利用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除奶山羊胎儿成纤维细胞SCD1基因

论文摘要

硬脂酰辅酶A去饱和酶1（Stearoyl-CoA desaturase-1,SCD1）是一种存在于内质网的内膜蛋白,在合成单不饱和脂肪酸（MUFA）棕榈油酸和油酸的过程中具有重要作用,同时机体中SCD1还能催化生成共轭亚油酸（CLA）。MUFA和CLA具有调控人体血液中胆固醇含量、防止心血管疾病以及提升免疫力等作用,其中CLA还可以有效抑制肿瘤生长。第三代基因编辑技术,CRISPR/Cas9系统因操作简单、高效、成本低等优势,使其应用于转基因动物平台来生产动物模型,研究人类疾病或改良家畜品种及其衍生产品营养价值,已成为研究热点。本研究利用CRISPR/Cas9系统在奶山羊胎儿成纤维细胞SCD1基因第4外显子和第6外显子区域设计并筛选出能够高效切割的sgRNA,来验证该基因编辑技术是否可以应用于奶山羊,以期为以后在该动物敲入外源性基因奠定理论基础;同时通过双载体共转染的方法来制备敲除SCD1基因的奶山羊胎儿成纤维细胞,为生产动物模型提供生物材料,以期后续研究单不饱和脂肪酸和共轭亚油酸的功能特征提供动物模型。研究取得以下结果:1、敲除载体的构建:根据“20N+NGG”原则在SCD1第4外显子和第6外显子设计6个靶向SCD1基因的sgRNA（F1、F2、F3、S1、S2、S3）,添加酶切位点送生物公司合成,经程序性退火后连接于PX330-eGFP载体。测序结果表明成功构建6个敲除载体。2、sgRNA切割效率的筛选:将各敲除载体采用脂质体法分别转染进奶山羊胎儿成纤维细胞,48 h后经流式细胞仪分选荧光细胞,提取细胞基因组并扩增靶位点序列,通过T7EI酶切和TA克隆菌落测序评估不同sgRNA的切割效率。结果表明sgRNA F2、sgRNA F3、sgRNA S1和sgRNA S2具有切割效率,分别为41.67%、30.77%、6.67%和28.57%。3、敲除SCD1基因奶山羊胎儿成纤维细胞的制备:使用双载体共转染奶山羊胎儿成纤维细胞,转染48 h后使用流式细胞仪分选荧光细胞并继续培养,待细胞生长到一定密度后提取细胞总RNA和总蛋白进行验证。实时荧光定量PCR结果表明,sgRNA-F2-S2与sgRNA-F3-S2转染组均能显著降低阳性细胞中SCD1在mRNA水平上的表达,蛋白质免疫印迹分析结果表明,SCD1蛋白在阳性细胞中均不表达,最终获得两株敲除SCD1基因的奶山羊胎儿成纤维细胞。

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 刘雷雷

导师: 张勇

关键词: 系统,奶山羊胎儿成纤维细胞,敲除,硬脂酰辅酶去饱和酶

来源: 甘肃农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,畜牧与动物医学

单位: 甘肃农业大学

基金: 兰州市科技局创新人才重点项目(2015-RC-7)“奶山羊乳腺生物反应器的构建”

分类号: Q78;S827

DOI: 10.27025/d.cnki.ggsnu.2019.000066

总页数: 77

文件大小: 3980K

下载量: 141

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