导读:本文包含了胞内抗体论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:抗体,肝癌,乳腺癌,层析,噬菌体,基因治疗,心力衰竭。
胞内抗体论文文献综述
仲文[1]（2019）在《靶向CDK4胞内抗体对乳腺癌细胞中NPM1的表达及其活性的影响》一文中研究指出乳腺癌几乎是所有国家女性最常见的癌症,已经成为中国女性中发病率最高的癌症。研究表明,CDK4和Cyclin D1在大约50%的乳腺癌细胞中存在过表达,与乳腺癌的发生发展及预后密切相关,抑制CDK4的活性将有助于乳腺癌的治疗,因此高效特异的靶向CDK4的乳腺癌治疗策略及机制的深入研究具有重要的科学意义。本课题组前期研究中,成功制备了核定位型抗CDK4胞内抗体NLS-AK3,通过体内外研究表明,NLS-AK3能在癌细胞中特异性结合内源的CDK4蛋白,并具有良好的抑瘤效应。通过差异蛋白质组学分析发现,MDA-MB-231叁阴性乳腺癌细胞中抗CDK4胞内抗体NLS-AK3的表达,显着下调NPM1蛋白水平。核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM1)是一种多功能蛋白,在多种肿瘤中均存在过度表达,促进癌细胞的增殖和转移。研究发现,NPM1可以直接结合Rb、FOXM1、NF-κB/p65、STAT3、c-myc等Cyclin D1/CDK4直接下游靶点,影响这些蛋白功能及其参与的细胞活动,促进肿瘤细胞的增殖和转移。为了确定核定位型抗CDK4胞内抗体NLS-AK3对叁阴性乳腺癌细胞中NPM1表达及其相互作用因子的影响,本研究开展了Western blot、实时荧光定量PCR、GST pull down、免疫共沉淀等一系列实验分析,取得如下结果:(1)Western blot和Q-PCR结果表明,在MDA-MB-231细胞中胞内抗体NLS-AK3不仅下调NPM1蛋白水平,而且抑制NPM1的m RNA表达。(2)通过Gene MANIA网站预测CDK4与NPM1可能存在相互作用,之后通过间接免疫荧光实验,GST pull downa分析他们之间的联系。间接免疫荧光实验结果表明CDK4与NPM1在叁阴性乳腺癌细胞的细胞核中共定位。利用亲和层析纯化法纯化GST-NPM1和GST蛋白,通过GST-NPM1对MDA-MB-231细胞核蛋白进行GST pull down分析,结果表明,NPM1与MDA-MB-231细胞中CDK4、Rb、磷酸化Rb、NF-κB/p65存在相互作用。(3)Western blot结果表明,MDA-MB-231细胞中NLS-AK3的表达,不影响Rb总蛋白水平,但降低磷酸化Rb水平,下调细胞核内NF-κB/p65水平。免疫共沉淀实验结果表明,在MDA-MB-231细胞核中胞内抗体NLS-AK3抑制NPM1与CDK4、Rb、磷酸化Rb、NF-κB/p65之间的相互作用。(4)通过Q-PCR检测了NLS-AK3对NF-κB/p65下游基因转录的影响。发现胞内抗体NLS-AK3下调E2F、CCNE1、CDK2、Cyclin A、CDC2、PCNA、c-myc,Bcl-2的m RNA水平,上调Bad的m RNA水平。上述研究结果表明,NLS-AK3可能通过抑制NPM1表达,抑制NPM1与CDK4、磷酸化Rb及NF-κB/p65相互作用,抑制叁阴性乳腺癌细胞增殖。本研究为阐释抗CDK4胞内抗体抑制乳腺癌细胞增殖的分子机制提供了实验依据。(本文来源于《吉林大学》期刊2019-05-01）
王凤兰[2]（2019）在《抗Cyclin D1胞内抗体抑制乳腺癌细胞增殖的分子机制》一文中研究指出乳腺癌已成为全球女性癌症死亡的主要原因之一,严重威胁女性的生命健康。尽管目前临床治疗有了很大改善,但是仍然存在着乳腺癌患者术后易复发、转移及耐药等许多亟待解决的问题。因此探究新型乳腺癌治疗策略并深入探讨其机制的研究具有重要意义。Cyclin D1是细胞周期进程中G1期到S期转换的限速因子,在乳腺癌等多种肿瘤中存在过表达,已成为乳腺癌等肿瘤靶向治疗的重要靶点。实验室前期成功制备了具有较好体内外抑制乳腺癌细胞增殖的内质网滞留型抗Cyclin D1胞内抗体ER-ADκ,但分子机制尚不清楚。前期实验室对抗Cyclin D1胞内抗体表达的乳腺癌细胞与对照细胞进行差异蛋白质组学分析,鉴定了包括PRDX4(Peroxiredoxin 4)和GRP78(Glucose-regulated protein 78)在内的多个差异蛋白点。已有研究显示,PRDX4是ROS(reactive oxygen species)的降解酶,PRDX4的下调会显着提高ROS水平,引起细胞氧化应激,促进细胞凋亡。ROS依赖性内质网应激会提高GRP78的蛋白水平,促进细胞凋亡。为了明确ER-ADκ对PRDX4和GRP78的影响,深入探究抗Cyclin D1胞内抗体在抑制乳腺癌细胞增殖调控中的作用机制,本研究通过Western blot、实时荧光定量PCR、ROS检测、GST pull down等一系列实验分析,取得如下结果:(1)通过Western blot和实时荧光定量PCR实验,检测抗Cyclin D1胞内抗体ER-ADκ在MCF-7细胞的表达对PRDX4的影响,结果显示,ER-ADκ下调MCF-7细胞中PRDX4的蛋白水平,并且ER-ADκ抑制PRDX4的mRNA表达。(2)抗Cyclin D1胞内抗体ER-ADκ在MCF-7细胞的表达对ROS水平及内质网应激的影响实验结果显示,ER-ADκ显著提高MCF-7细胞中ROS水平,提高内质网应激的标志性分子GRP78的mRNA表达水平并且上调GRP78的蛋白水平。(3)通过STRING网站预测GRP78和PRDX4可能存在相互作用,接下来通过间接免疫荧光实验、免疫共沉淀实验及GST Pull down实验分析二者相互作用。间接免疫荧光实验结果表明,在MCF-7细胞中PRDX4与GRP78存在共定位。