袁芳[1]2003年在《雌、孕激素对人宫颈癌细胞株Hela细胞体外生长的影响》文中认为目的：宫颈癌是严重威胁广大妇女生命与健康的恶性肿瘤，近些年发病年龄趋于年轻化, 传统的治疗方法手术和放射治疗（放疗）可能使患者丧失或降低卵巢功能，故年轻患者术后生存质量大幅下降 ，合理应用激素替代疗法（Hormone Replacement Therapy, HRT）可提高年轻患者的生活质量，但其潜在致癌问题及对原有疾病的影响是值得十分关注的。本研究旨在通过细胞培养探讨雌二醇（E2）、孕酮（P）对宫颈癌细胞株Hela细胞生长的影响，从而为临床宫颈癌术后患者可否进行HRT，提供充分的依据。方法：1.细胞培养：常规方法复苏冻存的宫颈癌细胞株Hela细胞接种于100ml培养瓶中，于37℃、5%二氧化碳的饱和湿度培养箱内松盖培养。以0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化传代。2.宫颈癌细胞株Hela细胞ER、PR测定：取对数生长期的Hela细胞，制成单细胞悬液，滴于多聚赖氨酸处理的载玻片上，自然晾干，立即以4℃冷丙酮固定10min ，以链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（SP）法测定Hela细胞ER、PR。结果判定采用H-score法：每一受体2张玻片，每片至少观察5个视野，阳性染色为细胞核内出现棕黄色颗粒，以i代表染色深浅，共0～<WP=4>3分：0分为不着色；1分为着色浅，呈淡黄色；2分为中度着色，呈深黄色；3分为着色深，呈棕色/咖啡色。Pi代表每一着色程度的细胞所占的比例，为0-100%，H-score=∑Pi（i＋1）,满分为4分。3.细胞增殖实验：取对数生长期的Hela细胞，制成浓度为3×104个/ml的单细胞悬液，接种到96孔培养板，每孔200ul，过夜贴壁，4℃培养1h，以促进细胞同步化生长;换培养液，实验组根据加入药物的不同分为E2组、P 组和E2+P组，E2组分别加入含E2 0.50、1.00、5.00和10.00nmol/L（nM）的培养液，P 组分别加入含P 0.01、0.10、1.00和 10.00umol/L(uM) 的培养液，E2+P组中E2和P的终浓度分别同E2组、P 组；对照组加入含0.03%乙醇的培养液，每一浓度均设8个复孔，继续培养72h后，每孔加入20ul浓度为5mg/ml的MTT溶液，继续孵育4h后吸净上清液，每孔加入二甲亚砜200ul，振荡10min，用酶标光度仪在波长为492nm时测定每孔的吸光度（A）值，并计算抑制率（抑制率=对照组A值-实验组A值/对照组A值）。本实验重复3次。4.细胞周期和细胞凋亡率的检测：将浓度为3×104个/ml的Hela单细胞悬液，接种于100ml培养瓶，过夜贴壁，同步化处理后换培养液，实验组取各组最大浓度，即E2组含E2为10.00 nM, P组含P为10.00uM，E2+P组E2和P的终浓度分别同E2、P组,对照组加入含0.03%乙醇的培养液。继续培养72h，EDTA消化后收集<WP=5>细胞，用70%的冷乙醇固定，碘化丙啶（PI）染色后置流式细胞仪（FCM）分析。5.细胞的形态学观察：（1）倒置显微镜观察：将浓度为3×104个/ml的Hela单细胞悬液接种于 24孔培养板，每孔1ml，待细胞生长至对数生长期，换培养液，实验组、对照组处理同4。继续培养24和72 h，倒置显微镜下观察并摄影。（2）光学显微镜观察：24孔培养板每孔预先置一盖玻片，然后接种相同浓度（3×104个/ml） 的Hela单细胞悬液，每孔1ml，实验组、对照组处理同上。继续培养72 h，取出盖玻片，姬姆萨（Giemsa）染液染色10～15min，光学显微镜下观察。（3）电子显微镜观察：将相同浓度的Hela细胞悬液，接种于100ml培养瓶中，上述方法培养72h，EDTA消化后收集细胞，4%戊二醛4℃固定、脱水、浸透、包埋、切片、染色，采用JEM-1230型透射电子显微镜观察。6．Hela细胞bcl-2蛋白表达的测定：接种相同浓度的Hela单细胞悬液于100ml培养瓶中，实验组、对照组处理同4。继续培养72h，EDTA消化后收集细胞，70%冷乙醇4℃固定过夜，调整细胞数为1×106个/ml，加入鼠抗人bcl-2单克隆抗体，4℃冰浴1h，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为空白对照；加入FITC标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗，4℃暗处孵育30min。置FCM检测,并计算bcl-2蛋白的荧光指数FI[FI=(bcl-2蛋白的平均荧光强度-对照样品的平均荧光强度)/正常组织基因蛋白的平均荧光强度]。统计学方法：细胞吸光度值（A）和ER、PR的表达<WP=6>用±s表示，ER和PR比较，用t检验。多组间比较，采用方差分析及Spearman相关分析。计数资料用Χ2检验。所有数据均用SAS软件包进行统计。P＜0.05为差异有显着性意义。结果：1.Hela细胞ER、PR的表达：Hela细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性染色, 其ER和PR均有表达，ER含量为0.99±0.30， PR含量为2.57±0.09，两者相比，后者明显高于前者(P＜0.01)。2.E2、P和E2＋P对Hela细胞的增殖情况的影响：E2浓度为0.50nM时，对Hela细胞生长有轻度促进作用，但与对照组比较，差异无显着性意义（P＞0.05）。当浓度为1.00～10.00nM时，对细胞生长的促进作用较明显，与对照组比较，差异均有显着性意义(P＜0.01)，且随着浓度的增加，A值具有上升趋势，A值和E2浓度呈显着正相关性（P＜0.05)。相反，P与E2＋P两组细胞均在P浓度为0.10、1.00、10.00uM时对Hela细胞的增殖有明显抑制作用（P＜0.01)，且随着浓度的增加，增殖抑制率升高，增殖抑制率与浓度之间具有显着正相关性（P＜0.05)。在P浓度均为10.00uM的P组和E2＋P组，单独经P作用后的细胞增殖?
