伪狂犬病毒UL12基因的克隆、表达及其相关功能研究

论文摘要

伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）作为猪的一种重要病原体,在全球广泛传播。长期以来,PRV受到兽医学家、病毒学家以及神经生物学家的广泛关注及研究,目前对PRV的研究已经为疱疹病毒发病机制提供了相当全面的参考依据。2018年中国上海报道了首例人类感染PRV的情况,引起相关研究学者们强烈重视。单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus,HSV）UL12基因编码一种碱性核酸酶（Alkaline nuclease,AN）,AN由疱疹病毒科基因组中共同保守序列编码。有研究报道HSV UL12诱导的mtDNA应激反应引发先天性抗病毒反应,本研究以PRV UL12基因为研究对象,对其相关功能做出初步探究。主要内容为:1.pEGFP-N1-UL12重组质粒的构建与PRV UL12蛋白生物信息学分析参考GenBank中PRV UL12基因序列设计特异性引物,以PRV-XJ株为模板,PCR扩增UL12目的基因并成功构建pEGFP-N1-UL12重组质粒;通过生物信息学方法针对PRV UL12氨基酸的序列进行分析预测。2.PRV UL12真核表达及其细胞定位将pEGFP-N1-UL12转染至BHK21细胞中表达,Western blot验证UL12蛋白成功表达,且培养液上清及细胞中均检测到目的蛋白;通过细胞定位检测UL12-GFP融合蛋白,结果显示UL12基因产物同时分布于细胞核与胞浆中。3.PRV UL12基因的相关功能研究相同方法转染表达PRV UL12后,观察UL12-GFP绿色荧光蛋白;流式细胞术检测细胞凋亡情况;以β-actin为内参,相对荧光定量测定细胞caspase-3基因表达水平;绝对荧光定量测定转染表达UL12的BHK21细胞接毒PRV后gB表达水平,绘制一步生长曲线以监测PRV增殖动态。结果显示实验组细胞的荧光形态相较于空载组显著变圆;实验组细胞凋亡率明显升高;caspase-3无显著差异表达;实验组病毒含量较对照组轻微降低。综上所述,本研究首次以PRV-XJ株为模板扩增UL12基因,构建了pEGFP-N1-UL12重组质粒,对PRV UL12基因相关功能做出初步研究,同时亦为HSV UL12基因未来的探索方向提供部分参考依据。

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摘要

ABSTRACT

英文缩略词对照表

第一章文献综述

1 伪狂犬病毒研究进展

1.1 病原学

1.2 病毒分子生物学特征

1.3 病毒复制过程

1.3.1 病毒穿入

1.3.2 核内反应

1.3.3 病毒释放

1.4 潜伏与神经侵染

1.5 病毒凋亡基因抑制

1.6 UL12 基因研究进展

2 细胞凋亡

2.1 形态和生化特征

2.2 细胞凋亡信号通路

2.2.1 外源性细胞凋亡途径

2.2.2 内源性细胞凋亡途径

2.2.3 其他凋亡途径

3 研究目的及意义

第二章 PRV UL12 基因的克隆及生物信息学分析

1.实验材料

1.1 病毒、菌株与细胞

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 伪狂犬病毒UL12 基因的扩增

2.1.1 特异性引物设计

2.1.2 PRV增殖

2.1.3 PRV DNA抽提

2.1.4 PCR扩增

2.1.5 目的片段纯化回收

2.2 构建PEGFP-N1-UL12 重组质粒

2.2.1 目的片段与pEGFP-N1 真核表达载体双酶切

2.2.2 双酶切目的片段回收

2.2.3 目的片段连接至pEGFP-N1 真核表达载体

2.2.4 制备DH5α大肠杆菌感受态细胞

2.2.5 连接产物转化大肠杆菌DH5α

2.2.6 重组质粒鉴定

2.3 PRV UL12 生物信息学分析

2.3.1 PRV UL12 蛋白理化性质分析

2.3.2 PRV UL12 蛋白跨膜区域结构预测

2.3.3 PRV UL12 蛋白信号肽分析

2.3.4 PRV UL12 蛋白相关位点预测

2.3.5 PRV UL12 蛋白二级结构预测

3 结果与分析

3.1 PRV UL12 基因扩增

3.2 PEGFP-N1-UL12 重组质粒的构建及鉴定

3.3 PRV UL12 蛋白生物信息分析

3.3.1 PRV UL12 蛋白理化性质分析

3.3.2 PRV UL12 蛋白跨膜区域结构预测

3.3.3 PRV UL12 蛋白信号肽分析

3.3.4 PRV UL12 蛋白磷酸化位点预测

3.3.5 PRV UL12 蛋白N端糖基化位点预测

3.3.6 PRV UL12 蛋白O-糖基化位点预测

3.3.7 PRV UL12 蛋白二级结构预测

4 讨论

5 小结

第三章 PRV UL12 基因的真核表达及细胞定位

1 实验材料

1.1 主要试剂

1.2 细胞

1.3 主要仪器

1.4 主要溶液配置

2 方法

2.1 PEGFP-N1-UL12 去内毒素质粒抽提

2.2 PEGFP-N1-UL12 重组质粒转染BHK21 细胞

2.3 样品制备

2.4 WESTERN BLOT检测

2.5 UL12-GFP融合蛋白细胞定位

3 结果

3.1 GFP绿色荧光蛋白表达

3.2 WESTERN BLOT检测结果

3.3 PRV UL12在BHK21 细胞中的定位

4 讨论

5 小结

第四章 PRV UL12 基因在BHK21 细胞凋亡中的作用及其对PRV增殖的影响

1 实验材料

1.1 主要试剂

1.2 病毒

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 绿色荧光蛋白表达差异分析

2.2 流式细胞术检测BHK21 细胞凋亡率

2.3 QPCR测定CASPASE-3 凋亡因子表达情况

2.3.1 引物设计

2.3.2 细胞样品总RNA抽提

2.3.3 RT-PCR反应

2.3.4 qPCR测定caspase-3 凋亡因子

2.4 体外表达PRV UL12对PRV增殖的影响

3 结果

3.1 GFP绿色荧光蛋白表达

3.2 流式细胞术检测结果

3.3 CASPASE-3 凋亡因子表达情况

3.4 体外表达PRV UL12对PRV增殖的影响

4 讨论

5 小结

全文总结

参考文献

致谢

作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 徐逸飞

导师: 徐志文

关键词: 伪狂犬病毒,基因,真核表达,细胞

来源: 四川农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 四川农业大学

分类号: S852.65

DOI: 10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.000623

总页数: 73

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