免疫共沉淀实验结果表明,MCF-7细胞中PRDX4与GRP78存在相互作用。成功表达和纯化了可溶性GST-PRDX4和GST蛋白,对MCF-7细胞蛋白进行GST pull down分析结果表明,PRDX4与MCF-7细胞内GRP78存在相互作用。(4)通过实时荧光定量PCR实验检测胞内抗体ER-ADκ对MCF-7细胞内PRDX4和GRP78下游相关因子转录水平的影响,结果表明,ER-ADκ显著上调CHOP,Caspase-3,p21,Beclin 1和Atg 4的mRNA水平,下调RAD51的mRNA水平。上述研究结果表明,ER-ADκ可能通过抑制PRDX4表达,导致ROS不能正常清除,进而引发内质网应激,GRP78上调,诱导乳腺癌细胞凋亡。本研究为阐释抗Cyclin D1胞内抗体抑制乳腺癌细胞增殖的分子机制提供实验依据,为抗Cyclin D1胞内抗体治疗乳腺癌奠定了基础。(本文来源于《吉林大学》期刊2019-05-01）
苗海鹏[3]（2018）在《靶向COX-2胞内抗体抑制乳腺癌的生长和转移》一文中研究指出乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤,其发病率居女性恶性肿瘤的首位。尽管随着早期诊断和综合治疗(包括外科手术、辅助放化疗、内分泌治疗、免疫治疗以及靶向治疗)的开展,在一定程度上获得了较好的治疗效果,但是由于乳腺癌容易产生耐药和高转移的特点,造成乳腺癌容易愈后复发。因此探究更加安全有效地治疗乳腺癌的策略研究,具有重要的科学意义与现实价值。环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是催化花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)生成前列腺素类物质(PGs)的关键限速酶。多项研究表明,COX-2在乳腺癌细胞中过度表达,参与乳腺癌细胞的细胞增殖与凋亡、免疫抑制、诱导生成各种致癌物质、促进血管生成因子的产生导致乳腺癌细胞迁移浸润等,因此COX-2已成为治疗乳腺癌的一个重要潜在靶点。通过基因工程手段使抗体在细胞内表达的胞内抗体技术,能实现靶向干扰和阻断细胞内抗原蛋白的转录、翻译、加工和修饰等过程。因此,本实验室前期成功构建抗COX-2胞内抗体Intra-OX-1。实验研究发现,该胞内抗体能有效的与肝癌细胞内的COX-2结合,抑制肝癌细胞的生长与增殖,促进肝癌细胞的凋亡,具有良好的抑瘤效应。但其是否能够有效抑制乳腺癌的增殖与迁移,目前尚不清楚。为此,本论文就抗COX-2胞内抗体对乳腺癌细胞增殖和迁移抑制效应开展了相关研究。具体工作如下:通过免疫荧光技术检测到乳腺癌细胞中COX-2的表达,并且发现COX-2主要分布在细胞质;采用细胞转染的方法将含胞内抗体的真核表达载体导入MCF-7乳腺癌细胞中,通过逆转录PCR、免疫印迹实验、间接免疫荧光实验检测到胞内抗体在MCF-7细胞中有效表达,并且发现胞内抗体内质网滞留。通过Co-IP实验,发现胞内抗体能有效与MCF-7细胞中的COX-2特异性结合。通过MTT与集落形成实验,发现胞内抗体能够显着抑制MCF-7细胞的增殖,抑制细胞的集落形成;通过流式凋亡检测发现胞内抗体能明显诱导MCF-7细胞的凋亡。“伤口愈合”实验中胞内抗体明显抑制了MCF-7细胞的迁移;Transwell实验发现,胞内抗体的表达显着抑制了MCF-7细胞的体外侵袭。最后利用实时荧光定量PCR技术,检测稳定表达Intra-OX-1的MCF-7细胞,参与肿瘤发生发展相关基因mRNA的表达变化。结果表明,胞内抗体可以下调EGFR、VEGF、CDK1、CDK2、Bcl-2、c-Met等mRNA的表达,上调p21的转录。本研究为靶向COX-2胞内抗体乳腺癌治疗奠定基础。(本文来源于《吉林大学》期刊2018-06-01）
李天[4]（2018）在《新型心肌靶向AAV9-抗RyR2胞内抗体的心衰防治作用及其机理研究》一文中研究指出目的:构建具有心脏特异性表达的重组腺相关病毒(rAAV9-AR185-EGFP和rAAV9-AR117-EGFP),并制备rAAV9-AR185-EGFP和rAAV9-AR117-EGFP两种病毒制剂,检测在大鼠体内的转染效果。建立大鼠心力衰竭模型,通过腺相关病毒载体携带的胞内抗体改变大鼠心脏中RyR2蛋白的磷酸化水平,研究AR185抗体对大鼠心脏功能和结构的影响,探讨使用胞内抗体治疗心衰的可能性。研究AR185抗体对大鼠单个心肌细胞的钙稳态和收缩功能的保护作用,进一步探讨RyR2蛋白过度磷酸化在心衰病理过程中的作用和影响机制。方法:以课题组前期筛选获得的AR185抗体为目的基因,以重组9型腺相关病毒(rAAV9)为载体,构建相应的rAAV9-AR185-EGFP穿梭质粒。体外转染293T细胞制备病毒制剂,通过尾静脉注射的方式在大鼠体内转染AAV9-AR185-EGFP并检测其体内转染效果。建立动物模型,进行实验分组,将大鼠分成4组。分别是Sham组(n=7),开胸后缝合,尾静脉注射生理盐水;HF组(n=7),进行心梗手术(结扎大鼠心脏冠脉左前降支),尾静脉注射生理盐水;AAV-AR117组(治疗对照组,n=8),心梗手术,尾静脉注射rAAV-AR117-EGFP;AAV-AR185组(治疗组,n=8),心梗手术,尾静脉注射rAAV-AR185-EGFP。手术8周后,使用小动物超声系统检测大鼠心脏功能;检测各组大鼠心重体重比;取大鼠心脏于4%PFA固定液中固定,包埋后切片进行HE染色、Massion染色,比较各组间大鼠心脏显微变化;取大鼠心肌组织左心室部分,完成常规组织样品的制作,使用透射电镜观察并拍摄电镜图像,比较各组间大鼠心肌超微结构变化。使用酶解法急性分离获得独立的大鼠心肌细胞,Fluo5N-AM胞内荧光钙离子探针孵育部分心肌细胞,使用激光扫描共聚焦荧光显微镜系统(laser scanning confocal microscopy,LSCM)检测心肌细胞肌浆网内的荧光强度;Fluo 4-AM胞内荧光钙离子探针孵育部分心肌细胞,使用LSCM系统检测咖啡因诱导的钙瞬变幅度和心肌细胞静息期钙泄漏发生频率;使用IonOptix单细胞收缩检测系统检测电刺激下各组大鼠心肌细胞收缩能力。