孟萌[2]2008年在《叁氧化二砷（As_2O_3）雌激素样效应的研究》文中提出本实验对人宫颈癌细胞(Hela细胞)进行体外培养,通过分别在培养基中添加7种刺激液:雌二醇(1nM)、叁氧化二砷(0.5μM、1μM、5μM)、雌二醇拮抗剂(500nM)、雌二醇(1nM)与雌二醇拮抗剂(500nM)、叁氧化二砷(1μM)与雌二醇拮抗剂(500nM),观察Hela细胞体外生长状况及检测雌激素受体(ER)与孕激素受体(PR)的表达,来研究叁氧化二砷的雌激素效应。本实验采用酶消化法对Hela细胞进行体外生长培养。采用酶联仪测定琥珀酸脱氢酶活性的方法(MTT比色法),测定Hela细胞生长状况。采用流式细胞计量术测定细胞中DNA含量,反应细胞周期的变化。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)对目的条带进行扩增,测定雌激素受体及孕激素受体的表达。结果表明,0.5μM叁氧化二砷与1nM雌二醇的作用效果相似。它们都促进细胞增殖,促使细胞进入DNA合成期(S期),减少雌激素受体的表达,提高孕激素受体的表达。其它各组对Hela细胞的生长均呈现抑制作用,并且雌激素受体与孕激素受体的表达发生相应的变化。从各项结果显示的数据看,微量的叁氧化二砷(<0.5μM)具有雌激素样效应,且可被雌二醇拮抗剂所拮抗。这为探明叁氧化二砷诱发癌症及治疗癌症的机理提供了帮助。
许莉, 曾志良, 陈宏翔, 陈娜, 段逸群[3]2014年在《雌、孕激素对淋球菌诱导的Hela细胞TSLP和TGF-β表达的影响》文中进行了进一步梳理目的探讨雌、孕激素对淋球菌(Ng)诱导的人宫颈癌细胞胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)和转化生长因子β(TGF-β)表达的影响。方法体外培养宫颈癌细胞株Hela,将获得的Hela细胞分为如下5组:对照组、Ng组、Ng+雌激素组、Ng+孕激素组、Ng+雌激素+孕激素组。分别培养24h后应用实时荧光定量PCR检测各组细胞TSLP和TGF-βmRNA表达变化情况,Western blot检测各组细胞TSLP和TGF-β蛋白水平。结果 Hela细胞在淋球菌的刺激下,细胞TSLP和TGF-βmRNA及蛋白表达水平增高(P﹤0.01);雌、孕激素单独或联合作用24h后都可以显着提高Hela细胞中TSLP和TGF-βmRNA表达水平(P﹤0.01)。结论 Hela细胞在淋球菌作用下合成TSLP和TGF-β增加;提示雌、孕可促进淋球菌诱导的TSLP和TGF-β合成。
李允光[4]2007年在《环氧合酶2高表达及siRNA沉默其基因对宫颈癌生物学行为的影响》文中研究表明一、未绝经宫颈癌患者肿瘤组织中环氧合酶2的表达及其意义目的探讨环氧合酶2(COX-2)在宫颈癌组织中的表达与月经周期的关系及其临床意义。方法选取47例未绝经宫颈癌手术病人,病史结合子宫内膜HE染色观察判断患者所处月经周期时段,采用免疫组织化学SABC法检测宫颈癌组织中COX-2及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,计算机图像分析COX-2免疫染色密度值,计数PCNA标记指数(LI)。结果47例宫颈癌病人,增生期患者COX-2表达阳性率较分泌期无显着性差异,但阳性患者表达强于分泌期。宫颈癌组织中COX-2表达水平与PCNA LI值呈显着正相关性。有淋巴结转移、局部肌层浸润者COX-2表达阳性率高于无转移者,宫颈癌组织中COX-2的表达与FIGO临床分期、组织分化程度无显着相关性。结论未绝经宫颈癌患者肿瘤组织中COX-2的表达在增生期较分泌期明显增强,并参与调节肿瘤的生长、转移。二、雌、孕激素对宫颈癌Hela细胞环氧合酶-2表达的影响目的研究17-β雌二醇(E2)、甲羟孕酮(MPA)对Hela细胞肿瘤相关基因COX-2表达的影响。方法将培养的Hela细胞分为对照组、无水乙醇组、E2组、E2+MPA组和MPA组,分别用相应药物处理24h, Western blot、RT-PCR方法检测COX-2蛋白及mRNA表达变化,同时采用免疫细胞化学SABC法染色检测COX-2,PCNA在Hela细胞的表达,计算机图像分析PCNA免疫染色平均光密度值。结果正常培养的Hela细胞即有COX-2蛋白表达,E2可显着上调其蛋白及mRNA表达,而MPA、MPA+E2组COX-2的蛋白及mRNA表达水平显着下调。各组PCNA平均光密度值E2组平均光密度较对照组高,差异显着,E2+MPA组和MPA组显着降低。