华进联[1]2005年在《人类胚胎生殖细胞的分离克隆及生物学特性研究》文中研究表明原始生殖细胞(PGCs)是各级生殖细胞和成熟配子的共同祖先。在体外适宜的培养条件下,PGCs 大量增殖形成与ESCs 高度类似的多能性细胞,称作EG 细胞。目前,小鼠和其他哺乳动物及人类:EG 细胞的分离培养均取得一些重要的进展,但有关人类PGCs 发育分化、体外分离培养体系及影响因素、无血清培养及检测、人类EGCs 的诱导分化特性等尚未见到系统的研究报道,本研究对上述4 个方面展开研究,以期探索出人类胚胎性腺生殖细胞发育分化规律;建立优化的人类EGCs 无血清分离培养体系;检测人类EGCs 的多向分化潜能,并在人类:EGCs 分离培养的基础上,向hEGCs 转染人类心肌α-actin 启动子,以探索人类心肌α-actin 启动子在人类心肌细胞分化中的作用。1 人胚胎性腺生殖细胞发育分化的研究组织学观察人胚胎睾丸和卵巢,Ki67 在10 w 胚胎睾丸表达最强,卵巢则在20 w 强表达。Bcl-2 在11.5 w 胚胎睾丸强表达,而在胚胎卵巢发育中一直表达较弱。在5～12 w 的睾丸,PGCs 强表达AKP、Oct4、SSEA-1;13 w 后,随胎龄增大,Oct4、AKP、SSEAl 表达减少。在5～32 w 的卵巢内,Oct4、AKP、SSEAl 在8 w 内的生殖细胞强表达;但在14 w 以后卵巢,Oct4、AKP、SSEAl 表达逐渐减少。透射电镜观察,早期胚胎的生殖嵴/腺见到大量的PGCs,一般为圆形或椭圆形,细胞核大,核质比高,细胞器较少。在出现性别分化后,雄性可见有间质细胞和支持细胞,细胞器较为丰富。雌性可见较大的卵母细胞和颗粒细胞。2 人类胚胎生殖细胞分离克隆体系的建立5%～15%NBS 均可以满足HEF、MEF 生长,以8%～10%NBS 为宜。对H=EF 的培养, 以}tDMEM 和α-MEM 效果较好。对MEF 的培养,HDMEM 效果最好。MEF、STO、HEF 等制作好的饲养层细胞维持时间不能超过7 d , 一般为5 ～7 d 。研究了流产胎儿对hEGCs 分离克隆的影响,表明7～12 w 最适于hEGCs 分离克隆, 自雄性胎儿分离hEGCs 的成功率明显高于雌性。筛选了几种细胞因子对hEGCs 生长增殖的最佳剂量,表明RA 和Forskolin 的最佳剂量分别为10-6mol/L 和10 u mol/L;LIF 为5 ng/mL:bFGF 为10 ng/mL;TNFa 为25 ng/mL;TGFB 的添加不利于hEGCs 克隆增殖;进一步将各种细胞因子组合能提高hPGCs 克隆增殖率,以此提出hEGCs 的最优培养基为:HDMEM+15%KSR+0.1 mmol/L 2Me +O.1 mmol/L 非必需氨基酸+2 mmol/L 谷氨酰胺+100 u/mL 青霉素+100 u/mL 链霉素,
闫龙[2]2008年在《山羊胚胎干细胞的分离与培养》文中研究表明山羊胚胎干细胞(ESCs)和胚胎生殖细胞(EGCs)是克隆动物、转基因动物、制备生物反应器和组织工程等理想的候选细胞,然而至今没有成功建系的报道。本研究选用关中奶山羊胚胎和胎儿为试验对象,参照小鼠和人ESCs和EGCs建系的方法,系统比较了不同培养条件和传代方法对分离培养山羊ESCs和EGCs的影响,并对得到的细胞进行了一系列的检测和鉴定,主要获得以下结论:1.本试验共超排处理了4只关中奶山羊采胚,共采集胚胎42枚,可用胚39枚,胚胎可用率为92.9%(39/42),其中桑椹胚5枚,囊胚28枚,孵化囊胚6枚,平均每只山羊获得10.05枚胚胎。原代培养时分别采用全胚培养法、酶消化法和免疫外科法处理胚胎,观察不同发育阶段的胚胎在原代培养时使用不同的处理方法对贴壁率和传代培养的影响。发现原代培养时,全胚培养法的贴壁率最高,而囊胚最适合于山羊ESCs的分离培养,最高传至18代。2.试验在传代培养时比较了机械法和酶消化法两种方法对山羊ESCs体外培养的影响,发现早期使用机械法传代有利于ESCs的增殖,而后期使用酶消化法传代有利于抑制ESCs的分化。本试验6代以前使用机械法传代,6代以后采用酶消化法传代,最高将山羊ESCs传至18代。3.试验采用山羊的克隆胚胎和孤雌激活胚胎分离ESCs,发现两种胚胎的贴壁率很低,胚胎细胞增殖较慢,通过比较不同发育阶段胚胎的体外培养结果,发现早期桑椹胚的贴壁率稍高于囊胚,试验将ntESCs和pESCs细胞最高分别传至4代和2代。