结果:成功制备AAV9-AR185-EGFP和AAV9-AR117-EGFP病毒制剂。尾静脉注射AAV9-AR185-EGFP病毒制剂四周后,在大鼠心脏组织中观察到明显的绿色荧光蛋白表达,其他器官组织中未检测到明显荧光信号。对各组大鼠心功能指标进行分析,与Sham组(n=7)相比,HF组(n=7)大鼠EF%及FS%均明显降低(EF%:32.49±6.46 VS 80.49±6.40,P<0.01;FS%:16.88±4.25 VS 47.65±4.30,P<0.01);LVEDV和LVESV都明显增大(LVEDV:498.74±62.97 VS 227.10±33.94,P<0.01;LVESV:343.75±43.05 VS 55.97±9.75,P<0.01)。同时,与AAV-AR117组(n=8)相比,AAV-AR185组(n=8)大鼠各项超声指标都有所改善,EF%和FS%明显变高(EF%:60.57±7.60 VS 31.30±6.22,P<0.01;FS%:37.72±3.31 VS 16.66±4.60,P<0.01);LVEDV和LVESV结果变小(LVEDV:432.62±37.02 VS 515.56±59.00,P<0.01;LVESV:187.22±44.06 VS341.63±44.70,P<0.01)。对各组大鼠心肌组织显微及超微结构进行研究可以发现,与Sham组结果相比,HF组大鼠心室腔扩增,前间隔运动幅度减小,手术处心肌组织纤维化现象明显;肌丝排列疏松杂乱,线粒体出现大量损伤。与AAV-AR117组结果相比,AAV-AR185组大鼠心肌组织中肌丝排列基本正常,线粒体状态较好,恶性的心肌重构现象得到明显遏制。对各组大鼠心肌细胞肌浆网钙容量、钙瞬变、钙泄漏以及心肌细胞收缩能力进行分析,HF组大鼠心肌细胞(n=30)肌浆网钙容量较Sham组(n=30)显着降低(Fluo5N-AM:26.7±1.4 VS 49.3±3.1,P<0.01);钙瞬变幅度降低(Fluo4-AM:16.7±1.4VS 34.5±2.5,P<0.01),同时舒张期钙释放发生频率增加(75.5±7.6 VS 3.7±1.6,P<0.01)。此外缩短分数,收缩舒张速度等细胞收缩评价指标的结果都显示来自衰竭心脏的心肌细胞在受到电刺激时收缩能力明显受到损害。与AAV-AR117组(n=30)结果相比,AR185抗体的表达(n=30)可以增加心衰大鼠心肌细胞肌浆网内的钙容量(Fluo5N-AM:42.1±2.2 VS 26.5±1.6,P<0.01);钙瞬变幅度增强(Fluo4-AM:28.6±2.7 VS 16.8±1.2,P<0.01),舒张期钙释放发生频率显着降低(6.8±1.6 VS 73.5±7.3,P<0.01),电刺激时的细胞收缩功能各项指标都有所改善。结论:本实验中构建和制备的rAAV9-AR185及rAAV9-AR117在体内转染效果良好具有心脏特异性,符合开展后续动物实验研究的要求。心衰时RyR2蛋白磷酸化水平明显升高,RyR2蛋白过度磷酸化在心衰的病理过程扮演着重要角色,在心脏整体水平上,AR185抗体改善衰竭心脏的收缩功能,保护心脏结构,减轻不良重构的影响。在细胞水平上,AR185抗体可以一定程度上减少心衰大鼠心肌细胞的钙泄漏现象,维持肌浆网中的钙容量,恢复钙稳态,保护心肌细胞的收缩能力。RyR2蛋白在心衰治疗中是非常有潜力的靶点,胞内抗体技术是一种很有前景的基因治疗方法。(本文来源于《中国人民解放军海军军医大学》期刊2018-05-01）
薛莹[5]（2018）在《靶向CDK4胞内抗体对肝癌的抑制作用》一文中研究指出肝癌特别是肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是在世界范围发病率和致死率都相当高的恶性肿瘤,严重危害人类的生命健康,目前缺少有效的治疗方法。我国一直是肝癌的高发区,同时肝癌的发病率也在逐年递增,因此寻求有效肝癌防治策略的研究具有重要的科学价值和社会意义。细胞周期调节失控是肿瘤细胞恶性增殖的重要原因之一.CDK4是细胞进入增殖阶段首个被活化的周期蛋白依赖性激酶,是细胞周期进程中G1/S期转换的限速因子。CDK4的过度表达发生在多种类型的人类癌症的肿瘤中包括肝细胞癌。胞内抗体是指在细胞内表达并作用于细胞内组分的抗体,能够靶向细胞内特异性抗原,敲除细胞内重要靶蛋白功能,胞内抗体作为一类新分子在抗肿瘤基因治疗中也显示出巨大潜力和应用前景。本课题组前期研究中,利用胞内抗体技术制备了靶向CDK4胞内抗体NLS-AK,并且该胞内抗体有效抑制乳腺癌细胞增殖和迁移,但对肝癌细胞的生长和增殖是否有抑制作用尚不清楚。本研究从细胞水平以及动物水平体内外分析了靶向CDK4胞内抗体NLS-AK对肝癌的抑制效应。通过RT-PCR、Western blot以及间接免疫荧光实验证明抗CDK4胞内抗体在HepG2细胞的表达和定位。免疫共沉淀实验表明了抗CDK4胞内抗体能够与HepG2细胞内源性的CDK4特异性结合。MTT实验表明NLS-AK能够抑制HepG2细胞的生长和增殖,流式细胞分析结果表明,NLS-AK在HepG2细胞内的表达能够引起HepG2细胞周期G1期阻滞,并且能诱导HepG2凋亡。划痕实验表明靶向CDK4胞内抗体NLS-AK的表达能够显着的抑制HepG2细胞的迁移能力。我们建立了肝癌异体移植瘤治疗模型,结果发现,NLS-AK能够有效地抑制裸鼠体内肝癌移植瘤的生长,具有很好的抑制肝癌发展的作用,本研究为靶向CDK4胞内抗体的肝癌临床治疗提供了一定的实验依据。(本文来源于《吉林大学》期刊2018-05-01）