结论Hela细胞中COX-2的表达受女性激素的调控,E2上调其表达,MPA、E2+MPA下调其表达,并可能因此影响Hela细胞的增殖活性。叁、COX-2 siRNA真核表达载体构建及其效应检测目的构建可在真核细胞表达COX-2 siRNA的真核表达载体,并检测其对Hela细胞COX-2表达的抑制效应,为研究COX-2基因的功能提供前提条件。方法选择COX-2的全长基因序列作为分析序列,采用Ambion公司软件和siRNA设计原则,设计两条特异的siRNA靶序列,体外合成发卡状siRNA序列,以亚克隆法经BamHI和HindIII酶切位点分别克隆入Pgenesil-1载体,即Pgenesil-C1、Pgenesil-C2,插入一段等长随机序列的P-Control作为阴性对照。经PstI和SalI酶切鉴定和测序后,以脂质体法将其转染至人宫颈癌Hela细胞系,转染48h分别用RT-PCR和Western blot方法评价对COX-2表达的抑制效应。结果酶切鉴定和测序结果证实发卡状siRNA序列成功连接到Pgenesil-1载体,转染Pgenesil-C1、Pgenesil-C2后48h,Hela细胞COX-2 mRNA和蛋白的表达水平显着降低,效率分别达87%、53%。结论成功构建了针对COX-2基因的siRNA真核表达载体,Pgenesil-C1可以有效抑制COX-2基因的表达。四、RNAi沉默环氧合酶-2基因对宫颈癌Hela细胞细胞周期影响及其机制的实验研究目的利用RNA干扰(RNAi)抑制宫颈癌Hela细胞COX-2表达研究其对细胞周期的影响及其机制。方法以脂质体法将COX-2小干扰RNA(siRNA)真核表达载体质粒Pgenesil-C1转染至Hela细胞系,对照质粒P-Control作为对照组。分别用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖活性,流式细胞技术检测Hela细胞细胞周期改变,用Western blot方法检测cyclinD1及cyclinE蛋白的表达变化。结果转染Pgenesil-C1后细胞增殖活性受到显着抑制,流式细胞仪分析结果显示转染Pgenesil-C1后Hela细胞G0/G1期细胞较对照组显着增多,而S期和G2/M细胞较对照组显着减少,同时cyclinD1及cyclin E蛋白表达显着降低,转染后96h凋亡细胞较对照组增多,凋亡率为3.25%。结论利用RNAi技术抑制COX-2表达可以降低Hela细胞增殖活性,可能通过下调cyclinD1及cyclin E的表达使细胞周期阻滞于G0/G1期。五、COX-2基因表达下调对宫颈癌Hela细胞顺铂化疗敏感性的影响及其机制研究目的利用RNA干扰(RNAi)抑制Hela细胞COX-2表达后凋亡相关基因表达的变化,研究COX-2对Hela细胞顺铂(CDDP)化疗敏感性影响及其作用机制。方法构建特异性COX-2小干扰RNA(siRNA)真核表达载体质粒Pgenesil-C1,以脂质体法将其转染至Hela细胞系,随机序列质粒P-Control作为对照组,G418筛选阳性克隆,用不同浓度CDDP作用于各组Hela细胞12h,用MTT检测Hela细胞的存活率,流式细胞技术检测Hela细胞凋亡率的变化。用RT-PCR方法检测Survivin、Bax和Bcl-2 mRNA的表达变化。结果MTT结果显示Hela细胞存活率随CDDP浓度升高而降低,Pgenesil-C1组较对照组降低更为显着,流式细胞仪分析显示转染Pgenesil-C1组凋亡Hela细胞较对照组显着增多。转染Pgenesil-C1后Survivin和Bcl-2 mRNA表达较对照组和P-Control组显着降低,而Bax mRNA表达无明显改变。结论Hela细胞COX-2基因的表达被抑制后Hela细胞对CDDP的化疗敏感性显着增强,这可能与Survivin和Bcl-2表达下调有关,而与Bax表达无关。
朱晓武[5]2010年在《17β雌二醇对宫颈癌细胞株生物学的影响和上皮性卵巢肿瘤微淋巴管内皮细胞的体外培养》文中指出在女性妇科恶性肿瘤中,宫颈癌是最常见的恶性肿瘤,其发病率逐年上升,年轻患者和腺癌的比例增加,在中国目前每年有大约有13万的新增病例。而且宫颈癌是众多恶性肿瘤中较少的几种有较为有效的早期筛查手段。宫颈细胞学检查可以区分出宫颈上皮内瘤样变和宫颈癌病变和宫颈炎性改变,虽然有一定的假阳性和假阴性,但是其准确性比较可靠,根据细胞学的检查结果,可以进一步采取更为准确有效的宫颈活检而进一步确诊,所以目前诊断为宫颈癌的患者大多数都处于早中期,仍然具有手术切除病灶的机会。目前宫颈癌手术的方式比较经典的方法是广泛全子宫和双附件切除加盆腔淋巴结清扫术,这将导致女性卵巢功能的彻底完全丧失。