4.试验对山羊ESCs进行了免疫组织化学染色和RT-PCR检测,表明其表达SSEA-1,SSEA-3,Nanog,Oct4,TERT和CD117。体外诱导分化试验证明山羊ESCs在体外经诱导可分化为心肌细胞,说明所获得的山羊ESCs具有ESCs的特性。5.试验共得到30例山羊胎儿,以胎儿生殖嵴分离培养EGCs。发现以高糖DMEM为培养基,添加15% KSR的无血清培养体系比含15%FBS的培养体系更能维持EGCs的长期传代培养,传代次数较高,但经t检验,二者之间差异不显着(P>0.05)。而传代培养时,机械法最高传至10代,酶消化法最高传至5代,机械法更适合于传代培养,二者差异显着(P<0.05)。6.山羊EGCsAKP染色阳性,Oct4和SSEA-1免疫组化染色阳性,RT-PCR检测显示其表达Nanog,Oct4,TERT基因。体外悬浮培养或延迟传代的山羊EGCs可以自发分化形成类胚体或成纤维样、神经样、脂肪样等细胞类型,表明该细胞具有ESCs的特性。
徐秋勤[3]2014年在《兔类ES细胞的分离培养及定向分化的研究》文中指出本研究采用兔胚胎作为试验对象，从中分离克隆出兔类ES细胞，而且系统地比较了不同的培养条件对兔类ES细胞分离培养的影响，并对其进行了传代培养及鉴定；采用不同浓度的视黄酸（retinoic acid, RA）对分离到的兔类ES细胞向原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）诱导分化效果进行了初步探讨，为兔胚胎干细胞的建系及向原始生殖细胞的体外分化研究奠定了基础。试验主要结果如下：1.探讨超数排卵对兔胚胎体外发育能力的影响，收集自然发情和超数排卵处理配种后4d的胚胎，接种于MEF饲养层上培养，以自然发情交配所得兔囊胚作为对照。结果如下：超数排卵组的胚胎贴壁率、ICM形成率和F1代形成率高于自然发情组，但没有显着差异（P>0.05），兔超数排卵对兔胚胎的体外发育能力没有显着影响。但在干细胞克隆传代方面差异显着（P<0.05）。因此，为保证试验的效率，尤其在严寒和酷热的环境下，兔子自然交配不易成功，对母兔采取超排方式可获得足够的胚胎，但在春秋季节时获得胚胎以自然发情交配为好，其胚胎更适宜分离胚胎干细胞。2.探讨兔胚胎的不同处理对兔胚胎克隆、传代的影响。将自然发情获得的挑破透明带胚、离散胚和未处理胚分别置MEF饲养层上培养。结果显示：挑破透明带法和胚胎分割法较对照组得到的胚胎更容易贴壁和增殖，有显着差异（P<0.05），虽然离散胚组的胚胎贴壁率（85.7%）显着高于挑破透明带组（70.0%）（P<0.05），但挑破透明带组的ICM形成率（53.3%）高于离散胚组（40.0%）（P<0.05），挑破透明带组F1、F2代兔类ES细胞的克隆率分别为34.7%和25.7%，均显着高于其他两组（P<0.05），最高传至30代。因此，挑破透明带有利于提高从兔胚胎中分离胚胎干细胞的效率，能更好的支持兔类ES细胞的培养与增殖。3.探讨不同培养基对兔胚胎克隆和传代的影响。结果显示：胚胎在含15%FBS的培养液中ICM集落形成率以及1~5代类ES细胞传代过程中均显着高于其他两组含15%KSR和7.5%FBS+7.5%KSR的培养液（P<0.05），培养液为高糖-DMEM+2mmol/L L-谷氨酰胺+0.1mmol/Lβ-巯基乙醇+1%NEAA+15%FBS+100IU/mL双抗时改善了兔类ES细胞的体外培养环境，有利于兔类ES细胞集落的形成，能够进行稳定的传代。4.探讨了机械消化传代、胰酶消化传代和“机械+胰酶”消化传代3种不同的传代方法对兔类ES细胞分离培养传代的影响，结果发现“机械+胰酶”消化传代法最有利于兔类ES细胞传代和集落的形成，细胞克隆形态最佳，为理想的ES细胞分离传代方法。5.将分离克隆得到的兔类ES细胞进行鉴定，结果显示，碱性磷酸酶染色和Oct-4、Nanog免疫荧光鉴定兔类ES细胞集落均呈阳性；提取兔类ES细胞集落的RNA，扩增多能性基因Sox2、Nanog和GAPDH经RT-PCR检测，得到了与预期大小一致的目的片段。体外分化形成具有叁个胚层构成的类胚体（embryoid bodies, EBs）。6.探讨不同浓度的RA对兔类ES细胞向原始生殖细胞诱导分化的能力。采用不同浓度RA（0.2μM、2μM、20μM）诱导液和不加RA的培养液对兔类ES细胞进行诱导，用流式细胞仪进行DNA倍体分析，结果显示：0.2μM浓度RA诱导21d经DNA倍体分析单倍体含量达54.4%，诱导效率最高，2μM浓度RA诱导14d经DNA倍体分析单倍体含量达12.6%，而其他浓度在诱导了相同天数则不含单倍体，说明兔类ES细胞可以用RA向原始生殖细胞诱导，0.2μM浓度的RA诱导效率要比其他浓度高，表明RA的较佳浓度为0.2μM。