李桂英,赵良中,朱迅,崔安,杨宁[6]（2017）在《胞内抗体肝癌靶向治疗研究》一文中研究指出背景及目的:肝癌是临床最常见的一种恶性肿瘤,严重威胁人类健康,目前尚缺乏有效治疗手段,因此寻求有效肝癌防治策略的研究具有重要的科学意义。COX-2(Cyclooxygenase-2,环氧合酶-2)是催化花生四烯酸转化为前列腺素类物质的限速酶,在肝癌等肿瘤发生、发展、浸润转移等过程中都扮演重要的角色,是肿瘤治疗的一个重要靶点。鉴于当前COX-2抑制剂的副作用,寻找一种选择性强,安全性好的抑制COX-2活性的策略对以COX-2为靶点的抗癌治疗有重要意义。胞内抗体技术通过对抗体分子进行适当修饰,能够高效、特异性失活细胞内重要靶分子的生物学功能,并在肿瘤治疗中具有较好的应用前景。本研究拟制备肿瘤特异性靶向失活COX-2的胞内抗体并探讨其对肝癌的生长抑制作用。方法:通过抗体库筛选获得了抗COX-2人源单链抗体基因,进而制备了肿瘤特异性内质网滞留型的抗COX-2胞内抗体,并通过细胞转染实验、裸鼠荷瘤实验等在体内外探讨胞内抗体对肝癌的生长和转移的影响。结果:可溶性表达、纯化抗COX-2单链抗体后,ELISA、Western blot和免疫共沉淀实验结果表明,制备的抗COX-2人源单链抗体不仅能够特异性结合体外重组人COX-2蛋白,而且也能够特异性结合细胞内源性COX-2蛋白。将制备的内质网滞留型的抗COX-2胞内抗体转染肝癌细胞,免疫荧光、Western blot和免疫共沉淀等实验结果表明该胞内抗体在肝癌细胞内有效表达并特异性结合细胞内的COX-2蛋白,抑制COX-2活性。进一步增殖特性分析表明该胞内抗体的表达有效抑制肝癌细胞的生长和增殖,抑制其集落形成能力,并且显着诱导肝癌细胞的凋亡(P<0.01)。划痕实验和Transwell实验显示,胞内抗体的表达显着抑制肝癌细胞的迁移和浸润能力(P<0.01)。裸鼠荷瘤治疗实验结果表明,胞内抗体治疗后显着抑制裸鼠异体移植瘤体的生长。结论:本研究获得了在体内外能够较好地抑制COX-2活性、抑制肝癌细胞生长和增殖的靶向COX-2的胞内抗体,为以COX-2为靶点的肿瘤诊断和治疗研究和药物研发奠定了基础。(本文来源于《第十二届全国免疫学学术大会摘要汇编》期刊2017-10-26）
胡耀中[7]（2017）在《HIF-1α特异性胞内抗体的筛选及肿瘤细胞内转录抑制活性的研究》一文中研究指出肿瘤的诊断和靶向治疗是临床研究所面临的严峻挑战,单克隆抗体的发现和研究为肿瘤的诊断和靶向治疗提供了新的治疗手段。对于肿瘤治疗,单抗药物具有明确的靶向性,具有起效快、疗效好、副作用小等优点。能克服化疗药物不能有效区分正常细胞和肿瘤细胞、副作用大等缺点。但传统单克隆抗体因其分子量较大,肿瘤组织与血管的渗透与转运受到阻碍,无法作为胞内抗体,或与肿瘤细胞内靶标特异性结合而发挥抗肿瘤作用。此外,因单克隆抗体存在较强的免疫原性,使其在临床应用受到一定程度的限制,这也促进了小型化抗体的研究与发展。新型基因工程抗体,如嵌合抗体、人源化抗体和单域抗体,因其在稳定性、表达产量和抗体亲和力方面的天然缺陷而阻碍了临床的进一步应用。纳米抗体(Nanobodies,Nbs)来源于天然存在于骆驼科动物体内的重链抗体,是目前可以得到的具有完整抗原结合功能的最小抗体分子片段。作为一种小分子抗体片段,纳米抗体具有诸多优点,如较高的组织穿透性,较高的亲和力和水溶性,以及较高的特异性和亲和力。另外由于其小分子特性,使其保持较低的免疫原性,并且易于表达和纯化。因其特殊的物理学和生物学特性,纳米抗体被广泛的应用于肿瘤的诊断与治疗相关的研究。然而,纳米抗体在肿瘤诊断与治疗领域的的研究主要集中于肿瘤胞外靶标,如细胞因子,信号受体以及跨膜蛋白胞外结构域。然而,与肿瘤生长和细胞增殖相关的信号通路与信号传导机制主要发生在细胞内,针对肿瘤胞内抗原的抗体能够更有效的干扰与抑制肿瘤细胞生长与增殖相关的信号通路,从而达到抑制肿瘤生长的目的。此外,针对肿瘤胞内抗原的纳米抗体的开发,也能应用于肿瘤细胞内信号通路的研究从而有助于发现肿瘤发生与生长相关的信号通路和信号因子。因此,肿瘤胞内靶标的研究以及肿瘤胞内抗体的开发对于理解肿瘤的发展和诊断治疗有重要的意义。因肿瘤细胞的快速增殖会消耗大量的氧气,以及肿瘤对周围组织血管的浸润和破坏,从而导致肿瘤细胞中的普遍存在的缺氧状态。肿瘤组织中的乏氧可导致肿瘤细胞侵袭性增强,同时可诱导肿瘤对化放疗产生抗拒。肿瘤细胞的供血、供氧越好,代谢越旺盛,对放射线越敏感;反之,供血、供氧差的细胞对放射线的敏感性较差。肿瘤细胞缺氧会导致乏氧诱导因子-1(HIF-1)的表达水平显着高于正常组织,是肿瘤细胞中一系列基因改变的关键调控因子,起着中枢纽带作用。HIF-1是由氧浓度依赖性调节的HIF-1α亚基和组成性表达的HIF-1β亚基构成的异源二聚体。HIF-1α和β亚基都具有bHLH(basic helix-loop-helix)和PAS(Per-ARNT-Sim)结构,属于bHLH-PAS蛋白超家族。PAS蛋白结构域包括A、B两个亚结构域,是其形成异源二聚体并与DNA结合所必需的结构,是HIF-1发挥转录活性的关键结构域。PAS结构域的删除,甚至在二级结构域的数个氨基酸的突变会导致HIF-1转录活性的显着降低。HIF-1的转录活性主要取决于HIF-1α亚基的表达水平及其活性。在常氧条件下,细胞内HIF-1α极不稳定(半衰期<5 min),在脯氨酰羟化酶(prolyl hydroxylase,PHDs)的作用下,HIF-1αODD区的第402位、第564位的脯氨酸残基被羟基化后可与肿瘤抑制因子(von hippel-lindau,VHL)结合,在肿瘤抑制蛋白(pVHL)协同作用下,经泛素化蛋白酶途径而发生降解。在乏氧条件下,HIF-1α因不能被正常羟基化而不能与pVHL结合而发生降解,使细胞内HIF-1α水平显著增加。HIF-1α与β亚基的二聚化形成具有转录活性的HIF-1因子,从而促进靶向基因的转录激活。迄今为止已经发现的HIF-1相关的靶向基因超过100多种,这些基因的启动子或增强子内含有一个或多个具有5’-TACGTG-3’核苷酸序列的缺氧反应元件(hypoxia response elements,HREs),HIF-1通过与HREs的结合而启动下游靶向基因的转录作用。