王健[1]2005年在《胚泡与子宫内膜着床相关基因的筛选及其功能的研究》文中研究表明胚胎着床(又称胚胎植入)是哺乳动物和人类生殖生理特有的一个环节，也是关系到妊娠成功与否的关键步骤。着床的顺利进行有赖于胚胎和子宫内膜的同步发育，即胚胎发育至胚泡阶段并完成孵化过程，同时子宫也处于接受状态，从而使得活化状态的胚泡能在“着床窗口”极其有限的开放时间内，及时与处于接受状态的子宫内膜建立紧密联系。这一显得非常精致的协同发育过程受到来源于胚胎和母体子宫内膜双方的各种激素、生长因子、细胞因子、蛋白酶等激素类分子和非激素类分子的调控，但其确切的分子机制仍不是十分清楚。为了寻找新的与胚胎着床相关的非激素类分子，以更深入地了解胚胎着床的分子机制，并探寻进行生殖调控的新环节，本实验室以小鼠为动物模型，分别收集了着床当日(孕D5天)小鼠着床部位和非着床部位子宫组织，以及着床前(孕D4天)和着床当日(孕D5天)小鼠胚泡，然后分别应用cDNA差减杂交和DD-RT-PCR技术，筛选得到许多在小鼠胚泡着床当日(孕D5天)的着床部位和非着床部位之间，或着床前后的胚泡之间存在特异性表达差异的基因的EST片段。但因人力、物力的限制，我们仅对其中很小一部分EST进行了测序分析，鉴别到5个新的着床相关基因，并在克隆获得这些基因的全长cDNA后在GenBank进行了登录，它们分别是：E4BP4(AY061760)、RGS2(AF432916)、ISP2(AF442819)、EMO-1(AY238936)和EMO-2(AY372183)。经GenBank Blast分析和相关文献查询发现，E4BP4是一种受IL-3调节的细胞核转录因子，但未发现该基因与胚胎着床相关的研究报道；RGS2参与G蛋白信号转导途径的调节，与细胞内钙离子浓度的调节以及T细胞增殖有关，其在着床中的作用未见有报道；ISP2是最近新发现的一种子宫组织特异基因，其表达受孕激素调节，并在胚胎着床期间呈特异性高表达，但其在胚胎着床中的作用尚有待于阐明；EMO-1与哺乳动物Sec63基因有高度同源性，而Sec63参与多种蛋白前体分子的翻译后加工；EMO-2是新基因，与人假定蛋白MGC50372有一定同源性，因此没有该基因的研究报道。MNSFD是本实验室正在研究的另一个新发现的着床相关因子，它是一种由抑制性T细胞合成的具有非特异性免疫抑制作用的淋巴因子，因其能抑制IL-4的分泌和Th2细胞的产生，所以推测其可能与母胎间免疫耐受的形成有关，但有待于研究证实。因抗ISP2抗体和抗MNSFβ抗体尚未市场化，为了获得这些蛋白分子的特异性抗体，用于其功能的研究，分别表达和纯化了ISP2重组蛋白，以及MNSFβ-hCGβ和GST-MNSFβ融合蛋白，并进而以这些重组蛋白作为抗原，分别制备了抗ISP2抗体和抗MNSFβ抗体。与此同时，本实验室的其他研究人员也分别制备了抗EMO-1氨基末端肽段抗体(抗EMO-1NTP抗体)、抗EMO-1羧基末端肽段抗体(抗EMO-1CTP抗体)、抗EMO-2氨基末端肽段抗体(抗EMO-2NTP抗体)和抗EMO-1羧基末端肽段抗体(抗EMO-2CTP抗体)。这些抗体其后被用于免疫组化研究和体内抗体封闭实验。应用原位杂交或／和免疫组化技术，对E4BP4、RGS2、ISP2、EMO-1、EMO-2在胚胎着床期间小鼠子宫内膜中的表达模式进行了分析，发现这些基因在胚胎着床前、后的表达均存在特异性差异，但表达部位各有不同，而且EMO-2的高表达不依赖于胚胎的存在，用我们自己制备的抗ISP2抗体进行的免疫组化结果与文献报道的原位杂交结果也相一致。为了进一步了解ISP2、MNSFβ、EMO-1和EMO-2在胚胎着床中的作用，以及探讨这些着床相关因子是否能成为发展新型抗生育技术的潜在靶分子，我们在小鼠体内进行了抗体封闭实验，结果表明，抗ISP2抗体、抗MNSFp抗体、抗EMO-1抗体和抗EMO-2抗体都具有抑制小鼠胚胎着床的作用，并呈剂量反应关系。