在女性,卵巢的生殖内分泌功能对于其生理和病理过程中起着非常重要的作用,尤其是年轻女性。而其中关键性的因素就是卵巢能够产生和分泌雌激素,雌激素对于女性体内的一序列生理病理变化起着不可替代的作用。而对于宫颈癌患者进行根治手术之后导致卵巢功能的丧失是永久性的,不可逆的。对于这这部分患者能否进行雌激素替代治疗仍然未有一个确定性的结论。雌激素对于宫颈癌的影响仍然具有争议性的。国内外的报道有提示雌激素增加宫颈癌的发生,也有提示对宫颈癌的发生无关。纵观众多的研究,但是未见关于雌激素对于宫颈癌转移和侵袭能力的相关影响的研究报道。本研究拟利用体外细胞培养技术,选择俩种研究最为广泛的宫颈癌细胞株HeLa细胞(宫颈腺癌来源)和SiHa细胞(宫颈鳞癌)为研究对象,在基因和蛋白水平检测关于侵袭能力的相关基因的变化,了解雌激素对宫颈癌的侵袭和转移是否有影响以及影响的可能机制。目的：探讨17β雌二醇对宫颈癌细胞株HeLa和SiHa生物学行为的影响,了解其可能机制方法：采用MTT法检测雌二醇对俩种细胞株增殖的影响；流式细胞仪检测雌二醇对俩种细胞株凋亡的影响；RT-PCR和实时定量PCR检测雌二醇对MMP2、MMP9及其抑制剂TIMP1、TIMP2表达的影响；明胶酶谱法检测雌二醇对俩种细胞株明胶酶分泌的影响；Transwell小室法检测雌二醇对其迁移和侵袭的影响。结果：10nM和100nM浓度的雌二醇显着促进HeLa细胞的增殖,而1nM浓度的雌二醇无明显促HeLa细胞增殖；雌二醇只是在100nM浓度有轻度促SiHa细胞增殖作用,而1nM和10nM无明显促SiHa细胞增殖作用。10nM雌二醇使HeLa细胞的晚期凋亡率和总凋亡率下降,而对早期凋亡率无显着影响,10nM雌二醇对SiHa细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率无明显影响,差异无显着性。RT-PCR和实时定量PCR结果显示HeLa细胞表达MMP9而不表达MMP2,SiHa细胞与之相反,并且使用雌二醇干预之后仍然如此；俩种细胞都表达TIMP1和TIMP2;雌二醇促进HeLa细胞MMP9的表达抑制TIMP2的表达；而雌二醇对SiHa无明显促进MMP2的表达,但是促进TIMP2的表达。明胶酶谱法结果显示HeLa细胞有MMP9的分泌而无MMP2的活性显示,而SiHa细胞分泌MMP而MMP9的活性显示；雌二醇可以促进HeLa细胞分泌MMP9但是对SiHa细胞MMP2的分泌活性无明显变化。Transwell小室检测结果显示雌二醇促进HeLa细胞的迁移和侵袭,但是对SiHa细胞的迁移和侵袭能力无显着影响。结论：雌二醇促进HeLa的增殖抑制其凋亡,高浓度雌二醇轻度促进SiHa细胞的增殖；雌二醇促进HeLa细胞的迁移和侵袭,可能是通过促进MMP9的表达抑制TIMP2的表达来实现。目的：建立肿瘤来源的微淋巴管内皮细胞的原代培养方法,并了解其对肿瘤细胞的相互影响。方法：(1)胶原酶消化新鲜卵巢肿瘤组织标本过滤得单细胞悬液,免疫磁珠分选法筛选LYVE-1阳性细胞贴壁培养。(2)应用免疫荧光法检测淋巴内皮细胞标记分子CD31,D2-40, LYVE-1和VEGFR3。(3)持续传代培养,观察其形态和增殖速度的变化。(4)结合临床资料分析影响培养效果的因素。结果：(1)免疫磁珠分选法可以成功分选出纯度较高的淋巴内皮细胞。(2)分选出来的细胞表达CD31,D2-40, LYVE-1和VEGFR3,其纯度可以达到90%以上。(3)原代培养的淋巴内皮细胞可以传代到7代以上,随着传代次数的增多,尤其是第5代以后细胞增殖明显变缓,细胞形态开始发生变化。传代到第七代细胞形态明显衰老,细胞空泡较多,生长缓慢(4)细胞培养成功的关键与肿瘤组织标本的类型和患者的年龄密切相关(p<0.05)。结论：免疫磁珠分选法可以分选出较纯的淋巴内皮细胞,性状稳定,可以用于后续的研究。
郑春花[6]2014年在《转录因子FOXC2在宫颈癌发生的研究》文中进行了进一步梳理子宫颈癌（cervical cancer）是女性生殖器最常见的恶性肿瘤，其发病率居高不下,每年新增宫颈癌病例1/3在中国，宫颈癌发病呈青年化趋势。特别严重困扰了中国中青年女性的生殖健康。2013年中国卫生和计划生育委员会发布的《2011中国卫生统计年鉴》统计，2010年中国城乡宫颈癌死亡率为2.45/10万~4.31/10万。因此早期发现、早期治疗宫颈癌能有效地延长病人生存期，降低病死率。大量的研究表明，人乳头瘤病毒（HPV）感染是宫颈癌最常见的发病因素，其感染率高达99.7%。但是HPV感染后到最终发展成宫颈癌是多阶段、多种途径、多分子因素综合作用的结果。