这些基因表达后参与,如红细胞生成,血管形成,核苷、氨基酸、糖的能量代谢,细胞存活、凋亡和活动以及药物抵抗等生物学效应,以维持组织、细胞在缺氧条件下内环境稳定,以适应缺氧。同时HIF-1及其诱导表达的基因还在生理性缺氧如干细胞微环境、胎盘发育、胚胎发育过程中组织细胞分化,以及多种病理情况如肿瘤的发展、转移中发挥着重要作用。低氧状态下,肿瘤细胞对化疗药物的耐药指数是常氧状态下的数倍,HIF-1的转录活性与多种耐药性相关的蛋白的表达相关,从而降低传统治疗手段的抗肿瘤作用。HIF-1的活性与血管生成相关,也造成肿瘤的发生及恶化。当细胞乏氧时,HIF-1能够促进血管内皮生长因子(VEGF)的转录并增加VEGF mRNA的稳定性,从而增加VEGF的表达。高浓度的VEGF可通过PI3K、MAPK、Ras、PLC等信号传导途径促进肿瘤血管内皮细胞生长,使肿瘤血管生成增加,促进肿瘤细胞的生长和增殖。HIF-1靶基因编码的蛋白中包含诸多与糖酵解及葡萄糖代谢相关的酶,肿瘤细胞处于乏氧条件下,HIF-1可以转录激活与糖酵解作用相关的代谢酶,增加肿瘤细胞摄取及利用葡萄糖代谢的能力,保证了肿瘤细胞生长的能量需求。肿瘤的侵袭和转移与多种酶类和细胞因子的表达及活性有关。HIF-1α可通过诱导多种蛋白酶及细胞因子,如基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinases,MMP)、尿激酶受体(urokinase receptor),上皮型钙粘素(epithelial cadherin,E-cad)与β-链接素(β-catenin),使细胞与基质间之间、细胞与细胞之间的粘附性降低,导致细胞分离、侵袭及其转移。此外,乏氧条件下肿瘤的侵袭转移还与肿瘤细胞趋化因子受体CXCR4有关。HIF-1α可使CXCR4水平增加,不仅促进肿瘤细胞的转移,而且使其定位于特定器官。通过抑制HIF-1α而达到抑制肿瘤生长的作用机理大体上可以分为阻断相关信号转导通路和抑制HIF-1α的表达活性两类。本课题选择HIF-1α亚基的PAS B结构域蛋白为靶向抗原,旨在通过筛选针对PAS B结构域的特异性纳米抗体,并表达为胞内抗体,以期干扰HIF-1α与β亚基的结合,从而降低胞内HIF-1的水平,从而降低HIF-1相关靶基因的转录水平,以达到抑制HIF-1的转录活性的目的。本研究构建了纳米抗体免疫库,并设计与构建了特异性针对胞内抗原靶标(RNA,蛋白质等)的合成库,通过噬菌体展示技术富集筛选了抗原特异性纳米抗体,并对纳米抗体的物理学和生物学性质进行了评价。首先,表达和纯化了重组PAS B结构蛋白rPasB。基于PAS B蛋白的基因序列,并针对大肠杆菌表达载体的密码子偏好进行了密码子优化,然后进行基因序列的人工合成。之后将人工合成的基因克隆入pET21b载体构建了重组表达载体,并将其转化进入BL21(DE3)大肠杆菌表达细胞进行重组蛋白的表达。通过设立不同诱导时间,不同诱导温度及不同IPTG诱导浓度的实验组确定重组蛋白的最优表达条件。rPasB蛋白在BL21(DE3)胞内表达,通过超声细胞破碎将重组蛋白释放。镍离子金属亲和层析色谱用于从裂解液中纯化rPasB蛋白,尺寸排阻色谱用于去除rPasB中的游离咪唑并去除潜在的杂蛋白。rPasB的纯度与正确表达通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹实验进行确证。圆二色谱用于确认rPasB蛋白的二级结构及其热稳定性。纯化得到的rPasB蛋白用于免疫单峰驼。100μg rPasB蛋白通过静脉注射进入单峰驼体内以产生免疫反应,为引起足够的免疫反应免疫注射进行六周,免疫周期结束后收集血液并提取淋巴细胞。总RNA从淋巴细胞中提取并用作模板进行反转录PCR以获得cDNA,在接下来的PCR中以cDNA为模板,以特定引物进行PCR以获得包含重链抗体单域结构的基因集合。将所得到的基因集合通过酶切连接克隆至pMECS噬菌粒载体以构建纳米抗体表达载体,重组载体通过电转化进入TG1细胞构建了纳米抗体免疫库。本研究基于针对胞内抗原的纳米抗体的序列分析,基于纳米抗体BCII10的读码框结构设计了针对胞内抗原的人工合成库。抗体序列通过特定氨基酸的随机合成来制备纳米抗体基因集合。通过酶切连接进入pMECS噬菌粒载体以构建纳米抗体表达载体,重组载体通过电转化进入TG1细胞构建了纳米抗体合成库。免疫库及人工合成库的容量及多样性通过克隆PCR及序列测定进行了确证。通过随机挑取单克隆进行克隆PCR来确定抗体库中正确插入序列的比例。通过序列测定来分析合成库中特定氨基酸的分布并与设计时确认的比例进行比较来确认抗体库的质量。本研究证实了大容量免疫库与合成库的制备,免疫库及合成库的多样性进行了确认。基于纳米抗体免疫库及合成库的成功构建,以rPasB重组蛋白为抗原进行了特异性纳米抗体的富集筛选。通过四轮富集筛选,获得了针对rPasB蛋白的特异性纳米抗体。经过序列分析和酶联免疫吸附实验,确证了特异性纳米抗体的DNA序列和抗原结合能力。从TG1细胞中提取包含特异性纳米抗体DNA序列的pMECS噬菌粒载体,并转化进入大肠杆菌WK6细胞中用于纳米抗体的表达。特异性纳米抗体在WK6细胞周质空间表达,通过渗透压休克提取包含纳米抗体的提取液。镍离子金属亲和层析色谱用于从提取液中纯化抗体蛋白,尺寸排阻色谱用于去除抗体中的游离咪唑并去除潜在的杂蛋白,纳米抗体的纯度通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹实验进行确证。纯化的纳米抗体与rPasB蛋白的结合通过Western blot和ELISA进行了验证。本研究基于HeLa细胞构建了乏氧诱导模型,对特异性纳米抗体与HeLa细胞内天然HIF-1α蛋白的结合活性进行验证。