而本实验室此前应用反义核酸技术进行的体内、外实验结果表明，EMO-1和EMO-2的反义核酸对胚胎的着床也有明显的抑制作用。我们分别收集了经抗ISP2抗体和抗MNSFβ抗体处理过和未经抗体处理过的孕D5天小鼠子宫组织，然后通过免疫组化研究，观察抗ISP2抗体对小鼠子宫中uPA和MMP-9表达水平的影响，分析其抑制胚胎着床的可能机制；并应用基因芯片技术，初步筛选出一些抗MNSFβ抗体处理后在小鼠子宫组织表达上调和下调的基因。为了建立基因剔除小鼠模型的建模技术，为以后深入研究这些基因功能缺陷对胚胎着床的影响极其作用机制提供动物模型，我们建立了具生殖系嵌合能力的C57BL／6J小鼠胚胎干细胞系，可用于今后制备转基因动物和基因剔除动物模型。综合以上研究结果，提示ISP2、MNSFβ、EMO-1和EMO-2在小鼠胚胎着床过程中起着重要作用，并且是发展新型抗生育技术的潜在靶分子，应进一步深入探讨这些基因在着床中的作用机制。
黄哲平[2]2003年在《小鼠着床相关基因的筛选及其功能研究》文中指出胚泡着床是哺乳动物特有的生殖活动，是决定妊娠成功与否的关键步骤，因而是进行生殖调控的一个重要环节。胚泡着床是一个复杂的生理过程，涉及胚胎与母体子宫间极其复杂而精细的多因素协同作用，包括胚泡的发育、分化，子宫内膜的同步变化，以及子宫内膜与胚泡的相互作用。长期以来，胚泡着床的分子机制一直都是生殖生物学领域的一个研究热点，随着人们对细胞连接、信号转导、免疫调节等研究的不断深入，各类蛋白酶、细胞因子等非激素类分子在胚泡着床中的作用已得到广泛关注。近年来，国内外学者也纷纷运用不同的现代生物学技术，鉴别筛选到许多新的参与胚泡着床过程的非激素类分子，并对它们在着床中的作用机制进行了深入研究，使我们对着床的分子机制有了更全面的了解，但至今仍有许多问题有待于阐明。 以小鼠为动物模型，我们应用cDNA差减杂交方法鉴别筛选着床相关基因，即以孕4.5天小鼠着床部位（其中包括胚泡）cDNA RsaI片段为Tester，用过量的非着床部位和胚泡cDNA RsaI片段为Driver，通过差减杂交，构建差减库。并通过PCR扩增插入片段和Agarose 电泳的方法，进行克隆筛选，最后测序分析。共获得3个新的小鼠EST（EST8，EST60，EST81）并在GenBank登录，登录号分别为：BG797173，BG797174，BG797175。另外还发现了EST73的DNA序列与O(Sullivan等所报道的着床丝氨酸蛋白酶2（ISP2）的开放阅读框中的部分序列完全一致。以标记的目的EST片段为探针进行Northern杂交，结果发现: EST8主要在孕4.5天小鼠子宫着床组织和肝脏中表达; EST60主要在附睾中表达，孕4.5天小鼠子宫着床组织中有微量表达; EST73只在孕期（D4.5）子宫组织中表达,有高度的时空特异性; EST81主要在孕4.5天小鼠子宫着床组织和卵巢中表达。根据EST8、EST73、EST81与GenBank中已知基因序列的同源性，分别设计相<WP=4>应的5(端引物和3(端引物。用PCR扩增获得了这些EST相应的cDNA，将这3个cDNA序列在GenBank中进行BLAST分析,分别将其命名为E4BP4、ISP2、RGS2 cDNA，并在GenBank中登录，登录号分别为AY061760、AF442819、AF432916。已有研究表明ISP2很可能是一种透明带溶解蛋白。为了进一步研究它的生物学功能，需要制备ISP2抗体，但至今未见相关报道。为此我们应用GST表达系统表达融合蛋白GST-ISP2，经酶切回收得到重组ISP2。然后用常规方法免疫家兔，获得ISP2多克隆抗体。