常见益生菌在八大疾病队列肠菌中的潜在角色与肠道细菌库的构建

论文摘要

益生菌因其具有调节肠道微生态、调节免疫、抗炎和抗肿瘤等益生功能广受消费者青睐,从而衍生出多种多样的益生菌产品,如酸奶和益生菌OTC制剂,其全球消费量巨大。尽管有些益生菌菌株已被广泛使用,但对菌株安全性,代谢能力差异,菌株之间复配的潜在互补性仍不够清楚,尤其涉及到常见益生菌在不同疾病人群肠道中的相对丰度差异及潜在角色的系统性研究甚少,研究者和生产者难以精准开发和生产益生菌产品,消费者也缺乏足够的依据去选择产品。高通量测序技术的发展促进了益生菌基因组和肠道菌群测序的普及,特别是宏基因组关联分析等方法对人类微生物群与许多非传染性疾病（如肥胖、糖尿病、肝病,神经退行性疾病甚至癌症）关系的研究,显示出肠道菌群具有成为新型益生菌来源库的巨大潜力。丰富的已公开发表的疾病队列肠道宏基因组测序数据、细菌基因组序列和先进的研究方法使得系统性地检测常见益生菌的相对丰度和相互作用关系进而评估它们在肠道微生物群落中的角色以及比较它们的安全性和功能差异性及互补性成为可能。因此,本研究在疾病队列的肠道细菌宏基因组数据和益生菌基因组数据的基础上,进行数据挖掘,同时结合肠道细菌的大规模分离培养实验和高通量单菌基因组测序分析,旨在阐明常见益生菌、人类肠道微生物群与健康和疾病之间的关系,阐明人类肠道可培养细菌的基因组特征,对于指导常见益生菌、新型肠道益生菌的精准应用有着重要的意义。本研究根据中国国内市场上酸奶和OTC益生菌制剂产品标签收集了益生菌菌种名称,主要涉及15个菌（亚）种,在本研究中定义为常见益生菌菌种（或主要传统益生菌菌种,Major Traditional Probiotics（sub）Species,MTPS）。收集了已公开发表的 1815 份粪便宏基因组测序数据,涵盖常见八大疾病队列（克罗恩病、结直肠腺瘤-癌、强直性脊柱炎、肝硬化、Ⅱ型糖尿病、肥胖、类风湿性关节炎和动脉粥样硬化性心血管疾病）,通过病例—对照研究和基于共丰度的菌群互作分析的方法,研究各个队列中饰演主要角色的菌种及MTPS在其中的角色。结果显示,克罗恩病主要以潜在益生菌缺乏为主,肝硬化和动脉粥样硬化性心血管疾病以潜在致病菌增多为主;总体上看,MTPS在肠道菌群与疾病关联中主要饰演了非主导型的角色,对疾病预防或治疗的作用可能逊色于其他肠道细菌,并且有些菌种在不同队列的富集方向不一致。因此,既要深入研究常见益生菌的菌种/菌株的遗传多样性,指导常见益生菌的精准使用,也要开发新型肠道益生菌资源,构建肠道细菌库,为疾病预防或治疗提供更多起关键作用的基础资源。本研究中的MTPS所对应的已公开发表基因组序列的菌株共444株,对它们进行泛基因组比较分析。应用泛基因组指数,调查MTPS遗传多样性的影响因素。结果表明,不同菌种的泛基因组指数有明显差异,且可能受到包括分离来源、基因组特征和菌种内基因组数量等多因素影响。提示在选择泛基因组水平开放性的菌种时应该更加细致。比较潜在友好生态位组的菌株和潜在不友好生态位组的菌株在携带潜在毒力因子、抗生素耐药基因方面的差异,结果表明潜在友好生态位组的菌株更安全。分析菌种/菌株特异性的代谢能力优势,并基于KEGG模块量化菌株复配的互补性,结果显示菌种/株之间的遗传距离越大,复配的互补性可能更强,这有待进行共培养实验去验证。嗜酸乳杆菌KLDS1.0901作为MTPS的代表,初步考察其生胆固醇降解能力等,并将其与已发表的8株肠道细菌的胆固醇降解能力进行初步比较,结果显示KLDS1.0901的胆固醇降解能力远远弱于这8株肠道细菌。本研究还从154名中国健康志愿者的粪便样品中,采用11种培养基和严格厌氧操作的大规模培养方法,获得了 6487个微生物单菌落培养物。先通过全长16S rDNA测序与比对,挑选出重要的或新颖的菌株1759株,再进行全基因组测序,最终构建了包含1520株细菌的肠道细菌库及其高质量的肠道可培养细菌基因组数据集（Culturable Genome Reference,CGR）。这些细菌可以归类成338个菌种水平的基因组簇,覆盖了人体肠道细菌的主要门,包括厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门和梭杆菌门,覆盖了 38个低丰度（<1%）的菌属。其中的134个簇是新菌种,50个簇是属于新菌属的成员。将CGR里的菌株物种注释信息与八大队列中病人缺乏菌的信息进行比对,结果发现,八大队列病人缺乏菌中精确注释到菌种的共有444菌种次,能被CGR捕获169菌种次,总体捕获率达到了 3 8%。CGR与现有肠道细菌参考数据集（IGCR）的深入比较,结果显示CGR显著（P<0.0001）提高了宏基因组分析比对率和分辨率。IGCR加上CGR后,基因集数目和蛋白质簇数目提高了22%和16%。用已发表的包括中国人、美国人、丹麦人和西班牙人的共计936份肠道宏基因组测序数据进行评价,发现IGCR加上CGR后,数据平均比对率分别显著（P<0.0001）提高了 24.88%、16.95%、18.47%和20.12%,而且对中国人肠道数据的比对率提升作用最大,这可能与构建CGR的所有样品均来源于中国人有关。本研究通过功能基因注释的多种方法,展示了 CGR的基因组功能特点。KEGG代谢通路分析显示:涉及碳水化合物和氨基酸代谢的通路是肠道微生物的核心功能;毒力因子和抗生素耐药性在变形菌门中含量丰富,提示该菌门可能是条件致病菌库;氨基酸和维生素B合成基因广泛存在于各种肠道细菌中,表明肠道微生物群可能是素食中缺乏的营养物质的替代来源。泛基因组分析结果表明:CGR中拟杆菌门细菌是变异的,厚壁菌门和变形杆菌门的细菌是较小变异的,而放线菌门的细菌是相当保守的;管家基因功能显著（P<0.05）富集于核心基因组中,与环境适应性和菌株特异性相关的基因功能则显著（P<0.05）富集于非核心基因组中。

