奶牛冠状病毒的分子检测、基因组特征及ELISA试剂盒的研制

论文摘要

牛冠状病毒（Bovine Coronavirus,BCoV）主要引起新生犊牛腹泻、成年牛冬季腹泻和牛呼吸道疾病,在全球范围内造成了严重的经济损失。血清流行病学资料显示国内BCoV阳性率高且分布广泛,但关于BCoV的病原流行病学资料欠缺。本研究的目的是开展国内部分地区奶牛BCoV分子检测及基因组研究,同时研制基于重组N蛋白间接ELISA抗体检测试剂盒,取得如下成果:1.国内部分省区奶牛冠状病毒的分子检测2017年9月到2018年5月,采集了6省14个奶牛场的190份犊牛腹泻粪便样本,采用特异性RT-PCR方法检测BCoV的阳性率,并选取代表性样本同时克隆纤突蛋白（S）、血凝素/酯酶蛋白（HE）、核衣壳蛋白（N）和跨膜蛋白（M）的完整基因,分析其分子特征。结果表明,BCoV的检测率为18.95%,场阳性率为92.86%（13/14）,表明BCoV在采样省区的奶牛中广泛流行;从4个省8个牛场的13个阳性样本中同时成功扩增出完整的S、HE、N和M基因,与GenBank中的全部163条完整BCoV S基因相比,本实验克隆的12条序列和中国其它13个毒株（12株牦牛和1株奶牛）在进化树上聚为独立一大支,且在S2亚基上均具有相同的氨基酸突变（N1192Y）;另外1条S基因与3个美国BCoV毒株独立聚为一小支。与GenBank中的115条完整BCoV HE基因相比,本实验克隆的10条和中国其它2个毒株（1株牦牛和1株奶牛）在进化树上聚为独立一大支,在HE的R2-loop上具有1个相同的氨基酸突变（F181V）。值得注意的是,13株毒株中有10株被鉴定为HE重组毒株且重组事件相同,重组区域位于HE酯酶和凝集素结构域之间,可能对HE的受体结合功能产生影响;并且这10株重组毒株来自4个省8个牛场,表明这种重组毒株已在国内广泛流行。这是首次在奶牛中发现BCoV HE重组事件,也是首次在国内对奶牛BCoV进行分子检测,有助于进一步了解BCoV的流行和遗传进化,为国内奶牛腹泻的防控提供了重要参考。2.奶牛冠状病毒的基因组研究为进一步研究奶牛BCoV HE重组毒株的分子特征,根据GenBank中公布BCoV基因序列设计了44对引物,扩增BCoV SWUN/A10/2018分离株的基因序列,使用SEQMAN软件（version 7.0;DNASTAR Inc.,WI,USA）组装病毒基因组,分析其基因组特征。结果表明,该毒株完整基因组全长为31028 bp,G+C%的含量为37.0%。该分离株与GenBank中唯一的国内BCoV毒株AKS-01遗传关系最近,其核苷酸和氨基酸的相似性分别为99.0%和98.3%。与已知的全部177个BCoV完整S基因（包括本研究克隆的13个完整的S基因）相比,该毒株在S1区有一个独特的氨基酸突变（G411A）。该毒株HE基因在酯酶和凝集素结构域发生重组,并且在受体结合域R3-loop上有12个核苷酸的插入导致4个氨基酸插入。基于BCoV HE血凝素酯酶的晶体结构建立的3D模型显示,该毒株在R结构域与已知BCoV毒株相比变化明显。鉴于BCoV HE基因在病毒感染过程中参与受体识别和诱导中和抗体的产生,这种HE基因独特的变化可能对其功能的产生影响。这是首次发现BCoV HE基因受体结合域的氨基酸插入事件,对深入了解牛BCoV的遗传进化有重要意义。3.基于重组N蛋白检测BCoV抗体的间接ELISA试剂盒的研制对国内BCoV流行毒株N基因序列进行大肠杆菌的密码子偏好性优化,合成两端增加酶切位点BamH1和Xho1的N基因编码框序列,构建了pET28H表达质粒,转化Rosetta（DE3）中进行了表达。结果表明,BCoV N基因在DE3表达系统中获得了高效表达,Western blot检测证明重组N蛋白具有良好的反应原性。以纯化的N蛋白作为包被抗原,通过反应体系和反应条件的优化,成功建立了基于重组N蛋白的间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性和稳定性,灵敏度高。在此基础上组装的试剂盒与瑞典Svanova公司商品化冠状病毒抗体检测试剂盒的符合率为100%。对来自川西北571份牦牛血清进行了BCoV抗体检测,阳性率为98.1%,表明川西北牦牛的BCoV感染非常普遍,为牦牛腹泻的防控提供了参考。