Western blot分析时，用1：200稀释的该抗血清为一抗时，仍可在特定的位置显示印迹条带。用该抗血清为一抗进行免疫组化分析，结果发现，ISP2蛋白在孕期第5-8天的着床与非着床部位及假孕小鼠子宫的腺上皮表达，这与文献报道的原位杂交检测ISP2mRNA的分布结果基本一致，更进一步说明该抗体具有专一性。有关ISP2抗体对小鼠胚胎着床影响的体内实验正在进行之中。 我们从 Northern blot分析发现，RGS2主要在孕4.5天小鼠子宫着床组织和卵巢中表达，着床与非着床部位有显着差异。到目前为止，未见RGS2与胚胎着床的相关研究报道。我们应用Northern blot和原位杂交的方法，研究了RGS2在不同时期的子宫组织中的分布。Northern blot表明RGS2在小鼠孕第5天至9天在着床和非着床部位的表达，从第6天到第8天逐渐增强，第9天开始减弱。且见着床部位的表达明显强于非着床组织。原位杂交表明，RGS2 mRNA主要分布在子宫着床部位的蜕膜细胞中。提示RGS2可能通过调节母胎界面Ca2+的流动和T淋巴细胞的增殖，在胚泡着床中发挥作用。 MNSF(是一种具有非特异性抑制免疫反应的淋巴因子。以兔抗MNSF(多克隆抗体为一抗，免疫组化结果表明，MNSF(蛋白表达的部位在小鼠子宫内膜的腔上皮和腺上皮。正常的发情周期有表达，着床后着床部位的表达明显下调。表达不受雌孕激素的调节。
郑竹霞[3]2013年在《小鼠着床前胚胎mRNA和16SmtrRNA极性分布及其功能研究》文中研究说明在很多生物的胚胎发育过程中,细胞命运是确定的。因为这些细胞遗传了特异定位在卵母细胞或者受精卵中特定区域的细胞质因子。这些能掌控特定细胞命运的细胞质因子又称为决定因子。但是在哺乳动物胚胎发育过程中却有所不同,在受精卵中还没有发现极性定位的决定因子而且胚胎发育更具有调节性。去除着床前胚胎中的部分细胞或者改变细胞在胚胎中的位置都不会像低等生物那样导致胚胎死亡或不正常,胚胎依然会恢复过来并完成发育。哺乳动物胚胎是否完全抛弃了低等生物胚胎发育规律,不再提前确定胚胎中细胞的发育命运。几十年来,研究者们都在致力于这个问题的探索和研究。在小鼠着床前胚胎发育中,研究者们在很长一段时间内一直认为第一次产生具有不同细胞命运发育倾向的差异是出现在着床前胚胎发育的较晚时期一细胞在胚胎中出现了内层和外层不同位置之后,认为在八细胞期胚胎发生致密化之前,胚胎中所有细胞都是均质无极性的,胚胎内不同细胞间在形态和内容上都不存在差别。但近几年来一些研究成果证明早在四细胞期时,胚胎里的细胞间已经产生了一些使细胞具有不同细胞命运发育倾向的差异。H3组蛋白精氨酸甲基化水平在四细胞期胚胎的不同细胞间存在了差异,而且精氨酸甲基化能够促进细胞发育成内细胞层(inner cell mass,ICM)。另外,四细胞期胚胎的四个细胞中Oct4结合DMA的能力也有着差异,而且这种差异决定细胞发育命运。阻碍Oct4与核DNA结合之后,细胞主要发生对称分裂,形成胚胎外侧部分的细胞系。一些研究者用荧光标记示踪观察方法和叁维时间系列拍照跟踪方法说明胚胎侧与胚胎外侧细胞系的分离能够追溯到第一次胚胎分裂结束后的两个子代细胞上。但二细胞期两个细胞之间发育倾向性的差异主要是通过形态观察统计得来。至今为止还没有确切报道两个细胞间存在能够决定细胞发育倾向的分子水平差异。为了寻找二细胞期两个细胞之间分子水平上的差异,我们用原位杂交的方法对一细胞期高表达的272个基因在二细胞早期胚胎上进行了筛选,看经过一次分裂之后这些基因在两个子细胞上的分配差异。同样我们也对二细胞期高表达的131个基因在二细胞中期胚胎上进行了筛选,看这些基因是否在两个细胞上有不对称分布。结果在我们杂交筛选到的279个基因里面,没有发现不对称分布的基因。说明在小鼠着床前胚胎中没有像果蝇那样大部分mRNA都是极性分布在胚胎中。