CRISPR质粒和同源重组模板的共转染降低了CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率

论文摘要

CRISPR/Cas9系统具有识别并切割特定序列DNA的功能,是广泛应用的基因编辑工具。虽然CRISPR/Cas9系统可以高效地产生基因敲除,但是精确的基因编辑的效率仍然很低,这主要是由于同源重组修复的效率很低。目前已有多个方法可以在一定程度上提高CRISPR/Cas9系统介导的同源重组的效率,例如抑制非同源末端连接修复,优化同源模板的设计等。最近有研究报道将Cas9 RNP和同源模板相继电转染进细胞提高了同源重组的效率,但是其具体机制仍不清楚。因此,本研究探讨了共转染CRISPR质粒和同源重组模板对CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率的影响以及可行的降低影响的办法。首先,我们用T7E1内切酶实验和RT-qPCR检测了只转染CRISPR质粒组以及共转染质粒和模板组细胞内Cas9的切割效率,RNA和DNA水平的差异。其次,检测了降低共转染的同源模板DNA的数量时,细胞内Cas9DNA和RNA水平的变化。然后,将GFP质粒分别和单链DNA、双链DNA共转染细胞,检测细胞内的绿色荧光强度。最后,为了验证将二者相继转染是否可以降低上述的影响,我们先转染了 CRISPR质粒后转染了同源重组模板,并检测了细胞内Cas9DNA,RNA水平以及切割效率的变化。结果显示相比于只转染CRISPR质粒组,CRISPR质粒和同源重组模板的共转染显著降低了细胞内Cas9 DNA和RNA水平,以及Cas9的切割效率。DNA的双链互补片段也降低了共转染的GFP质粒的转染效率。而先转染CRISPR质粒后转染同源模板组和只转染质粒组在Cas9DNA和RNA水平,以及CRISPR/Cas9系统的切割效率上无明显差别。综合以上结果,共转染CRISPR质粒和同源重组模板降低了 CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率。而先转染CRIPSR质粒后转染同源重组模板法可以解决这个问题。本研究的结果有助于人们优化CRISPR/Cas9系统的转染方法,进一步提高CRISPR/Cas9系统介导的同源重组的效率。

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类型: 硕士论文

作者: 林琼

导师: 刘德培

关键词: 系统,基因编辑,共转染,分开转染,同源重组模板,单链,双链

来源: 北京协和医学院

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 北京协和医学院

分类号: Q78

DOI: 10.27648/d.cnki.gzxhu.2019.000726

总页数: 67

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• [1].CRISPR质粒和同源重组模板的共转染可降低CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率[J]. 基础医学与临床 2019(07)

标签：系统论文;  基因编辑论文;  共转染论文;  分开转染论文;  同源重组模板论文;  单链论文;  双链论文;