家蝇几丁质酶MDCht9的表达及功能研究

论文摘要

目的:对MDCht9基因进行序列分析,采用原核表达体系获得纯化的重组蛋白,测定其酶学活性及稳定性;分析MDCht9的时空表达特征,RNA干扰法探讨其在家蝇生长发育过程中的功能。方法:1.MDCht9的生物信息学分析:构建系统进化树,用生物信息学软件分析MDCht9基因编码蛋白的理化性质、二级结构和信号肽等,预测蛋白质的功能;2.重组蛋白的表达及酶活的测定:以pET28a（+）为载体,构建pET28a（+）-MDCht9重组质粒,将重组质粒转化到表达感受态细胞中进行诱导表达,表达产物用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,采用镍柱对表达的蛋白进行纯化,质谱鉴定纯化蛋白。以4MU-（GlcNAc）3寡聚物为底物,荧光分析法测定重组蛋白酶活性及体外酶活性的稳定性。3.时空表达模式分析:使用Real-time PCR技术和Western-blot技术分别从基因水平和蛋白翻译水平,分析MDCht9在卵、各龄期幼虫、蛹、成虫不同发育时期的表达情况;4.RNA干扰探究MDCht9功能:以重组质粒为模板,体外合成dsRNA,通过显微注射法将dsRNA导入家蝇2龄末期幼虫体内,分别在12 h、24 h、48 h和72 h收集幼虫,应用Real-time PCR技术检测MDCht9基因的表达变化,统计化蛹率和羽化率,观察虫体表型变化。结果:1.系统进化树表明MDCht9基因与果蝇Cht9基因同源性最高,MDCht9基因ORF全长1401bp,编码466aa,理论分子量为50827.2Da,等电点为6.97,为亲水性蛋白。MDCht9蛋白具有信号肽,剪切位点在第22与第23位氨基酸之间,具有一个18家族几丁质糖基水解酶的催化域,位点在24-357位氨基酸,还包含一个几丁质结合区域,位点在413-466位氨基酸之间,二级结构及三级结构以无规则卷曲为主（56.87%）,其次为α-螺旋（24%）和β-折叠（19.1%）。2.构建了具有正确序列的MDCht9重组表达质粒;转化到大肠杆菌中获取重组蛋白,通过镍柱纯化的重组蛋白经质谱鉴定,显示MDCht9重组蛋白获取成功。该重组蛋白具有酶活性,比活性为8863U/mg,MDCht9最适pH为9,pH 3-9时稳定性最好;最适温度为45℃,30℃-45℃时热稳定最好;金属离子和有机化合物对MDCht9酶活性均有不同程度的抑制作用,Tris则可增强其酶活性。3.时空表达模式分析:实时荧光定量PCR检测MDCht9在家蝇的不同发育时期,以卵期作为参照,mRNA的相对表达量依次为3龄幼虫>2龄幼虫>1龄时期>雄虫>卵期>雌虫>蛹,在蛹期的表达量第一天与第二天的表达量无差别,表达量依次为第一天>第四天>第三天;在家蝇3龄幼虫的不同组织中,以体壁作为参照,mRNA的相对表达量依次为唾液腺>气管>肠道>脂肪体>马氏管>体壁;Western blot检测MDCht9蛋白在家蝇不同发育时期的表达量为3龄幼虫>1龄幼虫>2龄幼虫,除雄虫时期蛋白表达与核酸水平表达不一致之外,蛋白水平与mRNA水平表达量一致,MDCht9主要幼虫时期表达,表明MDCht9可能参与幼虫时期的蜕皮;在家蝇3龄幼虫各组织中唾液腺表达量最高,表明MDCht9可能具有调控围食膜几丁质含量的作用。4.RNA干扰MDCht9基因,结果显示在注射后24h时达到最佳沉默效果,与阴性对照组相比,家蝇幼虫的存活率下降了23%,羽化率下降了31.8%,畸形率达5%。结论:采用原核表达系统成功获得MDCht9的重组蛋白,重组蛋白有较强的酶活性及稳定性;MDCht9在家蝇各生长发育时期主要在幼虫时期表达,在卵期和蛹期表达量较低;在家蝇3龄幼虫各组织中唾液腺表达量最高;注射dsMDCht9可有效沉默靶基因,相较于阴性对照组,幼虫死亡率增加及羽化率的降低,并出现虫体不能从蛹壳中钻出、翅脉发育不全等畸形现象。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李妍

导师: 国果

关键词: 家蝇,几丁质酶,生物信息学分析,基因克隆,干扰

来源: 贵州医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,生物学,基础医学

单位: 贵州医科大学

基金: 国家自然科学基金

分类号: R384.2;Q78

总页数: 75

文件大小: 3880K

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