郭志林[4]2008年在《小鼠、兔和牛胚胎干细胞分离培养及其向神经样细胞的分化》文中研究指明胚胎干细胞能在体外维持未分化状态与正常核型、具有无限增殖能力,注入囊胚可形成嵌合体,可分化为来自叁个胚层的各种细胞类型。ES细胞被广泛应用于生产转基因动物和克隆动物,构建医学动物模型,研究人类基因功能。利用ES细胞可研究真核细胞的基因表达和调控,寻求细胞分化和细胞修复的机制,研究细胞、组织、器官移植。ES细胞的研究应用已成为生命科学的热点之一。目前哺乳动物ES细胞建系仍存在着品种单一、建系效率低等许多问题,严重影响了ES细胞的研究与应用。本研究比较了不同种属、胚龄、取材、分离、传代方法及消化液、培养液对ES细胞分离培养的效果,对影响ES细胞分离建系的各种因素进行了研究,以求完善小鼠、兔、牛ES细胞的建系方法,提高建系效率。建立了一种不经类胚体阶段直接诱导小鼠EG细胞定向分化为神经细胞的方法,为小鼠EG细胞向神经细胞的体外分化研究提供参考。1.采用分离5日龄小鼠胚胎外胚层进行昆明小鼠ES细胞分离培养,与传统分离ICM的方法相比显着提高了昆明小鼠ES细胞的建系效率(12%&3.3%);大鼠心肌细胞条件培养液与添加10ng/mL LIF的ES培养液相比,使分离ICM的胚胎传至F1代的比例显着提高(52%&36%),传至F2代的比例极显着提高(40%&16%);采用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液连续消化法进行ES细胞分离传代,ICM形成ES细胞克隆的比例提高到50%,ICM获得传至第5代的ES细胞的比例提高至20%;昆明小鼠和BALB/C小鼠胚胎用于ES细胞分离时在胚胎贴壁率、ICM贴壁率、F1和F2代ES细胞出现率上无显着差异;用丝裂霉素C处理MEF 1h适合作为ES细胞培养的饲养层,添加10ng/mL LIF的ES培养液能有效抑制昆明小鼠ES细胞的分化。证实用改进的建系方法可有效地建立昆明小鼠ES细胞系。2.从11.5～12.5日龄昆明小鼠胚胎生殖嵴分离培养PGCs,获得了能连续传9～11代的EG细胞系;用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液多次消化生殖嵴,可有效地保持小鼠PGCs的活力;用差速贴壁法、与胎儿成纤维细胞共培养法分离PGCs,获得了较多的PGCs原代克隆,所得的F1代EG细胞集落百分率显着高于穿刺生殖嵴和取胎儿后1/3部位组织(21%、30%&7%、16%);2株EG细胞系传代达到11～13代,在第10代时检测AKP呈阳性,第5代时在体外可分化为多种细胞。3.对兔囊胚进行蛋白酶消化和机械切割分离出ICM,在MEF饲养层培养,提高了ICM的贴壁率(60%),获得了较多的ES细胞集落,而用全胚或离散胚培养不能获得可传代培养的兔类ES细胞集落;应用大鼠心肌细胞条件培养液提高了ICM贴壁率(59%),能有效抑制兔类ES细胞的分化。证实了经胚胎切割分离兔囊胚ICM在MEF饲养层上用大鼠心肌细胞条件培养液培养,能有效地建立兔类ES细胞系。4.从14～18天兔胚胎生殖嵴及其周围组织分离PGCs的过程中,用酶消化液加机械吹打,能获得有增殖能力的兔PGCs;用0.125%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化液进行兔类EG细胞分离与传代,所得到的EG细胞集落多,传代数高于0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA浓度消化液组;采用兔PGCs与同源胎儿组织成纤维细胞共培养适合兔类EG细胞分离培养,将兔类EG细胞克隆与成纤维细胞饲养层一起消化进行传代,获得了能连续传代的兔类EG细胞系。5.