可能存在极性分布的少量mRNA还不在我们筛选基因里面,所以我们用小鼠转录组芯片杂交检测的方法比较了二细胞晚期胚胎的两对单细胞的整个转录组表达。在检测到的21786个基因当中有645个基因在两对细胞上重复出现两倍以上差异表达。然后我们用实时定量PCR的方法在15个胚胎的15对单细胞上检测了 8倍以上差异表达的23个基因,发现有15个基因在至少11对胚胎上重复出现两倍以上差异表达。另外我们还研究了之前报道在小鼠卵母细胞上有极性分布的线粒体核糖体RNA。发现在整个小鼠着床前胚胎发育过程中,用原位杂交检测到的线粒体核糖体RNA在胚胎上都出现极性不对称分布。在二细胞期和四细胞期的胚胎中,用原位杂交方法检测到的线粒体核糖体RNA在不同细胞间的显色水平不同。到了四细胞期和八细胞期,杂交信号主要分布在细胞与细胞之间连接的地方。线粒体核糖体RNA在四细胞期胚胎的每个细胞上的极性分布也说明四细胞期胚胎中的细胞已经不均质,发生了极化。到了桑椹胚和囊胚时期,杂交信号主要分布在胚胎内层细胞上。线粒体核糖体在着床前胚胎上的这种极性不对称分布与线粒体分布不一致,线粒体在整个着床前胚胎发育中均匀分布在胚胎中。在二细胞期和四细胞期胚胎的细胞之间线粒体数目和线粒体活性并没有像线粒体核糖体RNA那样存在差异。因此,我们用原位杂交免疫电镜的方法确定了原位杂交检测到的16S线粒体核糖体RNA的亚细胞定位,发现这些16S线粒体核糖体RNA定位在线粒体之外。我们通过显微注射实验来研究线粒体外定位的16S线粒体核糖体RNA在着床前胚胎发育过程中的功能,发现16S线粒体核糖体RNA过表达能够促进细胞向内细胞团发育。当向二细胞期胚胎的一个细胞中注射16S线粒体核糖体RNA使其过表达,这个细胞的子代细胞在囊胚期主要分布在囊胚的胚胎侧部分。而当向二细胞期胚胎中的一个细胞中注射16S线粒体核糖体RNA的反义链,这个细胞的子代细胞在囊胚期无规律地分布在整个胚胎中。同时,我们向二细胞期胚胎中的一个细胞只注射EGFP mRNA作为对照,发现这个细胞的子代细胞在囊胚期主要倾向性地分布在囊胚的胚胎侧部分或胚胎外侧部分。对照组的倾向性分布结果与已经报道的用示踪观察方法观察统计结果基本.致。以上实验说明小鼠着床前胚胎极性的建立和细胞与细胞之间差异的形成并不是出现在八细胞期致密化之后。在二细胞期两个细胞间已经存在mRNA表达差异。我们的实验结果显示在整个着床前胚胎发育过程中16S和12S线粒体核糖体RNA都是极性分布在胚胎中。二细胞期就存在了细胞与细胞之间量的差异且这种差异维持在各个时期胚胎中。而且定位在线粒体外的16S线粒体核糖体RNA在胚胎中不同细胞上量的差异能够影响细胞发育命运。过表达16S线粒体核糖体RNA能够促进细胞向内细胞团发育。通过注射16S反义链RNA来破坏16S线粒体核糖体RNA的功能,结果细胞发育的倾向性丧失。
张文倩[4]2018年在《小鼠和大鼠子宫胚胎着床位点的比较转录组研究》文中认为胚胎着床是保证哺乳动物成功妊娠的一个重要环节。虽然所有哺乳动物着床的最终目的都是使母体子宫为胚胎提供营养和供应血液,但它们的分子机制各不相同。本研究利用小鼠和大鼠两种最常用的实验动物模型,来比较它们在着床时基因表达存在的相似与差异之处,从而增进对着床期间分子机制的理解。为了比较小鼠和大鼠胚胎着床时基因表达有何异同,本实验采集正常妊娠小鼠第5天着床位点、非着床位点组织样品,和正常妊娠大鼠第6天着床位点、非着床位点组织样品,利用RNA-seq技术进行基因表达谱分析。结果表明:小鼠胚胎着床位点存在518个差异表达基因,其中253个基因在着床位点上调,265个基因在着床位点下调;大鼠胚胎着床位点存在374个差异表达基因,其中284个基因在着床位点上调,90个基因在着床位点下调。接着对差异表达基因进行了基因本体分析、信号通路分析、基因网络分析和转录因子结合位点分析。