论文目录

摘要

英文摘要

缩略语

1 前言

1.1 立题背景

1.2 文献综述

1.2.1 益生菌

1.2.2 肠道菌群及与八大疾病相关性的研究

1.2.3 泛基因组学

1.2.4 功能基因组学

1.2.5 肠道细菌培养组学

1.3 科学问题的提出

1.4 目的和意义

1.5 主要研究内容

1.6 课题来源

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 样品及伦理审查

2.1.2 主要试剂

2.1.3 菌株分离培养基

2.1.4 主要溶液配制

2.1.5 仪器与设备

2.1.6 主要分析软件和数据库

2.2 试验方法

2.2.1 八大疾病队列的肠道菌群分析和共丰度网络分析

2.2.2 嗜酸乳杆菌KLDS1.0901益生功能分析

2.2.3 常见益生菌的泛基因组分析

2.2.4 常见益生菌的功能注释及互补分析

2.2.5 肠道细菌库的构建

2.2.6 肠道可培养细菌基因组数据集对宏基因组分析促进作用的评价

2.2.7 肠道可培养细菌基因组数据集的功能分析

2.2.8 数据处理及统计分析

3 结果与分析

3.1 常见益生菌种在八大疾病队列肠道菌群中的潜在角色

3.1.1 动脉粥样硬化性心血管疾病

3.1.2 克罗恩病

3.1.3 结直肠腺瘤-癌

3.1.4 强直性脊柱炎

3.1.5 肝硬化

3.1.6 Ⅱ型糖尿病

3.1.7 肥胖

3.1.8 类风湿性关节炎

3.2 嗜酸乳杆菌KLDS1.0901益生特性初步评价

3.2.1 生长性能

3.2.2 产酸性能

3.2.3 碳水化合物代谢能力

3.2.4 胆固醇降解能力

3.3 常见益生菌功能特点的基因组分析

3.3.1 泛基因组的开放水平及其影响因素

3.3.2 常见益生菌的进化关系

3.3.3 菌株安全性及分离来源的影响

3.3.4 菌种富集功能的差异性

3.3.5 常见益生菌的功能互补

3.4 肠道细菌库的构建

3.4.1 肠道细菌的培养与基因组测序

3.4.2 肠道细菌基因组组装与物种注释

3.4.3 肠道细菌基因组聚类与进化树

3.5 肠道细菌库对八大疾病队列中病人缺乏菌的捕获

3.6 肠道可培养细菌基因组数据集对宏基因组分析的促进作用

3.7 肠道细菌库的基因组功能分析

3.7.1 肠道可培养细菌基因组数据集功能特点

3.7.2 代表性肠道可培养细菌的泛基因组分析

4 讨论

4.1 常见益生菌在八大疾病队列肠道菌群中的潜在角色

4.2 常见益生菌泛基因组比较分析

4.3 肠道细菌库的构建

5 结论及展望

5.1 研究的结论

5.2 研究的创新点

5.3 展望

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 博士论文

作者: 罗广文

导师: 霍贵成

关键词: 常见益生菌,八大疾病队列肠道菌群,泛基因组学分析,肠道细菌库

来源: 东北农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 东北农业大学

基金: 国家重点研发计划“益生菌健康功能与基于肠道微生物组学的食品营养代谢机理研究”项目的课题三“益生菌微生态健康调节机制与新型营养健康食品研发”(2017YFD0400303),深圳市政府基金(JCYJ20160229172757249),国家自然基金

分类号: TS201.3

DOI: 10.27010/d.cnki.gdbnu.2019.000012

总页数: 102

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