近年来肿瘤发生的胚胎源性越来越受到重视，有研究已发现胚胎发育相关性基因Oct-4、Twist、VEGF-C、Wnt等在宫颈癌发生、发展中起重要作用。FOXC2是胚胎发生早期发挥重要作用的转录调控因子，与胚胎淋巴管的发生、血管的发生、形态塑建、结构分化密切相关。2007年国外有报道，FOXC2基因在乳腺癌细胞中易位表达，FOXC2蛋白能够使乳腺癌细胞获得间质形态，使细胞的迁移和侵袭能力增加。2011年又有文献报道，FOXC2与食道鳞癌的侵袭转移有关，FOXC2靶向RNA干扰可以降低食道鳞癌细胞的增殖迁移能力。因此，研究FOXC2在宫颈癌增殖与侵袭力、淋巴管形成上的作用和作用模式，探讨宫颈癌组织淋巴管发生机制，对解明宫颈癌发生过程、预防宫颈癌淋巴转移及发现新的肿瘤诊治方法有重要的意义。目的：本文通过分析FOXC2基因在子宫颈癌病变组织、宫颈癌细胞中的表达水平、siRNA靶向干扰宫颈癌细胞FOXC2基因表达对其生物学行为的影响等研究，试图探讨FOXC2在宫颈癌增殖与侵袭力、癌组织血管与淋巴管形成以及宫颈癌远处转移等方面上的作用及调控机制，以期发现新的预防宫颈癌远处转移和诊治靶点。方法：1、用免疫组织化学方法研究FOXC2在人正常宫颈组织、CIN以及宫颈癌中的表达模式，分析FOXC2表达与宫颈癌临床病变程度的相关性；2、在细胞水平用实时荧光PCR方法、Western Blot分析了人Hela、SiHa宫颈癌细胞及小鼠U14细胞中FOXC2表达模式；3、合成了FOXC2基因序列的siRNA表达载体，利用脂质体法转染入人Hela、SiHa宫颈癌细胞、小鼠U14宫颈癌细胞；4、用实时荧光PCR及Western Blot方法分析了FOXC2siRNA对宫颈癌细胞FOXC2基因表达的抑制作用；5、CCK8法分析干扰前后宫颈癌细胞增殖活性，用划痕法检测干扰前后宫颈癌细胞体外迁移能力的改变。结果：1、25%的正常宫颈组织表达低强度的FOXC2蛋白，65%的CIN病例宫颈组织表达中等强度的FOXC2蛋白；而91.8%的宫颈癌组织表达高强度的FOXC2蛋白，其中宫颈腺癌组织全部高强度表达FOXC2蛋白。2、宫颈鳞癌I期患者中FOXC2阳性表达率为88.5%，II期为100%，与正常宫颈及宫颈CIN患者比较差异显着，P<0.05。宫颈癌II期患者FOXC2表达强度高于I期患者FOXC2表达强度，两者均显着高于正常妇女，P<0.05。3、宫颈鳞癌癌灶中存在新生血管，其周边组织存在丰富的新生微淋巴管，均有FOXC2表达阳性。4、淋巴转移者癌组织FOXC2表达强度高于未发生淋巴转移者，但两组比较差异无显着性，P>0.05。5、人宫颈癌HeLa、SiHa细胞和小鼠宫颈癌U14细胞均高水平的表达FOXC2mRNA和FOXC2蛋白表达，各种细胞间FOXC2表达无明显差异。6、FOXC2-siRNA可抑制HeLa、SiHa和U14细胞FOXC2mRNA的表达，抑制率分别达到76.2%、75.7%和90.8%。7、FOXC2-siRNA完全抑制HeLa、SiHa细胞FOXC2蛋白的表达。8、FOXC2-siRNA作用48h后，Hela细胞增殖开始能力减弱；72h后Hela细胞和SiHa细胞增殖能力均明显减弱；U14细胞增殖能力也明显减弱。9、 FOXC2-siRNA作用24h后，HeLa、SiHa细胞侵袭能力均显着低于对照组（P<0.05）。结论：1、宫颈癌病变组织存在FOXC2蛋白，FOXC2蛋白的表达水平及表达强度与宫颈癌的病变程度呈正相关，证明FOXC2蛋白参与了宫颈癌的发生发展过程。2、FOXC2参与了宫颈鳞癌新生微血管和新生微淋巴管的形成，表明与宫颈鳞癌的远处转移有密切关系。3、FOXC2shRNA可抑制宫颈癌细胞的增殖能力。4、FOXC2shRNA可抑制宫颈癌细胞的体外迁移能力。5、FOXC2基因可能成为治疗宫颈癌的分子靶点。
陆琳[7]2007年在《角质细胞生长因子及受体在宫颈癌中的表达及作用研究》文中指出角质细胞生长因子KGF来源于人肺成纤维细胞，属成纤维母细胞生长因子家族成员。它由间质细胞产生，并通过旁分泌方式作用于上皮细胞表面的角质细胞生长因子受体KGFR,刺激上皮细胞有丝分裂和分化。KGFR位于上皮细胞内，具有酪氨酸激酶活性，是FGFR2的剪接变体，即FGFR2Ⅲb。它可与FGF1、FGF3、KGF、FGF10结合而发挥其生理效能。研究发现KGF、KGFR与一系列上皮源性肿瘤的发生发展有关，它们参与肿瘤细胞增殖、迁移及抑制肿瘤细胞凋亡等活动。近年国外有文献报道在宫颈癌上皮细胞中KGF／KGFR的表达较正常宫颈上皮细胞中的表达明显增高，推测其可能与宫颈癌的发生发展有关。目前国内外普遍认为人乳头瘤病毒(HPV)与宫颈上皮内瘤变及宫颈癌密切相关。