基因本体分析结果表明,参与小鼠着床和大鼠着床的差异表达基因的功能基本一致,主要参与细胞代谢、增殖和分化。基因网络分析显示:小鼠差异表达基因网络存在15个中心基因,分别是Ripk4、Akt1、Top2a、Pcna、Umps、Plk1、Hspa1b、Hspa5、Cdc20、Oasl2、Oas2、Rev3l、Pold1、Cdkn1b和Ccna2;大鼠差异表达基因网络存在11个中心基因,分别是Top2a、Cad、Hsp90aa1、Cdk4、Hist2h3c2、Xpo1、Hspa5、Mad2l1、Fos、Acta2和Cenpe。其中,中心基因Top2a和Hspa5为小鼠和大鼠所共有。由于中心基因在基因网络中处于关键位置,因而它们是胚胎着床过程中的重要基因。小鼠基因转录因子结合位点分析结果显示:ETF、ZF5、E2F-1、E2F-4:DP-2、MOVO-B、Sp1和SREBP-1结合位点在着床时显着富集;大鼠基因转录因子结合位点分析结果显示:ETF、E2F-4:DP-2和MOVO-B结合位点在着床时显着富集。显着富集的ETF、E2F-4:DP-2和MOVO-B结合位点是小鼠和大鼠所共有的。此外,本研究还对差异表达基因进行了进化分析。通过分析差异表达基因的基因年龄,发现这些胚胎着床相关的差异表达基因都是古老的基因,而不是进化出的新基因,它们因在胚胎着床时需要而被激活表达。对差异表达基因和非差异表达基因在进化速率方面进行比较,结果显示二者进化速率之间存在显着性差异(p<0.05),差异表达基因的进化速率更加缓慢,序列更加保守。综上所述,本研究筛选出了小鼠和大鼠子宫胚胎着床位点的差异表达基因。通过对差异表达基因进行生物信息学分析和进化分析,揭示了小鼠和大鼠在胚胎着床时的基因功能及进化规律。本研究有助于进一步了解胚胎着床的分子机制,为后续的深入研究奠定了基础。
王宁[5]2007年在《人子宫内膜窗口期基因表达平台的建立及特异基因的筛选》文中提出胚胎着床是哺乳动物独有的涉及胚胎和母体子宫内膜相互作用的生殖过程。此过程在时间和空间上都是高度有序的。哺乳动物的子宫内膜只有在着床窗开放时,才能接受胚泡,最终完成着床。人类的子宫内膜仅在月经周期很短的一段时期可以接受胚胎着床。大量研究证实这一时期主要受激素调控,接受态子宫内膜的形成是这一时期的一个重要事件。为了解着床窗口期事件包括接受态子宫内膜形成及胚胎着床等过程中的分子机制的全貌并深入研究着床窗口期的分子调控机制,本研究采用抑制消减杂交技术,将人着床窗口期和早泌期子宫内膜组织cDNA互相消减,构建了这两个时期的双向消减cDNA文库,并对筛选出来的部分已知和未知基因进行了深入探索。主要结果如下:1.为了构建人子宫内膜窗口期基因表达平台,我们从最初的实验材料选择就严格把关。我们以同一位志愿者的不同时相的子宫内膜作为自身对照,结合扫描电镜观察结果、B超检测结果、HE染色结果和PR免疫组化染色结果从多方面验证了材料的可靠性,为后续的分子生物学实验打下坚实的基础。2.SMART~(TM) PCR cDNA Synthesis技术和抑制性消减杂交技术结合起来,构建了人窗口期子宫内膜和早泌期子宫内膜双向cDNA抑制消减文库。3.在人窗口期子宫内膜cDNA文库(HWE)和人早泌期子宫内膜cDNA文库(HEW)911个PCR纯化产物进行斑点杂交分析,有354个在人窗口期和早泌期子宫内膜存在4倍以上表达差异,其中192个在窗口期差异表达,162个在早泌期差异表达。对斑点杂交筛选出的354个克隆中的130个克隆进行测序,共产生了93个质量满意的ESTs,总测序成功率达到71.54%。4.通过在互联网上的比对,在HWE文库中已知基因、已知ESTs和全新ESTs分别为52.46%、40.98%和6.56%:在HEW文库中分别为48.57%、48.57%和2.86%。