55low细胞,酸性磷酸酶法测定活细胞数检测其杀伤效应;抽取人外周血,淋巴细胞分离液分离收集单个核细胞,以IFN-γ(1500 U/ml)、抗CD3单抗(100 ng/ml)、IL-1α(100 U/ml)和IL-2(1000 U/ml)诱导培养,流式细胞检测CIK细胞的表型分子CD3、CD4、CD8和CD56表达,培养14天后收集CIK细胞,以效应细胞比靶细胞40:1杀伤CD55hig细胞和CD55low细胞,酶标检测仪检测杀伤率;术中严格无菌摘取乳腺癌引流淋巴结1~2枚,用机械法获取淋巴细胞悬液,并用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,以RPMI1640完全培养基重悬、培养2h,贴壁细胞以rhGM-CSF(1000U/ml), rhIL-4(200U/ml)和TNF-α(200U/ml)联合培养诱导DCs;非贴壁细胞,加入rhIL-2(200U/ml)培养为TDLNCs。分选收集MCF-7细胞中CD55hig细胞,通过冻融法制备肿瘤抗原,负载DCs,将后者与TDLNCs共培养,以诱导肿瘤特异性CTLs。分别培养至第1天和第7天收获DCs,流式细胞分析仪检测其CD1a、CD83和CD86细胞表型,用非放射性细胞毒分析试剂盒,检测CTLs细胞对CD55hig细胞和CD55low细胞体外杀伤活性,分析经诱导的DCs功能和CTLs杀伤特异性。第叁部分原发性乳腺癌组织中CD55hig细胞检测及其临床意义选取2008年2月至2009年1月在我科收治的乳腺癌患者45例。术中切取部分乳腺癌组织,机械法获得细胞悬液,加入抗CD55抗体和抗CK19抗体,对原发性乳腺癌单细胞悬液进行免疫荧光标记,以流式细胞学方法进行检测CD55高表达(CD55hig)群细胞的比例。结合患者的临床资料,分析乳腺癌患者CD55高表达与临床病理学指标的关系。结果:1 MCF-7细胞染色Hoechst3342染料后,流式细胞分析SP比例为4.34±0.59%,而加入维拉帕米后显着减低为0.1±0.07%。2收集SP和MP细胞,分别标记CD55单克隆抗体后,流式细胞术测定SP细胞CD55的平均荧光密度值为100.85±4.57,MP细胞CD55的平均荧光值为50.51±4.75;CD55单克隆抗体标记未分选的MCF-7细胞,流式细胞仪分析CD55hig细胞比例为2.12±0.39%。3 CD55hig和CD55low细胞接种后6h、12h和18h,贴壁率分别为29.53±1.20%、46.40±2.99%、77.2±1.07%和40.87±1.55%、55.40±2.46%、85.10±3.36%,CD55hig细胞贴壁率低于CD55low亚群细胞,P<0.05,差异有统计学意义;接种24h后,CD55hig细胞贴壁率为95.5±1.1%,CD55low细胞贴壁率为96.3±0.96%,P>0.05,无统计学差异。接种12h后,显微镜下观察CD55hig细胞多为球形呈悬浮状态,而CD55low细胞已贴壁为梭形。4 CD55hig细胞和CD55low细胞均具有一定克隆形成的能力,CD55hig细胞在培养一周后克隆形成率为20.04±1.07%,低于CD55low细胞27.14±1.07%,P=0.000,差异有统计学意义。5流式分析发现,CD55hig细胞中G0/G1静止期细胞占85.4±3.37%,明显高于CD55low细胞(58.6±2.55%)及MCF-7细胞(70.73±4.21%),P值均<0.05 ,有统计学差异。CD55hig细胞处于增殖期的S期细胞仅占13.93±3.45% ,明显低于CD55low细胞( 40.36±2.56% )及MCF-7细胞(24.93±2.86%),P值均<0.05,差异有统计学意义。6不同血药浓度化疗药物对MCF-7细胞杀伤效果不一,多西他赛组5个浓度中以10%血药浓度对MCF-7细胞杀伤效果最高57.3±4.75%,表阿霉素组和氟尿嘧啶组以100%血药浓度最高,分别为40.2±2.46%和26.6±2.44%,高于其他浓度杀伤效果。7 (10%血药浓度)多西他赛、(100%血药浓度)表阿霉素和(100%血药浓度)氟尿嘧啶对CD55hig亚群细胞杀伤率为28.5±0.04%、18.4±0.02%和12.4±0.01%,明显低于其对MCF-7细胞杀伤率,P值均小于0.05,差异有统计学意义;对CD55low亚群细胞杀伤率为58.8±0.06%、45.4±2.28%和34.3±0.01%,P值均大于0.05,无统计学差异。