天蓝色链霉菌海藻糖合酶的异源表达、活性分析及重组菌全细胞转化合成海藻糖的条件优化

论文摘要

从天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor克隆得到海藻糖合酶基因（Sc TreS）,在大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）中进行了异源表达,通过Ni-NTA亲和柱对表达产物进行分离纯化得到纯酶,经SDS-PAGE测定其分子量约为62.3 kDa。研究其酶学性质发现该酶最适温度35℃最适pH 7.0,对酸性条件比较敏感。通过同源建模和序列比对分析,对该基因进行定点突变。突变酶K246A比酶活比野生酶提高了1.43倍,突变酶A165T相对提高了1.39倍,海藻糖转化率分别提高了14%和10%。利用突变体重组菌K246A进行全细胞转化优化海藻糖的合成条件并放大进行5 L罐发酵,结果表明:在麦芽糖浓度300 g/L、初始反应温度和pH分别为35℃和7.0的条件下,转化率最高达到71.3%,产量为213.93 g/L;当底物浓度增加到700 g/L时,海藻糖产量仍可达到465.98 g/L。

论文目录

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

1.1.2 酶和试剂

1.1.3 培养基

1.2 方法

1.2.1 基因提取和引物设计

1.2.2 基因的克隆和重组表达载体构建

1.2.3 突变位点的选择和突变体的构建

1.2.4 TreS酶的表达和纯化

1.2.5 酶活测定

1.2.6 酶学性质

1.2.7 突变体的发酵罐培养及全细胞转化生产海藻糖

2 结果与分析

2.1 基因克隆及重组载体构建

2.2 突变位点的选择

2.3 野生重组酶与突变酶的表达纯化

2.4 野生酶与突变酶的酶学性质比较

2.4.1 野生酶与突变酶的最适温度比较

2.4.2 野生酶与突变酶的最适pH比较

2.4.3 野生酶和突变酶热稳定性的比较

2.4.4 野生酶与突变酶合成海藻糖的能力比较

2.5 海藻糖合酶突变体全细胞转化合成海藻糖的条件优化

2.5.1 温度对全细胞转化合成海藻糖的影响

2.5.2 初始pH对全细胞转化合成海藻糖的影响

2.5.3 菌体量对全细胞转化合成海藻糖的影响

2.5.4 底物浓度对全细胞转化合成海藻糖的影响

2.5.5 5 L罐全细胞转化

3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 吴傲,张显,徐美娟,杨套伟,李华钟,饶志明

关键词: 海藻糖合酶,克隆表达,定点突变,全细胞转化

来源: 生物工程学报 2019年07期

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室

基金: 中央高校基本科研业务费专项资金(No.JUSRP51708A),江苏高校优势学科建设工程,江苏高校品牌专业建设工程资助项目资助~~

分类号: Q78

DOI: 10.13345/j.cjb.190038

页码: 1348-1358

总页数: 11

文件大小: 1166K

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标签：海藻糖合酶论文; 克隆表达论文; 定点突变论文; 全细胞转化论文;

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