对5～13周龄牛胎儿生殖嵴分离PGCs时,用percoll液离心和差速贴壁法纯化PGCs,与穿刺生殖嵴法和酶液消化法相比所得的PGCs集落数无差别,但前者后期培养中EG细胞传代数高于后两种方法(13, 7 & 5, 3);大鼠心肌细胞条件培养液用于牛EG细胞培养时,所得PGCs集落数和EG细胞传代数高于添加LIF的EG细胞培养液组(13&7);牛胎儿成纤维细胞饲养层可支持牛EG细胞的增殖,并能有效抑制分化;冷冻保存不影响牛PGCs和EG细胞的活力;体外分化试验和AKP染色证实了所分离的牛EG细胞具有多能性。证实了对牛PGCs进行纯化后在牛胎儿成纤维细胞饲养层上用大鼠心肌细胞条件培养液进行培养能有效地建立牛EG细胞系。6.用不经过类胚体阶段的诱导分化方法,对小鼠EG细胞在老化饲养层上长期培养使其达到高密度起动了EG细胞的神经分化,获得了较高比例的神经细胞样集落(62.9%(78/124)),用RA进一步进行诱导可产生TH+阳性神经元细胞。经检测EG细胞源神经细胞样集落外层细胞以及从集落中迁出的细长细胞均表达神经前体细胞标志nestin,应用高浓度的RA对神经细胞样克隆诱导,可获得2.3±0.2%的TH+神经元细胞。应用不同浓度的RA对离散后的神经细胞样集落进行诱导,TH+阳性细胞的比例在一定范围内随着RA浓度升高和分化时间的延长而上升;对EG细胞源神经前体细胞进行冷冻保存,解冻后细胞存活率83.2%,继续培养仍具有增殖和分化能力,冷冻不影响EG源神经前体细胞的活力。在不更换饲养层连续增殖达到高密度的情况下培养小鼠EG细胞,建立了一种简单而有效的小鼠EG细胞体外分化为神经细胞的培养体系,能有效产生TH+神经细胞。
任卫青[5]2012年在《昆明小鼠胚胎干细胞分离培养及其向原始生殖细胞诱导分化的研究》文中研究表明目前，已建立的小鼠ES细胞系大多来源于129、C57BL/6J和BALB/C品系的小鼠，昆明小鼠作为我国科研工作中常用的实验动物，其建系的报道较少，因此建立昆明小鼠胚胎干细胞系对我国深入而便利地开展ES细胞以及其它生命科学领域的研究具有重要意义。SC1是一种小分子化学物，可以双重抑制Ras-GAP和ERK1，维持胚胎干细胞未分化状态。另外，近几年，已有多篇关于胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES细胞）在体外诱导条件下分化为原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs），并进一步生成成熟配子的报道，但ES细胞向生殖细胞的诱导效率很低。本研究用昆明小鼠胚胎作为试验对象，比较了不同培养条件对昆明小鼠ES细胞分离培养的影响，研究了小分子化学物（Pluripotin，SC1）对昆明小鼠ES细胞未分化状态的维持作用，并用视黄酸（Retinoic acid，RA）对分离到的ES细胞向PGCs诱导分化进行了初步研究，为昆明小鼠ES细胞建系及向生殖细胞的体外分化研究提供参考。1.利用MTT法检测丝裂霉素C（10μg/mL）处理不同时间后小鼠胎儿成纤维细胞（Mouseembryonic fibroblast, MEF）活力变化情况。结果表明，以3代以内MEF制备饲养层，用浓度为10μg/mL的丝裂霉素C处理2~2.5h，MEF活力最稳定，可以维持小鼠胎儿成纤维细胞7d以上不增殖也不死亡，是制备饲养层的适宜条件。2.将见栓后3.5~4d的胚胎分别接种于密度为1×104、1×105、1×106/mL的饲养层上，比较胚胎在不同密度饲养层上贴壁、内细胞团（Inner cell mass，ICM）集落形成及ES细胞的克隆生长情况。同时，以无血清培养基为基础培养液，研究胚胎发育阶段和培养液中添加不同生长因子对昆明小鼠ES细胞增殖的影响。结果显示，胚胎在密度为1×105/mL的饲养层上，F1代和F2代ES细胞集落出现率均显着高于其他2组(P<0.05)。囊胚的F2代ES细胞克隆出现率显着高于桑葚胚(P<0.05)，培养液中同时添加干细胞因子（Stem cell factor，SCF）和胰岛素的胚胎贴壁率及F1、F2代ES细胞集落出现率显着高于其他2组(P<0.05)。对分离的ES细胞进行形态观察、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）染色，免疫荧光染色检测小鼠ES细胞全能性特异标志物的表达，证实所分离的ES细胞符合小鼠ES的一系列特征。