临床上发现，HPV感染会引起宫颈发生程度不一的各种病变，但仅有部分感染这些病毒的患者最终发展为宫颈癌。因此，宫颈癌的发生发展除HPV感染为主要的病因外，还有其它多种因素的参与。在一些肿瘤的研究中发现KGF／KGFR能促使肿瘤细胞的增殖、迁移并抑制肿瘤细胞凋亡。在宫颈癌上皮组织中KGF／KGFR是否有高表达?目前文献报道较少；KGF／KGFR在宫颈癌中的作用，对宫颈癌细胞的增殖、迁移、凋亡是否有影响，还未见文献报道。本课题就KGF、KGFR与宫颈癌的关系作一探讨。目的：确定角质细胞生长因子(KGF)及其受体(KGFR)在正常宫颈组织、宫颈癌组织、Hela、CaSki细胞中有无表达；了解KGF、KGFR对Hela、CaSki细胞增殖、迁移、凋亡有无影响。方法：1、采用免疫组织化学方法分别对正常宫颈组织(22例)和宫颈癌组织(31例)中KGF、KGFR的表达进行测定，比较正常宫颈组织和宫颈癌组织中KGF、KGFR的表达有无差异。2、采用半定量PCR方法在mRNA水平确定KGF/KGFR在Hela细胞和CaSki细胞中的表达；采用ELISA、Western blot方法在蛋白水平分别测定KGF、KGFR在Hela、CaSki细胞中的表达。3、~3H-TdR掺入试验测定人重组KGF对Hela、CaSki细胞、增殖的影响；~3H-TdR掺入试验、MTT测定KGF抗体、KGFR抗体对Hela、CaSki细胞增殖的影响。4、Millicell小室测定法测定人重组KGF、KGF抗体、KGFR抗体对Hela、CaSki细胞迁移的影响。5、流式细胞术、~3H-TdR掺入试验检测KGF对顺铂诱导Hela细胞凋亡的影响。结果：1、正常宫颈上皮细胞无KGF和KGFR表达，但宫颈癌上皮细胞中KGF和KGFR表达明显，二者在宫颈癌上皮细胞中的表达率分别为45％和71％；在Ⅱa期宫颈癌中KGF、KGFR的阳性表达率高于原位癌(P＜0.05)，但Ⅰb期宫颈癌与原位癌及Ⅰb期和Ⅱa期宫颈癌中KGF、KGFR的表达在统计学上无差异(P＞0.05)。宫颈癌出现深部间质浸润时KGF、KGFR的阳性表达率高于浅部间质浸润者(P＜0.05)；KGF在低分化宫颈癌上皮细胞中的阳性表达率高于中、高分化宫颈癌(P＜0.05)；KGFR在低分化宫颈癌上皮细胞中的表达与高、中分化的宫颈癌相比，无统计学差异(P＞0.05)；KGF与KGFR之间的表达呈正相关(r=0.9988，P＜0.05)；在正常宫颈间质及宫颈癌间质中有少量KGF和KGFR表达，经统计学处理，二者表达无差异(P＞0.05)．2、在mRNA水平、蛋白水平证实KGF及KGFR在Hela、CaSki细胞中均有表达：RT-PCR测得Hela、CaSki细胞中KGF在143bp左右有特异条带，KGFR在152bp左右有特异条带；Hela细胞中KGF蛋白表达量为1.57±0.12pg/μg，CaSki细胞中KGF蛋白表达量为1.20±O.11pg/μg；Western blot测得Hela、CaSki细胞KGFR在蛋白水平有表达：在105KD处有清晰条带。说明KGF在Hela、CaSki细胞中有自分泌现象。3、KGF、KGFR对Hela，CaSki细胞增殖的影响：人重组KGF因子能使Hela、CaSki细胞增殖增强，并呈现一定的剂量依赖性。在加入人重组KGF因子浓度为50ng/ml和lOOng/ml两组中，Hela、CaSki细胞的增殖与对照组相比差异显着(P＜0．05)；而加入2μg/ml KGF抗体和KGFR抗体后则能抑制Hela、CaSki细胞增殖，与对照组相比存在差异(P＜0.05)。4、KGF、KGFR对Hela、CaSki细胞迁移的影响：在相同时间内，加入KGF 50ng/ml能使Millicell-PCF聚碳酸酯微孔膜下层的Hela、CaSki细胞数与对照组相比增多(P＜0．05)；而加入2μg/ml KGF抗体和KGFR抗体后，聚碳酸酯微孔膜下层的Hela、CaSki细胞数与对照组相比减少(P＜0.05)；说明KGF能促使Hela CaSki细胞迁移，而且KGF对CaSki细胞迁移的影响大于Hela细胞；KGF抗体、KGFR抗体可抑制Hela CaSki细胞的迁移。5、KGF对Hela细胞凋亡的影响：经顺铂10μg/ml或KGFl00ng/ml+顺铂10μg/ml处理的两组Hela细胞，前者细胞凋亡率为20％；后者为10％，后者亚G1期峰明显低于顺铂单独处理组，提示KGF抑制了顺铂对Hela细胞的凋亡作用。~3H-TdR掺入试验发现KGF 100ng/ml+顺铂10μg/ml组与顺铂10μg/ml组相比前者能使顺铂对Hela细胞的凋亡作用减弱，证明KGF可抑制顺铂对Hela细胞的凋亡作用。