论文目录

摘要

Abstract

第一章牛冠状病毒流行特征及其S和HE基因的研究进展

1 牛冠状病毒的流行情况

1.1 牛冠状病毒引起的新生犊牛腹泻

1.2 牛冠状病毒引起的成年牛冬痢疾

1.3 牛冠状病毒引起的牛呼吸道疾病

1.4 牛冠状病毒国内外的流行情况

1.5 牛冠状病毒跨中间传播

2 牛冠状病毒S蛋白的研究进展

2.1 牛冠状病毒S蛋白的分子特征

2.2 牛冠状病毒S蛋白的功能

3 牛冠状病毒HE蛋白的研究进展

3.1 牛冠状病毒HE蛋白的起源

3.2 牛冠状病毒HE蛋白的分子特征

3.3 牛冠状病毒HE蛋白功能

4 小结

第二章国内部分省区奶牛冠状病毒分子检测

1 材料与方法

1.1 临床样本

1.2 试验仪器

1.3 主要试剂

1.4 引物的设计与合成

1.5 RNA的提取与c DNA的合成

1.6 BCoV阳性质粒的制备

1.7 PCR扩增与测序

1.8 序列的拼接及进化关系分析

2 结果

2018 年中国部分省区奶牛BCo V分子流行学调查'> 2.1 2017 ²018 年中国部分省区奶牛BCo V分子流行学调查

2.2 BCoV S、HE、N和 M完整基因的克隆结果

2.3 BCoV S、HE、N和 M基因序列、系统发育和重组分析结果

3 讨论

3.1 部分省区奶牛BCoV的病原流行病学

3.2 BCoV S、HE、N和 M基因的分子特征

4 小结

第三章奶牛冠状病毒SWUN/A10/2018 的基因组研究

1 材料和方法

1.1 病毒样本

1.2 主要仪器

1.3 主要试剂

1.4 引物的设计与合成

1.5 病毒RNA的提取与c DNA的合成

1.6 BCoV阳性质粒的制备

1.7 PCR扩增与测序

1.8 全基因序列的拼接及分析

2 结果

2.1 分离株SWUN/A10/2018 基因组序列及结构特征

2.2 分离株SWUN/A10/2018 毒株S基因分子特征

2.3 分离株SWUN/A10/2018 毒株HE基因分子特征

2.4 分离株SWUN/A10/2018 毒株N、M和 E基因分子特征

2.5 分离株SWUN/A10/2018 毒株ORF1a和 ORF1b基因分子特征

3 讨论

3.1 SWUN/A10/2018 基因组特征

3.2 SWUN/A10/2018 S基因的分子特征

3.3 SWUN/A10/2018 HE基因变异

4 小结

第四章基于重组N蛋白检测BCoV抗体的间接ELISA试剂盒的研发

1 材料和方法

1.1 主要质粒、试验用血清

1.2 主要仪器

1.3 主要试剂

1.4 BCoV重组N蛋白的表达

1.5 基于重组N蛋白间接ELISA检测方法条件的优化

1.6 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定

1.7 基于重组N蛋白间接ELISA检测方法的评价

1.8 试剂盒的组装

1.9 对川西北牦牛血清BCo V流行病学调查

2 结果

2.1 重组原核表达载体的构建结果

2.2 重组质粒在大肠杆菌中的表达及SDS-PAGE凝胶电泳结果

2.3 表达蛋白的回收、纯化及Western blot鉴定结果

2.4 基于重组N蛋白间接ELISA检测方法条件的优化结果

2.5 间接ELISA方法阴阳性临界值的确定结果

2.6 基于重组N蛋白间接ELISA检测方法的评价结果

2.7 试剂盒的组装结果

2.8 对川西北牦牛血清BCo V流行病学调查结果

3 讨论

3.1 BCoV的间接ELISA方法

3.2 BCoV的重组N蛋白的表达

3.3 基于重组N蛋白检测BCo V抗体的间接ELISA方法的建立

4 小节

结论及创新

参考文献

作者在攻读硕士学位期间发表的论文

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 阿比克哈莫（Keha ABI）

导师: 汤承

关键词: 牛冠状病毒,奶牛,分子检测,基因组,变异,间接

来源: 西南民族大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西南民族大学

基金: “十三五”国家重点研发计划—牛羊重要疫病病原体分子检测新技术研究(2016YFD0500907),四川省肉牛创新团队——现代繁殖技术研究与示范岗位团队,四川省应用基础项目(2017JY0066)

分类号: S852.653

DOI: 10.27417/d.cnki.gxnmc.2019.000048

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