去铁胺(Deferoxamine,DFO)及氯化钴(CoCl_2)能够在常氧状态下通过不同机理干扰HIF-1α蛋白的氧依赖降解,从而升高细胞内HIF-1α水平。DFO是一种铁离子螯合剂,主要与叁价铁离子络合形成复合物。由于其螯合的特性,无论是游离的或者铁蛋白结合的铁离子均能与之络合,形成铁胺复合物。因此,DFO通过与铁离子络合而影响与HIF-1α蛋白降解相关的脯氨酰羟化酶的活性,从而抑制HIF-1α蛋白在常氧条件下的降解。CoCl_2通过多种机理来抑制HIF-1α蛋白在常氧条件下的降解。首先,CoCl_2能够与HIF-1α蛋白降解相关的脯氨酰羟化酶结合,影响其对HIF-1α蛋白的羟基化而抑制常氧状态下的降解,升高胞内HIF-1α水平;其次,CoCl_2还能够与已经羟基化的HIF-1α蛋白结合,从而干扰羟基化HIF-1α蛋白与pVHL的结合而抑制HIF-1α蛋白的降解。本研究对不同浓度的DFO及CoCl_2的蛋白降解抑制作用进行研究,分别用0.1和0.2 mM的DFO及0.2和0.3 mM的CoCl_2诱导HeLa细胞,收集诱导的细胞并冻融提取裂解液,通过Western blot检测诱导后细胞中HIF-1α蛋白的水平,不同条件下HIF-1α蛋白的水平通过Flow cytometry进行确证,并确定最优的诱导条件为0.3 mM CoCl_2。筛选的特异性纳米抗体与天然HIF-1α蛋白的结合通过免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)及Flow cytometry进行研究。0.3 mM CoCl_2过夜诱导HeLa细胞并通过冻融收集细胞裂解液,特异性纳米抗体与裂解液孵育以俘获裂解液中天然HIF-1α蛋白,Protein A/G包被的琼脂糖凝胶载体与鼠抗-HA标签单抗结合以捕获Nb-HIF-1α复合物,通过Western blot以检测筛选的抗体是否可以特异性的俘获天然HIF-1α蛋白。特异性纳米抗体与HIF-1α蛋白的结合通过Flow cytometry进行了验证,并与IP结果相符。基于成功筛选的能够与天然HIF-1α蛋白结合的特异性纳米抗体,构建了能够稳定表达胞内抗体的HeLa细胞株,并对胞内抗体的表达与结合活性进行研究。基于乏氧诱导模型,通过实时定量PCR对特异性纳米抗体的转录抑制活性进行了研究。在筛选的能够与天然HIF-1α蛋白结合的纳米抗体中选择sNb44及Nb747,基于哺乳动物细胞表达质粒pCI-neo构建了胞内抗体表达载体Ib-sNb44及Ib-Nb747。针对大肠杆菌SlyD蛋白的Nb3用作构建胞内表达载体Ib-IRNb3,并作为阴性对照以研究胞内抗体的转录抑制活性。将构建的胞内表达载体转染进入对数生长期的HeLa细胞,G-418用以筛选能够稳定表达胞内抗体的HeLa细胞株。当稳定生长的细胞汇合度达到60%的时候,收集细胞并扩大培养,以获得足够的细胞。胞内抗体的表达通过Western blot进行验证,稳定生长的HeLa细胞通过冻融提取细胞裂解液,并用鼠抗-His标签单抗检测裂解液中胞内抗体的表达。Ni~(2+)藕合的磁珠用以将裂解液中的胞内抗体纯化,并用纯化的胞内抗体进行IP,以验证胞内抗体对天然HIF-1α蛋白的结合活性。Western blot验证了胞内抗体的成功表达,IP实验证实了胞内抗体的结合活性。本研究对胞内抗体的转录抑制活性进行了研究,胞内抗体的转录抑制活性通过实时定量HIF-1相关的靶向基因的表达水平来进行验证。本课题选择了HIF-1相关的靶基因BNIP3,CA9,GAPDH与PGK1作为目标基因与评价指标,B2M,GUSB与ACTB用作内参基因,设计了qRT-PCR所需引物并对引物质量进行验证。基于乏氧诱导模型,构建了用于评价转录抑制活性的细胞模型。通过0.3 mM CoCl_2诱导胞内抗体表达的HeLa细胞株,提取诱导后细胞总RNA并进行qRT-PCR。对诱导后HIF-1相关的靶基因水平进行了定量研究以确证HIF-1α蛋白水平的升高能显著增加靶基因的转录水平。研究结果表明HIF-1α蛋白的胞内水平能显著影响靶基因的转录水平,并将此模型用以评价胞内抗体的转录抑制活性。HIF-1α蛋白的化学抑制剂CAY10585用作阳性对照,本实验证实CAY10585能显着抑制HIF-1α的转录活性,从而降低乏氧诱导模型中HIF-1靶基因的转录水平。从稳定表达胞内抗体的HeLa细胞提取总RNA,并进行qRT-PCR以定量不同实验组中靶基因的转录水平。本课题实验结果证明胞内抗体Ib-sNb44及Ib-Nb747能不同程度的抑制HIF-1的转录活性。本研究筛选了针对E.coli内源性蛋白的特异性纳米抗体。在rPasB蛋白的纯化过程中,E.coli内源性蛋白作为杂蛋白与rPasB同时纯化出来,并随rPasB蛋白注射进入单峰驼体内产生免疫反应。在后续筛选针对rPasB蛋白的特异性纳米抗体的过程中,筛选得到了针对此E.coli内源性蛋白的纳米抗体。经免疫共沉淀捕获此杂蛋白并用质谱进行了鉴定,鉴定结果显示此杂蛋白为E.coli SlyD蛋白。SlyD蛋白作为潜在的杂蛋白被多次报道,因其氨基酸组成序列中包含近10%的组氨酸,对镍离子亲和柱有很高的亲和力,能够与包含His标签的重组蛋白同时纯化而成为潜在的杂蛋白。尤其当重组蛋白与SlyD蛋白分子量相近时,常用的尺寸排阻色谱将难以去除SlyD蛋白,从而对后续研究产生不利影响。基于筛选得到的针对E.coli SlyD蛋白的特异性纳米抗体Nb5,本课题开发了两套方案用于从rPasB重组蛋白中去除SlyD蛋白。在第一套方案中,基于免疫俘获技术利用Nb5从重组蛋白中捕获并去除E.coli SlyD蛋白,从而制备高纯度重组蛋白。纳米抗体Nb5与重组蛋白孵育以俘获重组蛋白中的SlyD蛋白,从而形成Nb5-SlyD复合物,过量Protein A/G包被的琼脂糖凝胶载体与鼠抗-HA单克隆抗体结合用以捕获重组蛋白中的Nb5-SlyD复合物,沉淀后的上清中即包括纯化的重组蛋白。纯化结果通过SDS-PAGE和Western blot进行验证,结果显示Nb5能够高效去除重组蛋白中的SlyD蛋白从而制备高纯度重组蛋白。