由此认为，发育至囊胚的胚胎在饲养层密度为1×105/mL上，培养液中同时添加胰岛素和SCF适合昆明小鼠ES细胞的分离培养。3.比较了在含血清替代品（Knockout serum replacement，KSR）的高糖DMEM培养液中（H-DMEM）分别添加SC1和白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor，LIF）对昆明小鼠ES细胞未分化状态的维持作用，并探讨了SC1在培养液中的最佳浓度。以MEF为饲养层，以含LIF的无血清胚胎干细胞培养液为对照，分别用浓度为300nM、1μM、3μM的SC1代替LIF对昆明小鼠胚胎进行分离培养。结果显示，胚胎在添加3μmSC1的培养液中ICM集落形成率显着高于对照组（P<0.05），形成的ES集落与对照组形态差异不明显，最高传至第7代，并且在无饲养层条件下可以传至第6代而保持未分化状态。不同浓度SC1培养液中，胚胎在SC1浓度为300nM组的F2代ES细胞集落出现率显着高于1μM和3μM组（P<0.05），所分离的ES细胞AKP染色呈阳性，Oct4、Nanog、Sox2的免疫荧光染色均显阳性，具有ES细胞的特点。这一结果表明无血清培养液中SC1可以替代LIF用于昆明小鼠ES细胞未分化状态的维持，并且可以在无饲养层条件下进行昆明小鼠ES细胞的培养。4.探讨了RA诱导昆明小鼠ES细胞向PGCs分化的能力及适宜浓度。采用悬滴培养法使分离到的第3代ES细胞形成类胚体（Embryonic bodys，EBs），将第3d形成的EBs，接在铺有0.1%明胶的48孔板中，5个EB/孔，分别用浓度为0.2μM、1μM、5μM的RA和不加RA的培养液进行培养。第10d免疫荧光染色的结果表明，浓度为1μM的RA诱导小鼠ES细胞分化为PGCs的效率显着高于其它组（P<0.05），SCP3和VASA的阳性率表达率分别是31.8%和30.4%，均高于其它组，表明RA可以诱导昆明小鼠ES细胞向PGCs分化，最佳浓度为1μM。
王振坤[6]2012年在《大鼠胚胎干细胞系的建立及向神经干细胞分化潜能的研究》文中研究说明大鼠是一种非常有价值的研究病理和药理的模型动物。因此建立一种稳定的大鼠胚胎干细胞(rES)分化体系对于分析rES早期发育、基因功能以及应用于基因打靶制作人类疾病动物模型非常必要。尽管具有生殖系遗传能力的rES细胞系已经被成功建立,维持其自我更新和保持其未分化的状态的各种分子网络已经被很好的揭示,但是,rES细胞向叁胚层分化体系和方法的相关研究甚少。中枢神经系统退行性疾病严重危害着人类的健康,ES细胞有希望为神经系统疾病细胞替代性治疗提供细胞来源。到目前为止,尚无关于自体rES细胞获得神经干细胞(NS)的报道。研究rES细胞的神经分化过程,建立从全能性细胞向神经细胞诱导分化过程,获得具有NS细胞特性的神经前体细胞,不仅为疾病细胞治疗的实验研究提供理论基础,而且为神经系统早期发育的研究提供良好的模型。此研究拟通过建立rES细胞系,对其建立稳定的体外分化体系,进而诱导分化为具有自我更新和多项分化潜能的NS细胞。希望能为大鼠神经系统发育过程的研究平台,药理检测及神经疾病模型的建立提供理论依据。经过研究得到以下实验结果：1)本研究取孕E14.5DA大鼠胚胎脑组织细胞,在体外无血清条件下(N2B27添加bFGF和mEGF生长因子)进行培养,获取可以以单层贴壁细胞和悬浮神经球的状态进行传代培养rNS。细胞免疫荧光检测结果显示NS细胞表面标志Nestin、Olig2、Pax6、呈阳性；大部分rNS表达MKi-67,证明rNS处于增殖旺盛的状态。神经元祖细胞的表面标志Dcx的表达率为0.8%,初步说明其有能够向神经元分化的潜能。2)利用rNS细胞分化培养基对rNS进行体外分化,10d左右,细胞免疫荧光结果显示叁种神经细胞系的表面标志Tuj1、GFAP和04的表达为阳性,说明rNS细胞能够分化为神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞。对其进一步进行分化,进行细胞免疫荧光检测发现神经元亚型标志物MAP2、GABA和ChAT表达为阳性,说明此rNS细胞具有向不同神经元亚型分化的能力。综合以上两点初步确定我们从大鼠脑组织分离培养的细胞为NS细胞。