8 CIK细胞对叁组细胞都有杀伤,CIK细胞对MCF-7、CD55hig亚群细胞和CD55low亚群细胞杀伤率为39.15±3.30%、42.72±4.36%和46.41±4.67%, CD55low亚群细胞组杀伤率与MCF-7组(P=0.000)和CD55hig亚群细胞组杀伤率(P=0.046)相比,P值均小于0.05,差异有统计学意义;MCF-7组和CD55hig亚群细胞组杀伤率相比,P=0.053,无统计学差异。9诱导前的TDLNCs中,CD3+和CD8+细胞含量分别为73.93±2.18和32.78±3.21%;诱导后DC-Ag-TDLNC组中CD3+和CD8+细胞含量分别为82.67±2.79%和62.54±2.51%,诱导后CD3+、CD8+T细胞含量均明显升高, P<0.01。诱导前TDLNCs中CD4+细胞含量为27.3±2.58%;CD4+细胞含量无明显变化,P>0.05。10特异性CTL对CD55hig、CD55low和MCF-7细胞杀伤率分别为52.86±4.45%、22.41±2.83%、21.67±4.15%,CD55hig组明显高于CD55low和MCF-7组细胞的杀伤率,P<0.001,CD55low和MCF-7组细胞的杀伤率相比较无统计学意义,P=0.629。11多西他赛(10%血药浓度)、CIK细胞和特异性CTL细胞对CD55hig细胞的杀伤率分别为:28.5±0.04%、42.72±4.36%和52.86±4.45%;特异性CTL细胞组与CIK细胞组和多西他赛(10%血药浓度)组相比较,P均为0.000,CIK细胞组与多西他赛(10%血药浓度)组相比较,P=0.000。12本实验测得原发性乳腺癌肿瘤组织中CD55hig比例为0.21±0.20%,较乳腺癌细胞株MCF-7所测CD55hig的比例2.12±0.39%低。13乳腺癌患者组织中CD55hig比例随着淋巴结转移数目增加而增高,0个腋淋巴结转移组、1～3个腋淋巴结转移组和≥4个腋淋巴结转移3组间比较,P =0.000,差异有统计学意义,叁组之间两两比较,均有统计学差异。14乳腺癌患者组织中C-erbB2(++-+++)组CD55hig比例为0.277±0.034%,较C-erbB2(-)组的CD55hig比例(0.028±0.005%)有明显的升高,P=0.000,差异有统计学意义。15 CD55hig比例在乳腺癌不同病理类型之间、不同临床分期之间、ER(-)与ER(+-+++)组之间、PR(-)与PR(+-+++)组之间、Ki67(-),Ki67(+-+++)组之间的差异均无统计学意义,P>0.05。16本研究发现,CD55hig比例在术前化疗组与未化疗组的比较中无统计学差异,P =0.448。结论:1以核酸染料Hoechst33342标记乳腺癌细胞株MCF-7细胞,流式细胞检测发现有淡染的SP细胞,verapamil阻断后此部分细胞明显减少,SP细胞为肿瘤干细胞。2 CD55单克隆抗体标记分选出的SP和MP细胞,检测发现SP细胞CD55荧光值高于MP细胞的荧光值,以此值检测CD55单克隆抗体标记的未分选的MCF-7细胞,发现存在少量的CD55hig细胞。3 CD55hig细胞大多数处于静止期、不贴壁呈悬浮状态和克隆遗传性,CD55hig细胞具有肿瘤干细胞生物学特性。4叁种化疗药物对乳腺癌细胞系MCF-7、CD55hig和CD55low细胞均有杀伤效果,但是由于CD55hig细胞绝大多数处于细胞分裂静止期,化疗药物对其杀伤效果不显着。5 CIK细胞对乳腺癌细胞系MCF-7、CD55hig和CD55low细胞杀伤效应有显着差异,CIK细胞杀伤效果高于化疗药物,但是没有特异性杀伤效果。6经CD55hig细胞冻融抗原刺激诱导的DCs可以使TDLNCs增殖、分化为肿瘤抗原特异性CTLs,针对CD55hig细胞具有较强的杀伤效应,而对其他类型的肿瘤细胞无明显杀伤效应。7特异性CTL细胞对CD55hig细胞具有特异性杀伤效果,其杀伤效果高于CIK细胞和化疗药物,为乳腺癌干细胞的治疗提供新的方法和依据。8流式细胞检测乳腺癌组织中CD55hig细胞比例为0.21±0.20%。9乳腺癌组织中CD55hig细胞比例与腋淋巴结转移的数量、C-erbB2的表达呈正相关联性,与病理类型、临床分期、ER、PR、KI67表达及术前化疗无明显相关,推测CD55hig比例与乳腺癌的转移和病情的进展有相关联性。
参考文献：
[1]. 外周造血干细胞纯化、体外扩增及多药耐药基因转染的实验研究[D]. 尹健. 天津医科大学. 2003
[2]. 人脐血源基质细胞新型微环境对残留白血病细胞的作用及机制探讨[D]. 梁雪. 第叁军医大学. 2009
[3]. 乳腺癌干细胞分离鉴定及免疫治疗研究[D]. 杨超. 河北医科大学. 2010
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