在第二套方案中,纳米抗体Nb5进行了生物素标记并去除了C-端His标签,表达了生物素化的Nb5(Bi-Nb5)。过量Bi-Nb5与重组蛋白孵育,以俘获重组蛋白中的SlyD蛋白形成Bi-Nb5::SlyD复合物,显着增加复合物的分子大小。利用尺寸排阻色谱将重组蛋白rPasB与Bi-Nb5::SlyD复合物分离,结果显示rPasB能够与复合物完全分离。分离后的rPasB中含有过量的Bi-Nb5,因Bi-Nb5不含有His标签,可以利用镍离子亲和层析将rPasB纯化。实验结果用SDS-PAGE和Western blot分析,证实Bi-Nb5能够有效用于纯化rPasB中的E.coli SlyD蛋白。在第一套纯化方案中,由于鼠抗-HA单克隆抗体与Protein A/G包被的琼脂糖凝胶载体的成本较高,适用于快速制备小量重组蛋白。相反,第二种方案成本较低,Bi-Nb5能够很容易的制备并大量表达,更适用于大批量制备重组蛋白。另外,Nb5可以表达为二价抗体,从而可以进一步增加复合物的分子大小,有利于分离与E.coli SlyD蛋白分子大小相近的重组蛋白。纳米抗体Nb5可以与固相载体进行共价偶联,从而制备亲和吸附载体用于大批量的重组蛋白制备,如CNBr activated Sepharose or agarose,carboxyl-modified microspheres或latex beads。总而言之,本研究制备了大容量驼源纳米抗体免疫库及针对胞内抗原的合成库,筛选了针对HIF-1α亚基的特异性纳米抗体,并对抗体与HIF-1α蛋白的结合作用进行了研究。构建了特异性纳米抗体的胞内表达载体,并转染进入HeLa细胞,筛选了能够稳定表达胞内抗体的细胞株。胞内抗体的表达及结合活性进行了验证。基于HeLa细胞制备了乏氧诱导模型,并针对HIF-1相关靶基因构建了纳米抗体转录抑制活性的评价模型,并对胞内抗体对HIF-1的转录活性的抑制作用进行了评价。本研究筛选了针对E.coli SlyD蛋白的特异性纳米抗体,并基于纳米抗体Nb5开发了两套方案用于纯化重组蛋白中的E.coli SlyD蛋白。针对E.coli SlyD蛋白的特异性纳米抗体的筛选进一步拓展了纳米抗体在蛋白纯化领域的研究与应用。(本文来源于《天津大学》期刊2017-10-01）
薛莹,杨方,廖祥志,赵良中,苗海鹏[8]（2017）在《抗CDK4胞内抗体抑制肝癌细胞生长和增殖》一文中研究指出细胞周期调节失控是肿瘤细胞恶性增殖的重要原因之一。CDK4(cyclin-dependent kinase 4)是细胞进入增殖周期首个被活化的周期蛋白依赖性蛋白激酶,是细胞周期进程中G1/S期转换的限速因子。CDK4通过与细胞周期蛋白Cyclin D结合,磷酸化RB蛋白,释放E2F转录因子,进而促进G1/S期的转换,促进细胞周期的进程。CDK4在肝癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞中存在过度表达和过度活化,是重要的肿瘤治疗靶点。胞内抗体是指在细胞内表达并作用于细胞内组分的抗体,能够靶向细胞内特异性抗原并敲除细胞内重要抗原靶蛋白功能,胞内抗体作为一类新分子在抗肿瘤基因治疗中已显示出巨大潜力和应用前景。本研究在我们前期成功筛选和构建的肿瘤特异性抗CDK4胞内抗体(NLS-AK)的基础上,进一步探讨该胞内抗体对肝癌的抑制效应。利用实验室前期构建的核定位型抗CDK4人源胞内抗体基因(NLS-AK),通过细胞转染、Q-PCR、Western-blot等实验方法对胞内抗体基因及相关基因的表达进行分析;利用流式细胞术、MTT法生长增殖特性分析实验等,分析抗CDK4胞内抗体对HepG2肝癌细胞增殖的影响。裸鼠荷瘤治疗实验分析该胞内抗体的体内抗肿瘤效应。研究结果表明,胞内抗体在HepG2细胞中有效表达,定位于细胞核,且能够与细胞内源CDK4蛋白结合。MTT细胞增殖特性分析实验表明,与对照组细胞相比,抗CDK4胞内抗体的表达明显抑制HepG2细胞的生长和增殖能力。流式细胞分析结果表明,抗CDK4胞内抗体引起HepG2细胞周期G1期阻滞,并且显着诱导细胞凋亡(P<0.01)。裸鼠荷瘤治疗实验结果表明,抗CDK4胞内抗体NLS-AK的表达显着抑制了人肝癌异体移植瘤瘤体的生长,而且与对照组相比,抗CDK4胞内抗体治疗组中肿瘤细胞有局部坏死,而且坏死面积较大,胞质发生浓缩,胞核出现裂解。本项研究结果表明,抗CDK4胞内抗体显着抑制HepG2肝癌细胞的生长和增殖,具有较好的体内外抑瘤效应,该研究为以CDK4为靶点的肝癌治疗提供了重要理论基础和实验依据。(本文来源于《2017第七届泛环渤海生物化学与分子生物学会学术交流会论文集》期刊2017-08-21）
田园,张国利,岳玉环,吴广谋,万忠海[9]（2017）在《高致病性禽流感穿梭胞内抗体的基础研究》一文中研究指出引言高致病性禽流感由A型流感病毒H5N1引起,病势急迫,致死率高。在流感病毒不断耐药的情况下,特异性抗体是应对流感病毒的唯一有效手段。鉴于病毒变异频繁,针对保守抗原组分的抗体药物可作为不同亚型禽流感的抗病毒药物。M1蛋白是流感病毒型特异性蛋白,调控病毒复制、转(本文来源于《中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第九次全国会员代表大会暨第十七次全国学术研讨会论文集》期刊2017-08-20）