结论：1、在正常宫颈上皮细胞中KGF和KGFR的表达为阴性，在宫颈癌上皮细胞中KGF、KGFR的表达为阳性，KGF的表达与KGFR的表达存在正相关，KGF、KGFR的表达与宫颈癌间质浸润深度、临床分期有关，KGF在低分化宫颈癌上皮细胞中的表达高于高中分化宫颈癌，这些结果均提示KGF与KGFR可能与宫颈癌的增殖、侵袭有关。2、在mRNA水平和蛋白水平证实KGF、KGFR在Hela、CaSki细胞中同时有表达，说明Hela、CaSki细胞能自分泌KGF。3、外源性KGF、自分泌KGF及KGFR对Hela、CaSki细胞增殖、迁移均有影响，KGF对Hela细胞的凋亡有影响；由此推测KGF、KGFR在宫颈癌的发生发展中可能起了一定作用。
张玫[8]2007年在《他莫西芬对子宫内膜作用及其机制的研究》文中研究表明目的观察他莫西芬对成年去势和未去势SD大鼠子宫内膜的影响，以及他莫西芬对乳腺癌细胞、宫颈癌细胞和子宫内膜癌细胞的不同作用，为揭示他莫西芬导致子宫内膜病变的发生机制提供帮助，为寻找开发更有效、副作用更小的选择性雌激素受体调节剂提供理论依据，同时也为预防和治疗他莫西芬所导致的子宫内膜病变提供参考。方法本实验以去势和未去势的SD大鼠作为研究对象，通过光镜、电镜的观察，免疫组化，凋亡检测以及Westen blot等方法，在整体动物水平研究他莫西芬对子宫内膜的影响。通过MTT、免疫荧光以及流式细胞术等方法探讨他莫西芬在不同剂量下对人类乳腺癌细胞、宫颈癌细胞和子宫内膜癌细胞的不同影响。结果1、他莫西芬在50mg·kg~(-1)剂量下连续给药28天，对大鼠有一般毒性，可以使大鼠体重下降、脱毛和子宫内膜出现形态学改变。2、对于未去势大鼠，他莫西芬可以降低子宫湿重和子宫系数，可以降低血清雌激素水平。对于去势大鼠，他莫西芬可以增加子宫湿重和子宫系数，可以提高血清雌激素水平。另外，他莫西芬可以降低血清孕激素水平和降低大鼠子宫内膜ERβ的表达但对ERα的表达没有明显影响。他莫西芬可以显著增加PR的表达。3、他莫西芬有减少未去势大鼠子宫内膜细胞PCNA表达而增加去势大鼠PCNA表达的趋势。但无论去势与否，他莫西芬都可以显着地抑制其子宫内膜细胞的凋亡。4、他莫西芬可以显着抑制MCF-7细胞的增殖。在高浓度时也可以抑制ISK细胞和Hela细胞的增殖，但在浓度小于1×10~(-6)mol·L~(-1)时则刺激两种细胞的生长。他莫西芬可以影响MCF-7细胞的周期并诱导其凋亡，对Hela细胞和ISK细胞的周期没有明显影响，可以轻度抑制ISK细胞凋亡。免疫荧光结果显示他莫西芬可以降低MCF-7细胞bcl-2的表达，增加Bax的表达，而对于Hela细胞和ISK细胞则是相反的结果。结论1、他莫西芬50mg·kg~(-1)连续给药28天，对去势和未去势SD大鼠有一般的毒作用影响。光镜和电镜下子宫内膜有明显改变。2、他莫西芬在不同雌激素水平机体内的作用不同。在高雌激素水平时，他莫西芬产生拮抗雌激素效应，表现出降低血清雌激素含量和抑制子宫内膜细胞增殖；在低雌激素水平时，他莫西芬产生激动雌激素效应，表现出增加血清雌激素含量和促使子宫内膜细胞过度生长。3、他莫西芬对大鼠子宫内膜的刺激作用主要是抑制细胞凋亡而不是促进细胞增殖。4、体外实验证明，他莫西芬对不同组织来源的肿瘤细胞具有不同效应。对乳腺癌细胞，他莫西芬抑制其增殖诱导其凋亡。对子宫内膜癌细胞和宫颈癌细胞，他莫西芬呈双重作用，高浓度时抑制细胞增殖，低浓度时刺激其生长并且可以轻度抑制其凋亡。他莫西芬主要通过对凋亡相关基因表达的改变影响细胞增殖和凋亡。
罗丽萍[9]2008年在《雷公藤内脂醇对体外培养的人上皮性卵巢癌耐顺铂细胞株（COC_1/DDP）的活性的影响》文中认为目的:本实验旨用不同浓度雷公藤内脂醇对人上皮性卵巢癌耐顺铂细胞株(COC_1/DDP)进行干预,观察其对体外培养的COC_1/DDP活性的影响及作用时间和量效关系。以期寻找对耐顺铂治疗的上皮性卵巢癌病人的有效治疗药物。方法:1 COC_1/DDP细胞的传代培养:COC_1/DDP细胞用COC_1/DDP完全培养基培养,将细胞密度调整至5×10~5/ml ,置培养瓶中,在37℃、5%CO_2,饱和湿度条件下于恒温培养箱内培养。每2~3天细胞长满后,吹打后制成单细胞悬液,离心1000r/min 10min,弃上清液,更换COC_1/DDP完全培养基,按5×10~5/ml密度补充液体容量至7ml接种到培养瓶内。2 COC_1/DDP细胞的生长曲线测定:取对数生长期细胞5×10~5/ml置于24孔板中,在37℃、5%CO2,饱和湿度条件下于恒温培养箱内培养5d,每天取叁孔细胞,以台盼蓝法计算单位活细胞数量,并取平均值。