论文摘要
细胞凋亡是细胞程序性死亡。Bcl-2家族蛋白作为内源凋亡的关键蛋白在内源凋亡途径中发挥重要功能。Bcl-2家族蛋白中的抗凋亡蛋白通过BH3结构域（motif）与促凋亡蛋白相互作用,阻止促凋亡蛋白改变线粒体外膜的通透性（MOMP）引发细胞凋亡,从而导致癌症的发生与发展。诸多研究表明除16个经典的Bcl-2家族蛋白以外,生物体中还存在许多未知的含BH3沟槽的BH3受体蛋白,能够与BH3 motif相互作用从而影响凋亡的发生。发现这些蛋白并揭示它们与其所在通路调控凋亡的新机制将为抗肿瘤治疗提供新的癌症靶标,为精准治疗提供依据。然而BH3结构域介导的蛋白-蛋白相互作用通常具有结合力弱、结合瞬时发生、可逆等特点,传统的生物学手段例如免疫共沉淀难以发现新的BH3受体蛋白。近年来化学蛋白质组学技术快速发展,其中应用最广泛的是基于活性的小分子探针技术（activity-based probes,ABPs）。ABPs技术的核心是设计一个能与蛋白质活性氨基酸残基发生共价反应的活性分子探针。该探针以小分子蛋白抑制剂为结构核心,在保留对靶点蛋白的抑制能力的基础上,通过光交联反应实现细胞内原位识别-捕获抑制剂靶蛋白的功能。ABPs能够在在蛋白质组水平捕获瞬时作用的、亲和力弱的PPI靶标,适用于寻找新的BH3受体蛋白。Bcl-2蛋白抑制剂,即BH3功能模拟分子,通过模拟BH3 motif的功能,占据靶蛋白的BH3沟槽诱导凋亡。因此通过Bcl-2抑制剂构建的ABPs是捕获新BH3受体蛋白的最佳工具。本论文将已经获得的一系列Bcl-2抑制剂S1衍生物,连接“click chemistry”基团和光交联反应基团,从而构建了一个ABPs的分子库。在多种肿瘤细胞中筛选干预凋亡表型的活性探针分子,在蛋白质组水平原位捕获到新的BH3受体蛋白——Hsp70,发现和证明了Hsp70与BH3-only蛋白Bim二聚体的新功能,揭示了Hsp70/Bim二聚体在调控肿瘤细胞凋亡中发挥重要作用。在CML、AML等多种白血病细胞系和乳腺癌、宫颈癌等实体瘤细胞系中,对10个S1衍生物的ABPs进行基于凋亡诱导活性的筛选,发现S1b-probe能够以10倍的选择性高效诱导CML细胞凋亡（IC50=12μM,CML细胞;IC50=1020μM,U937等其它细胞）。在细胞中加入S1b-probe,光交联后,利用链霉亲和素连接的珠子富集S1b-probe结合的靶蛋白,经LC-MS/MS鉴定捕捉到的蛋白是HSP70。Hsp70干扰RNA实验进一步证明Hsp70是S1b诱导凋亡的靶点。通过体外蛋白质的FP检测和ITC实验,测的Hsp70与BH3肽段在体外以Kd=51-116 n M的亲和力相互作用;利用免疫共沉淀实验（Co-IP）,在多个CML细胞系中证明了Hsp70与Bim二聚体的存在,BH3肽段竞争的Co-IP实验证实Hsp70与Bim之间的相互作用是通过Bim的BH3 motif介导发生。进一步蛋白二维核磁证明Bim的BH3结构域结合在Hsp70蛋白的核苷酸结合结构域;结合免疫共沉淀等细胞生物学实验最终首次证明了Hsp70是一类新的BH3受体蛋白。同时,Bim作为Hsp70辅助伴侣蛋白的功能第一次被发现,体外纯化的Hsp70的胰酶蛋白水解、单转换ATP酶催化速率测定等实验证明了Bim能促进Hsp70蛋白的ATP酶活性。;在CML细胞系中利用干扰RNA技术敲低Bim后,抗Hsp70抗体免疫沉淀下的Hsp70的ATP酶活降低,说明了Bim是正向调控Hsp70功能的辅助分子伴侣。进一步在Bim敲低的CML细胞系中,我们证明了促进肿瘤生存的Hsp70底物蛋白AKT和Raf水平下调,说明Hsp70/Bim二聚体通过提高肿瘤促癌蛋白的稳定性来发挥抗凋亡功能。综上所述,本研究利用ABPs等方法首次发现了Hsp70是一类新的BH3受体蛋白,明确了Hsp70与Bim的结合模式、揭示了Bim作为Hsp70的辅伴侣蛋白参与调控蛋白折叠以及Hsp70/Bim复合物抗凋亡的分子机制。为肿瘤研究提供了新的靶点和机制。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 刘朋
导师: 宋婷
关键词: 家族蛋白,受体蛋白,功能模拟分子
来源: 大连理工大学
年度: 2019
分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑
专业: 生物学,化学
单位: 大连理工大学
分类号: Q25;O621.25
DOI: 10.26991/d.cnki.gdllu.2019.001161
总页数: 64
文件大小: 2607K
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