3)利用2i体系的rES细胞培养基进行培养,获得10个稳定传代的rES细胞系,共培养了30代,没有观察到明显的分化迹象。对DA5-3rES细胞进行了碱性磷酸酶染色(APStaining)发现为AP呈阳性,RT-PCR检测进一步发现DA5-3rES表达Oct4、Sox2、Nanog、Rex-1、fgf4和Eras多能性基因。细胞免疫荧光染色结果表明DA5-3rES细胞表达Oct4、Sox2和SSEA-1多能性因子,核型分析结果显示,有超过75%的细胞染色体条数为42,说明这株DA5-3rES细胞具有自我更新和多向分化的潜能且核型正常。4)rES在正常含有10%血清(DM)的EB培养基条件下,大部分rES细胞发生凋亡或者坏死,只能形成少数EB(38.37±4.4%)；利用阶段性去除2i的诱导方式,rES在rEFM,CM+2i,及CM的培养条件下顺次分别培养2d,2d,1d,能够形成形态均一,质量良好的EB,说明此rEB诱导体系稳定可行。5)利用RT-PCR技术检测rEB体外分化的基因表达情况, rEB表达外、中、内叁胚层的表面标志基因Nestin、Sox17、Afp、Flk和Gata6; rEB贴壁分化的过程中,第6-15d,能够分化为呈规律性搏动的心肌细胞。由此初步确定rEB具有向叁胚层体外分化的能力。6)利用N2B27培养基对rEB进行体外神经干细胞的分化,在诱导第11d左右形成神经管上皮细胞,挑取克隆进行贴壁培养,形成rNS细胞,细胞免疫荧光结果显示Nestin、 Olig2、Pax6、Sox2呈阳性,大部分rNS细胞表达MKi-67证明rNS细胞处于增殖旺盛的状态。神经元祖细胞的表面标志Dcx的表达率为0.6%,初步说明其有能够向神经元分化的潜能。7)通过使用rNS细胞分化培养基对rNS进行体外分化,10d左右,细胞免疫荧光检测结果显示叁种神经细胞系的表面标志Tuj1、GFAP和04的表达为阳性,说明rNS能够分化为神经元,星形胶质细胞和少突胶质细胞。对其进一步进行分化,检测发现神经元亚型标志物MAP2、TH和GABA表达为阳性,说明此rNS具有向不同神经元亚型分化的能力。综合以上,DA5-3rES体外分化为神经干细胞体系的建立具有可行性和有效性。
马岚[7]2002年在《猕猴胚胎干细胞的分离、鉴定、培养及应用研究》文中研究表明本论文以猕猴胚胎干细胞为主要研究对象,在猕猴胚胎干细胞的分离、培养及鉴定方面、猕猴胚胎干细胞体外持续培养体系的建立及优化方面、应用猕猴胚胎干细胞为细胞模型研究LIF对介导胚胎着床的滋养层细胞分化的影响效应方面、以及应用猕猴胚胎干细胞为细胞模型研究叁种光敏药物的光敏毒性以及光敏生物活性方面进行了研究。研究主要获得了以下结果:1、通过猕猴卵母细胞体外成熟培养、体外受精和早期胚胎体外培养技术,由4只超排的成年猕猴中共取得92个处于GV期的猕猴卵母细胞,选取其中的22个于HECM-10培养体系培养后,获得了6个高质量的猕猴囊胚,由此自然孵出的囊胚中分离得到6个内细胞团,并由此最终获得1株具有高核仁/胞质比,具有明显的核仁,集落边界清楚,其内的细胞明晰的,具有胚胎干细胞特征的猕猴类ES细胞——RS5细胞。经5个月的连续传代后,RS5细胞仍保持了正常二倍体的核型,其染色体数目与正常猕猴的一样,均为42条。碱性磷酸酶组织化学染色,结果表明为阳性,说明此细胞为未分化态的原始类胚胎干细胞。由胚胎干细胞多能性分化的初步研究结果来看,在高密度和解除抑止的状态下,此RS5细胞是能进一步发展为多种分化细胞的。2、建立了猕猴胚胎干细胞RS366.4体外持续培养、扩增及冻存培养体系。3、白血病抑制因子(LIF)在胚胎着床中起着重要作用??LIF可通过参与人滋养层细胞分化而介导胚泡着床。已有的关于LIF与滋养层细胞分化间关系的研究结果是相互矛盾的。为避免由早期胚胎标本或胎盘来源的细胞滋养层细胞模型的不足,本实验选用由猕猴RS366.4 ES细胞来源的早期分化滋养层细胞为模型进行研究。细胞流式仪结果表明低浓度的LIF可促进绒毛合胞体滋养层的分化,高浓度的LIF可促进绒毛外侵入性滋养层细胞的分化。细胞免疫组化结果则显示经LIF处理后,侵入性绒毛滋养层细胞的标志物之一?? Fibronectin呈阳性。4、北醌化合物为性能优良的光敏剂。本研究首次以R366.4 ES细胞为模型,测试了EA的光敏毒性,并首次报道了EA的光敏生物活性。经不同光照时间处理后,低浓度的光敏化的EA对R366.4细胞均无细胞毒性作用。在此浓度范围内,对于Hce-8693细胞,EA,HA及HB则均以浓度依赖的方式引起其细胞凋亡,其光敏抑制效应顺序为HA > EA > HB。对于B16细胞,EA也以浓度依赖的方式引起其细胞凋亡。这些结果表明EA、HA及HB均有较显着的光敏抑癌生物活性。