5.对代表已知基因的ESTs按照功能分类,发现主要涉及细胞分裂/细胞凋亡、蛋白合成和分解、物质转运、分子伴侣、转录调控因子、信号转导、细胞骨架、粘附分子几类,并初步探讨了人子宫内膜围着床过程中差异表达基因的作用和意义。6.通过序列比对发现在HWE文库中编号为82G7的克隆序列与已知基因NID-1同源性很高,用原位杂交技术检测在窗口期和早泌期人子宫内膜的表达,结果显示NID-1在窗口期子宫内膜的基质细胞中高表达,在早泌期的子宫内膜组织中表达很弱。根据文献推测,NID-1基因的表达产物的作用可能在人类的胚胎发生、着床和蜕膜化反应中发挥重要作用。7.将人子宫内膜窗口期特异表达的克隆编号为82F4的EST序列进行RACE扩增获得一个新的cDNA序列,命名为PPI-82-F4,登录GenBank,获得登录号为EF063108。8.应用Northern杂交技术检测PPI-82-F4在窗口期和早泌期人子宫内膜的表达,结果显示PPI-82-F4在窗口期子宫内膜的表达显着高于早泌期。应用原位杂交技术检测PPI-82-F4在窗口期和早泌期人子宫内膜的表达,结果显示PPI-82-F4在窗口期子宫内膜的基质细胞和腺上皮细胞中高表达,在早泌期的子宫内膜组织中表达很弱。综上所述,我们采用抑制性消减杂交构建了双向人子宫内膜窗口期消减早泌期cDNA文库,在这两个文库中各有192和162个阳性差异的克隆,我们所得到的基因包括转录调控因子、信号转导、细胞骨架几类。母体子宫内膜从排卵到着床的过程中发生剧烈的变化,在孕激素的调控下,为了使着床窗开放做了充分准备,有很多相关基因表达。我们发现了一些基因的表达上调,同时还有一些基因表达降低或受到抑制,为我们发现潜在的新基因提供可能性。
王奇[6]2017年在《着床窗口期小鼠子宫组织中长链非编码RNA的鉴定及其功能研究》文中指出胚胎的成功植入依赖于容受性子宫与活性囊胚之间复杂的分子对话,子宫容受性的建立是哺乳动物胚胎成功植入的关键步骤。子宫内膜仅在一段十分短暂的时间内具有接受活性囊胚的能力,这一时期叫做“着床窗口期”。尽管体外受精和胚胎移植技术在生产实践中已被广泛应用,但是妊娠率依然不理想,子宫内膜容受性破坏被认为是辅助生殖技术失败的主要原因之一。既往的研究充分显示了蛋白编码基因和miRNAs在子宫内膜容受性建立、胚胎植入以及后继蜕膜化过程中所发挥的重要作用。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)作为非编码RNA家族中数量最多的一员,在卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中的功能已有深入研究,但在胚胎着床过程中的作用鲜有报道。本试验收集妊娠小鼠第4天、第5天着床位点和非着床位点子宫样本进行深度测序,以期获得小鼠着床窗口期子宫中的lncRNAs图谱,为今后深入研究lncRNAs在子宫内膜容受性建立以及后继蜕膜化过程中的作用及机制奠定基础。本试验得到的主要结果如下:1通过Illumina HiSeq~(TM) 2500高通量测序平台获得了小鼠着床窗口期子宫组织中的lncRNAs图谱,共得到lncRNA有7764个,其中已知lncRNA 6179个,新预测lncRNA1585个。我们从中挑选了13个差异表达的lncRNAs并对其进行了qRT-PCR验证,与测序结果相吻合。2进一步对所获得的lncRNAs的表达水平、序列和位点保守性进行分析,预测lncRNA的cis和trans作用靶基因;将获得的74个差异表达lncRNAs靶基因进行了GO和KEGG富集分析,发现在植入窗口期差异表达的lncRNAs主要参与组织重塑、免疫反应和代谢相关过程,对胚胎着床过程中的多种信号通路具有调控作用。