以细胞密度为纵轴,以时间为横轴绘制COC_1/DDP细胞生长曲线图。通过生长曲线,可以显示COC_1/DDP细胞的生长周期,确定最佳干预时间。3雷公藤内脂醇对COC_1/DDP细胞增殖的影响:雷公藤内脂醇作用组用不同浓度雷公藤内脂醇(1ng/ml、3ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、75ng/ml、100ng/ml)干预,分为8个浓度雷公藤内脂醇作用组;空白对照组用COC_1/DDP细胞完全培养基干预,分别作用COC_1/DDP细胞24h、48h、72h,之后用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测每孔光吸收值(OD值)的大小可反映细胞的数量及活性,OD值越高则细胞活性越强。结果可反映雷公藤内脂醇对COC_1/DDP细胞增殖的影响,同时计算细胞抑制率及IC50值(IC50值即细胞存活率为≤50%时的药物浓度,表示药物的细胞毒性)。4雷公藤内脂醇对COC_1/DDP细胞形态及超微结构的改变:通过倒置显微镜及透射电子显微镜下观察了空白对照组(COC_1/DDP细胞专用培养基)、低浓度雷公藤组(3ng/ml)与高浓度雷公藤组(50ng/ml)作用48h后,COC_1/DDP细胞的细胞形态及超微结构的改变。结果:1体外培养的COC_1/DDP细胞的生长曲线:观察COC_1/DDP细胞的生长曲线,第1、2、3天,细胞增殖活跃,第叁天后细胞增殖进入平台期,之后因生长空间限制而导致细胞密度过大及营养相对缺乏的原因,细胞量缓慢减少。2雷公藤内酯醇对COC_1/DDP细胞增殖的影响:结果可见雷公藤内酯醇对COC_1/DDP细胞的抑制作用呈剂量和时间依赖性。从3ng/ml到100 ng/ml的雷公藤内酯醇均可明显抑制COC_1/DDP细胞的生长增殖,其药物作用48h后的IC50为药51.76ng/ml,药物作用72h后的IC50为10.78ng/ml。3雷公藤内脂醇对COC_1/DDP细胞形态及超微结构的影响:3.1雷公藤内脂醇作用后COC_1/DDP细胞形态的改变:通过倒置显微镜可见空白对照组COC_1/DDP细胞生长良好;低浓度雷公藤内脂醇组COC_1/DDP细胞分裂状及成串细胞团减少,细胞变扁平,透光性减少,细胞数量较空白对照组减少;高浓度雷公藤内脂醇组COC_1/DDP细胞细胞形态多样化,胞浆内颗粒增多,COC_1/DDP细胞数量及细胞密度较低浓度雷公藤内脂醇组更为减少3.2雷公藤内脂醇作用后COC_1/DDP细胞超微结构的改变:3.2.1空白对照组通过透射电子显微镜观察COC_1/DDP细胞形态及超微结构的改变,可见空白对照组COC_1/DDP呈椭圆形,细胞核为卵圆形,染色质丰富;3.2.2低浓度雷公藤内脂醇组可见部分COC_1/DDP细胞体积较大,呈多角形,细胞膜微绒毛较空白对照组细胞明显减少,细胞核较空白对照组变大、内有包含物,染色质聚集、固缩、碎裂、溶解,核膜内陷,细胞质内有空泡形成,线粒体的数目及形状改变,高尔基体碎裂等细胞衰老改变;3.2.3高浓度雷公藤内脂醇组COC_1/DDP细胞膜完整,细胞膜表面微绒毛消失,细胞器较空白对照组增多,如线粒体增多,内质网扩张,有些细胞膜皱缩,胞质浓缩,核团聚。多数细胞可见细胞核染色质聚集成团块状、新月状,并凝聚在核膜周边。有调亡小体生成的典型细胞凋亡改变呈现。结论:1雷公藤内脂醇对体外培养的COC_1/DDP细胞有明显的抑制作用,其浓度自3ng/ml开始有明显抑制作用,并与时间及药物浓度依赖性,药物作用48h后的IC50为药51.76ng/ml,药物作用72h后的IC50为10.78ng/ml。2低浓度及高浓度雷公藤内脂醇对COC_1/DDP细胞均有明显抑制作用,其抑制作用的机制可能与其诱导COC_1/DDP细胞衰老及细胞凋亡有关。3本研究以COC_1/DDP为体外实验模型,发现雷公藤内脂醇对COC_1/DDP细胞有明显的抑制作用,为寻找耐顺铂卵巢癌的有效治疗药物提供了信息,为雷公藤内脂醇成为耐顺铂卵巢癌的有效治疗药物提供了体外实验基础。
佚名[10]2008年在《妇科肿瘤》文中提出081512沙培林在宫颈癌术中应用的近期临床观察/王俊杰…∥中国肿瘤临床与康复·—2008,15(3)·—222~223目的:探讨沙培林在宫颈癌术中应用的临床效果。方法:40例宫颈癌手术治疗的患者分为沙培林治疗组(20例)和对照组(20例),观察近期临床
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