杨继建[8]2005年在《山羊胚胎干细胞的分离与克隆》文中认为本研究以山羊为材料,对影响山羊ES 细胞、EG 细胞分离与克隆的影响因素进行了探讨。为进一步建立山羊ES、EG 细胞系奠定了基础。实验主要结果如下:1. 收集妊娠20~55d 山羊胎儿50 例,使用DMEM(高糖)+ 15% NBS(或FBS) +10 ng/mL+ 0.1 mmol/mL?-巯基乙醇+ 2 mmol/mL 谷氨酰胺+ 0.01 mmol/mL 非必需氨基酸+ 100 IU/mL青霉素+ 100 IU/ml链霉素培养液从生殖嵴(腺)中分离克隆山羊EG细胞,43 例出现EG 样细胞集落,最高一例传至6 代。胎龄为30～36 d山羊胎儿最适合山羊EG 细胞分离与克隆,胎龄大于42d,很难得到山羊EG 细胞。从新生关中奶山羊睾丸中分离培养出山羊睾丸支持细胞。对比分离得到的PGCs在饲养层GSCs、MEF、GEF 上的生长效果,发现GSCs>MEF>GEF。在基础培养液中添加10%(1000IU/ml)LIF更有利于山羊EG 的克隆。2. 用全胚法从192 枚关山羊胚胎中分离得到82 枚增殖ICM,接种在MEF 或GEF饲养层上,使用DMEM(高糖)+ 15% FBS + 0.1 mM?-巯基乙醇+ 0.01 mM 非必需氨基酸+ 10 ng/ml LIF + 100 IU/mL 青霉素+ 100 IU/ml 链霉素培养液,用中浓度消化液(0.125% Trypsin+0.02% EDTA)消化效果好,有一枚胚胎传至第8 代。3. MEF、GEF 在山羊胚胎贴壁率无显着差异(P>0.05);MEF 和GEF 饲养层均能促进山羊ES 细胞体外增殖。随着胚龄的增加,胚胎的贴壁率和ICM 的增殖率增加。孵化囊胚的贴壁率和增殖率最高,达90%和60%,与桑椹胚相比,差异均显着(P<0.05);添加LIF(10 ng/ml)有利于山羊ES 细胞(P<0.05)的分离与克隆。4. 山羊ES 细胞对胰酶不是很敏感, 0.125% Trypsin+0.02% EDTA 是较好的ES 细胞消化液,对细胞综合损伤力小,且传代后ES 细胞集落形成能力也较高。6. 分离得到的山羊ES 细胞、EG 细胞,经形态学观察、AKP 染色、SSEA、OCT4染色、体外分化实验等,证明其具有胚胎干细胞的诸多特性。
刘雨潇[9]2005年在《昆白小鼠胚胎干细胞分离克隆及向心肌细胞定向诱导分化的研究》文中研究说明本研究从昆白小鼠胚胎中分离克隆出小鼠ES 细胞,并对其进行了传代培养和鉴定;并以ES-D3 为材料,采用不同的诱导物将小鼠胚胎干细胞向心肌细胞定向诱导分化。对影响小鼠ES 细胞分离与克隆及向心肌细胞定向诱导分化的的影响因素进行了探讨,为进一步建立昆白小鼠ES 细胞系及建立稳定的心肌细胞诱导体系奠定了基础。实验主要结果如下: 1. 从1678 枚昆白小鼠胚胎中分离培养ES 细胞,ICM 形成率为70%(1167/1678),有3 株传至第8 代。 2. 分别比较了桑椹胚,早期囊胚,扩张囊胚,孵化囊胚的贴壁率,生长行为和原代集落出现个数。结果表明孵化囊胚是最理想的ICM 分离材料。 3. 分别比较了全胚法,免疫外科法,酸处理法,酶消化对ES 细胞分离克隆的影响。发现利用全胚法培养孵化囊胚,是一种可行的ICM 分离方法,该方法操作简单,且能很好的保持ICM 的活力,利于传代。 4. MEF、STO、 HEF 及Sertoli 在小鼠胚胎贴壁率无显着差异(P>0.05);但在原代集落出现率及传代率上4 者有明显差异。MEF 最好,Sertoli 和STO 次之,HEF 效果最差。 5. 不同培养液对小鼠胚胎贴壁率及ICM 集落形成率无明显影响, ES 细胞培养液在ES 细胞分离传代上明显好于大鼠心肌细胞及肝脏细胞条件培养基(P<0.05);大鼠心肌及肝脏条件培养基可用于小鼠ES 细胞分离培养; LIF 对昆白小鼠ES 细胞的分离与克隆具有至关重要的作用。 6. 0.1% 胶原酶是较好的ES 细胞消化液,对细胞损伤力小,且传代后ES 细胞集落形成能力也较高(P<0.05)。