吉元刚[10]（2017）在《抗B型肉毒毒素轻链重组穿梭胞内抗体的研究》一文中研究指出肉毒毒素(BoNT)是由肉毒梭菌分泌的一类具有极强致死性外毒素,在国际上被归属为A类生物战剂。主要有A-H八种血清型,其中H型为新型报道的血清型,引起人类中毒的主要是A、B、E 3型为主。尽管肉毒梭菌所产生的神经毒素(A~H)在其免疫学特性、毒力和自然致病动物类型上各不相同,但是它们的结构及生化作用极为相似,毒素从结构上可分为2个相对分子量不同的蛋白分子,即Mr约为50KDa的无毒性血凝素(HA)和Mr约为15KDa的神经毒素活性。后者由多肽链所组成,是在严格意义上所讲的肉毒毒素。产生BoNT的肉毒梭菌生长繁殖所需的条件苛刻,可是产生BoNT所需的条件相对宽松。人类BoNT中毒绝大多数是由于食入或误食含有肉毒梭菌而产生毒素亦或是含有肉毒毒素的食物而引起。从近年流行趋势看,食源性和婴儿肉毒中毒呈逐年降低的态势,而创伤性肉毒中毒呈增多趋势。肉毒毒素由口腔、咽喉等上消化道吸收后进入小肠等消化吸收主要作用神经突触及神经末梢,抑制神经突触间的介质乙酰胆碱(Ach)的释放,使肌肉收缩运动障碍甚至软瘫。本课题以筛选的抗B型肉毒毒素轻链(BoNT/BL)的pIT2-ScFv基因为模板,PCR扩增ScFv基因,插入含有TAT的原核表达载体pET28a-TAT,PCR、双酶切及测序鉴定表明成功构建重组表达载体pET28a-TAT-ScFv,将其转化至感受态E.coliBL21(DE3)细胞中。添加IPTG于30℃诱导表达4 h后分析显示重组蛋白分子量约32kDa,蛋白主要以可溶性形式表达,优化诱导参数(培养基类型、诱导温度和时间)后进行高密度中试发酵。重组蛋白的纯化探索考虑其组氨酸标签与自身单链抗体的性质,将裂菌上清经chelating Sepharose Fast Flow(Cu2+)后,再经HiTrap Protein-A FF亲和层析柱精纯,得到高浓度高纯度的跨膜单链抗体蛋白(TAT-ScFv),检测纯化的TAT-ScFv中内毒素含量为0.1EU/ml,免疫印迹法对ScFv进行鉴定并检测其与BoNT/BL的免疫结合活性,结果显示明显的特异性免疫印迹条带,利用非竞争酶免疫法检测TAT-ScFv和毒素的亲和常数为(1.133±0.273)×106L/mol。制备特异性绿色荧光蛋白(GFP-SNAP25-VAMP),其中特异性添加的突触小泡膜蛋白(VAMP)为BoNT/BL作用底物,通过酶标仪检测荧光强度,判断BoNT/BL和TAT-ScFv活性,体外细胞实验培养小鼠成神经瘤细胞(N2a),通过检测乙酰胆碱(Ach)验证BoNT/BL抑制Ach释放和TAT-ScFv中和BoNT/BL的活性。采用小鼠动物模型试验证实BoNT/BL LD50约为1.627 ug/只,小鼠体内救治实验证实制备的TAT-ScFv对BoNT/BL具有免疫中和活性。(本文来源于《吉林农业大学》期刊2017-06-30）
胞内抗体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
乳腺癌已成为全球女性癌症死亡的主要原因之一,严重威胁女性的生命健康。尽管目前临床治疗有了很大改善,但是仍然存在着乳腺癌患者术后易复发、转移及耐药等许多亟待解决的问题。因此探究新型乳腺癌治疗策略并深入探讨其机制的研究具有重要意义。Cyclin D1是细胞周期进程中G1期到S期转换的限速因子,在乳腺癌等多种肿瘤中存在过表达,已成为乳腺癌等肿瘤靶向治疗的重要靶点。实验室前期成功制备了具有较好体内外抑制乳腺癌细胞增殖的内质网滞留型抗Cyclin D1胞内抗体ER-ADκ,但分子机制尚不清楚。前期实验室对抗Cyclin D1胞内抗体表达的乳腺癌细胞与对照细胞进行差异蛋白质组学分析,鉴定了包括PRDX4(Peroxiredoxin 4)和GRP78(Glucose-regulated protein 78)在内的多个差异蛋白点。已有研究显示,PRDX4是ROS(reactive oxygen species)的降解酶,PRDX4的下调会显着提高ROS水平,引起细胞氧化应激,促进细胞凋亡。ROS依赖性内质网应激会提高GRP78的蛋白水平,促进细胞凋亡。为了明确ER-ADκ对PRDX4和GRP78的影响,深入探究抗Cyclin D1胞内抗体在抑制乳腺癌细胞增殖调控中的作用机制,本研究通过Western blot、实时荧光定量PCR、ROS检测、GST pull down等一系列实验分析,取得如下结果:(1)通过Western blot和实时荧光定量PCR实验,检测抗Cyclin D1胞内抗体ER-ADκ在MCF-7细胞的表达对PRDX4的影响,结果显示,ER-ADκ下调MCF-7细胞中PRDX4的蛋白水平,并且ER-ADκ抑制PRDX4的mRNA表达。(2)抗Cyclin D1胞内抗体ER-ADκ在MCF-7细胞的表达对ROS水平及内质网应激的影响实验结果显示,ER-ADκ显著提高MCF-7细胞中ROS水平,提高内质网应激的标志性分子GRP78的mRNA表达水平并且上调GRP78的蛋白水平。(3)通过STRING网站预测GRP78和PRDX4可能存在相互作用,接下来通过间接免疫荧光实验、免疫共沉淀实验及GST Pull down实验分析二者相互作用。间接免疫荧光实验结果表明,在MCF-7细胞中PRDX4与GRP78存在共定位。免疫共沉淀实验结果表明,MCF-7细胞中PRDX4与GRP78存在相互作用。成功表达和纯化了可溶性GST-PRDX4和GST蛋白,对MCF-7细胞蛋白进行GST pull down分析结果表明,PRDX4与MCF-7细胞内GRP78存在相互作用。(4)通过实时荧光定量PCR实验检测胞内抗体ER-ADκ对MCF-7细胞内PRDX4和GRP78下游相关因子转录水平的影响,结果表明,ER-ADκ显著上调CHOP,Caspase-3,p21,Beclin 1和Atg 4的mRNA水平,下调RAD51的mRNA水平。上述研究结果表明,ER-ADκ可能通过抑制PRDX4表达,导致ROS不能正常清除,进而引发内质网应激,GRP78上调,诱导乳腺癌细胞凋亡。本研究为阐释抗Cyclin D1胞内抗体抑制乳腺癌细胞增殖的分子机制提供实验依据,为抗Cyclin D1胞内抗体治疗乳腺癌奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
胞内抗体论文参考文献
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