3在测序结果中,我们发现一个在小鼠妊娠第4天子宫中显着上调,在第5天着床位点和非着床位点差异表达的已知lncRNA GAS5。进一步通过构建小鼠早期妊娠、延迟着床与激活、类固醇激素处理模型,揭示GAS5在着床窗口期子宫中呈现动态表达模式,GAS5在妊娠子宫中的表达受活性胚胎和孕酮的调节,预示着GAS5可能在子宫内膜容受性的建立以及胚胎植入过程中发挥作用。4 FISH的结果表明,GAS5定位于小鼠子宫内膜基质细胞的细胞核。人工诱导蜕膜化子宫中GAS5的表达显着上调,随体外诱导蜕膜化时间的增加GAS5表达下降,预示着GAS5可能在蜕膜化过程发挥一定的功能。综上所述,本研究建立了小鼠着床窗口期lncRNAs图谱,筛选出着床窗口期差异表达的lncRNAs,并且对这些差异lncRNAs进行了功能注释以及通路分析。GAS5可能参与调节小鼠的胚胎着床和蜕膜化过程,并且GAS5在早期妊娠过程中可能受到活性胚胎和孕酮的调节。
徐以民[7]2006年在《小鼠胚泡围着床期LongSAGE文库构建及相关基因研究》文中指出胚胎着床是人和哺乳动物生殖过程中妊娠建立的第一步,是决定妊娠成功与否的关键。成功的植入取决于处于接受态的子宫内膜和具有侵入性的胚胎间的同步协调反应。在植入开始,母体与胚胎建立了密切的物质和信息交流。目前认为有多种分子和细胞水平的调控分子如内分泌、旁分泌、邻分泌调节因子参与胚胎的着床过程,并通过多种细胞信号途径从时间和空间上对胚胎和子宫进行精细调控。但是子宫内膜仅在某一特定时期允许胚胎着床,这一时期时间很短,代表着子宫内膜对胚胎具有容受性,称为“着床窗口期”。胚胎着床过程包括脱去透明带、定位、黏附、侵入到最后着床等几个阶段。由于涉及到众多基因的调控以及错综复杂的调节因子网络的参与,早期的胚胎发育和着床的详细分子机制尚不清楚。几乎所有生物学变化都与关键基因的表达有关。人们以往一直试图从某一特定的分子与基因作为突破口,探寻着床发生机制。现在大规模的基因表达谱分析已广泛应用于生物学和医学研究领域,其中寡核苷酸芯片、DNA微阵列以及基因表达系列分析是目前应用最广泛的基因表达分析方法。但DNA微阵列只能检测已知基因,且定量分析受到限制,而SAGE技术能较完整地获得基因组表达丰度的数量信息,能够大规模对转录本进行定性和定量分析,可充分了解基因转录组的全貌,甚至可以发现新基因,被证明是一种对全基因组基因进行表达分析和寻找差异表达基因的强有力工具。通过对转录本特定位置的短寡核苷酸标签(即SAGE标签)的鉴定、分析可以获取基因表达的信息。
杜惠[8]2009年在《着床相关基因E4BP4与COMT在子宫内膜异位症在位子宫内膜中的表达及意义》文中研究表明第一部分目的通过研究着床相关基因腺病毒E4启动子结合蛋白—4(E4BP4)在子宫内膜异位症(内异症,EM)患者在位子宫内膜中的表达变化及分布,探讨内异症关联性不孕的分子机制。方法选取EM患者与非EM患者各13例,分别取其增生期(proliferativeendometrium,PE)和分泌期子宫内膜(secretory endometrium,SE)。采用RT-PCR、real-time quantitative PCR和Western blowing从mRNA和蛋白水平对E4BP4的表达变化进行分析。免疫组化检测E4BP4蛋白在两组内膜中的分布。结果分泌期及增生期EM组E4BP4 mRNA及蛋白水平显着下调,与对照组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05);E4BP4蛋白主要分布于子宫内膜腺上皮及基质的胞浆与胞核中,在分泌期,内异症组E4BP4蛋白含量水平与对照组相比明显下降,而增生期两者差异不明显。结论E4BP4在子宫内膜异位症患者在位子宫内膜中的表达下调,提示E4BP4可能参与介导EM对胚胎着床的影响。