0.25%胰酶+1%鸡血清与0.05%胰酶+0.008% EDTA 也可用于ES细胞传代; 0.25%胰酶+0.04% EDTA 对ES 细胞的损伤较大,不适于小鼠ES 细胞的分离与克隆。 7.分离得到的小鼠ES 细胞, AKP 染色阳性。Oct-4,SSEA-1 染色阳性。体外可自发分化为上皮样、神经样、成纤维样、表明提外培养的ES 细胞具有多能性。8.比较了小鼠ES 细胞在不同条件下分化为心肌的效率。结果表明单独使用5-氮胞苷或联合使用二甲基亚砜(DMSO)与维甲酸(RA)诱导均可促进ES 细胞分化为心肌细胞。其中5-氮胞苷的最佳浓度为15μmol/L,RA 的浓度为10-8～10-9mol/L。
郭箭[10]2003年在《胚胎干细胞的分离培养及定向分化研究》文中研究指明自1981年首个胚胎干细胞建系以来，世界各国的科学家纷纷投身到该研究领域。1998年，美国的两个科学家小组分别从人体外受精发育而成的囊胚内细胞团和5～9周龄流产的胚胎原始生殖嵴中，成功获得了人类胚胎干细胞系和人类生殖嵴干细胞系。干细胞的发现为研究细胞分化、动物发育、建立相关研究模型、阐明基因功能等开辟了广阔的空间。本实验也在人类胚胎生殖嵴干细胞、小鼠胚胎干细胞的分离培养，以及小鼠胚胎干细胞的定向分化等方面进行了研究。 实验一是有关人类胚胎生殖嵴干细胞的分离培养。从4—8周的流产胎儿的原始生殖嵴部位分离到原始生殖细胞，经过机械和化学方法的解离后培养于事先用丝裂霉素处理过的小鼠胚胎成纤维细胞或人胚胎成纤维细胞饲养层上，培养基中添加了LIF，bFGEF，Foskolin等细胞因子，此后大约每7天左右传代一次。在实验中，几个适龄的胚胎的原代培养物中都出现了鸟巢状的EG细胞集落，维持时间最长的一个胚胎细胞株在传代培养了9代之后仍然可以观察到EG细胞集落。碱性磷酸酶(AKP)活性检测结果证实了这些细胞集落确实具有原始生殖嵴干细胞的特性。 实验二是关于小鼠胚胎干细胞的分离培养。从怀孕3.5天的小鼠子宫中取出发育至囊胚期的受精卵，培养于事先用丝裂霉素处理过的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上。囊胚一般在48小时后贴壁并脱去透明带，由囊胚中的内细胞团增殖形成一个胚胎干细胞球，待其生长至一定程度后对其进行酶解传代，在传代后的细胞中重新生成ES集落形态的细胞集落，在集落生长至一定程度后再进行传代，此后大约每5—7天传代一次。其间对此类细胞集落的AKP检测证实了其胚胎干细胞特性。本实验中的小鼠胚胎ES细胞再传至第九代后逐渐消失。 实验叁首先建立了一个小鼠胚胎干细胞定向分化成心肌细胞的实验平台，然后采用了3种心肌疾病相关的药物：黄芑生脉饮、1，6二磷酸果糖和HG(代号)，在此定向分化的实验平台上进行了一系列浓度的药物筛选，实验采用视黄酸和DMSO的混合诱导剂作为阳性对照。其中药物HG在适当的浓度下对胚胎干细胞定向发育成心肌细胞表现出强烈的诱导作用(43.3％)。
参考文献：
[1]. 人类胚胎生殖细胞的分离克隆及生物学特性研究[D]. 华进联. 西北农林科技大学. 2005
[2]. 山羊胚胎干细胞的分离与培养[D]. 闫龙. 西北农林科技大学. 2008
[3]. 兔类ES细胞的分离培养及定向分化的研究[D]. 徐秋勤. 河南农业大学. 2014
[4]. 小鼠、兔和牛胚胎干细胞分离培养及其向神经样细胞的分化[D]. 郭志林. 西北农林科技大学. 2008
[5]. 昆明小鼠胚胎干细胞分离培养及其向原始生殖细胞诱导分化的研究[D]. 任卫青. 河南农业大学. 2012
[6]. 大鼠胚胎干细胞系的建立及向神经干细胞分化潜能的研究[D]. 王振坤. 东北农业大学. 2012
[7]. 猕猴胚胎干细胞的分离、鉴定、培养及应用研究[D]. 马岚. 中国科学院研究生院（昆明动物研究所）. 2002
[8]. 山羊胚胎干细胞的分离与克隆[D]. 杨继建. 西北农林科技大学. 2005
[9]. 昆白小鼠胚胎干细胞分离克隆及向心肌细胞定向诱导分化的研究[D]. 刘雨潇. 西北农林科技大学. 2005
[10]. 胚胎干细胞的分离培养及定向分化研究[D]. 郭箭. 浙江大学. 2003
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