第二部分目的探讨着床相关基因儿茶酚邻位甲基转移酶(COMT)在小鼠动情周期及EM患者在位子宫内膜中的表达调控规律,为其参与调节生殖过程的作用机制提供新的证据。方法1.采用RT-PCR,real-time quantitative PCR和Western blotting检测成年小鼠动情周期不同时相以及孕第7天鼠的子宫、卵巢中COMT表达有无变化。2.性成熟前小鼠分别用E_2(苯甲酸雌二醇)、P_4(孕酮)、E_2+Tam(苯甲酸雌二醇+他莫昔芬)、P_4+R(孕酮+米非司酮)处理,检测其子宫和卵巢中COMT mRNA水平有无变化。3.采用Western blotting及RT-PCR检测COMT在EM患者及对照组在位子宫内膜中的表达变化。结果1.成年小鼠子宫与卵巢中COMT mRNA和蛋白水平在动情期较高,与其它时相相比,差异有统计学意义(P＜0.05);孕第7天小鼠子宫的COMT mRNA水平有下降趋势,与未孕小鼠相比,差异具有统计学意义(P＜0.05)。2.性成熟前小鼠子宫中COMT mRNA水平各激素处理组间均无差异(P＞0.05),而在性成熟前小鼠各激素处理组的卵巢中却显示苯甲酸雌二醇(E_2)组COMT mRNA偏低,E_2+Tam(他莫昔芬)组中COMT mRNA较高,两组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。3.内异症患者分泌期、增生期子宫内膜中COMT mRNA和蛋白水平与对照组相比,差异均不具统计学意义(P＞0.05)。结论1.小鼠COMT mRNA水平随动情周期变化,而且与妊娠有关;雌激素对COMT的生物合成具有负调节作用,而且这种作用可能是通过雌激素受体依赖性方式进行。2.COMT与内异症胚胎种植微环境的改变之间无明显相关性。第叁部分目的应用基因芯片技术比较EM患者与对照组分泌期子宫内膜基因表达谱的差异,探讨内异症关联性不孕的分子机制。方法应用基因芯片检测EM组(n=8)和非EM组(n=9)分泌期子宫内膜的基因表达谱,筛选表达水平出现差异变化的基因,结合信息学工具和文献检索,分析筛出基因发生表达变化的生理与病理学意义。结果经过基因芯片检测,在EM组分泌期子宫内膜的基因表达谱中,有186个基因表达上调大于2倍,而236个基因表达下调小于0.5倍。通过KEGG和Genemap数据库的生物学过程分析,说明可能通过影响细胞信号转导,调节炎症因子及细胞粘附与分化等生物学过程,导致胚胎着床微环境发生异常改变。结论EM患者子宫内膜基因表达谱的变化反映了子宫内膜异位症可能对胚胎着床的影响,为进一步的分子机制研究提供了基因靶点。
参考文献：
[1]. 胚泡与子宫内膜着床相关基因的筛选及其功能的研究[D]. 王健. 复旦大学. 2005
[2]. 小鼠着床相关基因的筛选及其功能研究[D]. 黄哲平. 复旦大学. 2003
[3]. 小鼠着床前胚胎mRNA和16SmtrRNA极性分布及其功能研究[D]. 郑竹霞. 中国科学技术大学. 2013
[4]. 小鼠和大鼠子宫胚胎着床位点的比较转录组研究[D]. 张文倩. 华南农业大学. 2018
[5]. 人子宫内膜窗口期基因表达平台的建立及特异基因的筛选[D]. 王宁. 中国协和医科大学. 2007
[6]. 着床窗口期小鼠子宫组织中长链非编码RNA的鉴定及其功能研究[D]. 王奇. 西北农林科技大学. 2017
[7]. 小鼠胚泡围着床期LongSAGE文库构建及相关基因研究[D]. 徐以民. 重庆医科大学. 2006
[8]. 着床相关基因E4BP4与COMT在子宫内膜异位症在位子宫内膜中的表达及意义[D]. 杜惠. 复旦大学. 2009
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