辅助成分蛋白酶和柱状内含体蛋白在马铃薯Y病毒病症状形成过程中的作用机制

论文摘要

马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）是最大的植物RNA病毒属—马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的代表种,其基因组编码两个开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,在自身蛋白酶的作用下切割成11个成熟蛋白,其中,辅助成分蛋白酶（Helper component proteinase,HCpro）参与病毒的复制、RNA沉默抑制、蚜虫传毒和症状形成等重要生命过程。圆柱状内含体蛋白（Cytoplasmic inclusion protein,CI）在病毒侵染的细胞中形成的风轮状内含体是马铃薯Y病毒科Potyviridae病毒鉴定的重要特征,同时参与病毒复制、细胞间移动和症状形成等过程。HCpro与CI参与症状形成过程,但具体机制还不清楚。研究表明HCpro的三维结构与抗性基因的识别密切相关,暗示HCpro三维结构在病毒症状形成过程中具有重要作用。对CI编码的氨基酸序列分析发现PVY CI的C端存在真核生物翻译起始因子eIF4E的潜在结合基序:YxxxxLΦ基序。为研究HCpro和CI在症状形成过程中的作用,本研究在PVYN605侵染性克隆基础上,分别将HCpro不同位置插入标签序列,分析HCpro三维结构与症状之间的关系,通过定点突变技术突变YxxxxLΦ基序中保守位点鉴定该基序在病毒症状形成过程中作用。具体结果如下:（1）HCpro结构变化影响PVY症状形成。N端与中心区域对PVY的症状形成的影响更大。在PVYN605侵染性克隆基础上,将标签序列IDAGGS分别插入HCpro的N端区域、中心区域和C端区域氨基酸S1S2、I252V253和L313V314,获得PVY-HCS1-S2、PVY-HCI252-V253、PVY-HCL313-V314突变体。通过农杆菌浸润的方法将野生型及其突变体病毒接种本氏烟。结果显示,所有的突变体均能够系统侵染本氏烟。接种4天后PVY-HCS1-S2突变体能够移动到系统叶片;接种后25天,与PVY野生型病毒相比,接种PVY-HCS1-S2突变体引起寄主系统叶片严重皱缩,植株明显矮化。接种4天后,未能在本氏烟系统叶片检测到PVY-HCI252-V253突变体,但接种后25天可在系统叶片观察到绿色荧光。接种突变体PVY-HCL313-V31425天后本氏烟的症状与野生型相比无显著差异。（2）在HCpro不同区域插入标签序列影响HCpro抑制沉默能力。将标签序列IDAGGS分别插入瞬时表达载体pCa-35S:HCpro的N端区域、中心区域和C端区域氨基酸S1S2、I252V253和L313V314,获得野生型HCpro及突变体HCproS1-S2、HCproI252-V253、HCproL313-V314的瞬时表达载体。抑制RNA沉默试验结果显示,与野生型相比,突变体HCproS1-S2抑制RNA沉默能力增强,突变体HCproI252-V253抑制RNA沉默能力显著减弱,突变体HCproL313-V314的抑制RNA沉默能力与野生型相比无明显差异,表明HCpro不同区域的特定结构或序列在抑制RNA沉默过程中具有重要作用。（3）突变CI中YxxxxLΦ基序影响PVY的症状形成。将PVY CI中潜在的eIF4E识别基序YxxxxLΦ基序中保守位点Y、L突变为A,获得PVY-CIY513AL518A突变体。通过农杆菌浸润方法分别接种本氏烟、普通烟,结果显示,与野生型相比,PVY-CIY513AL518A突变体病毒RNA和蛋白积累水平降低,病毒扩散能力减弱。（4）未发现CI中YxxxxLΦ基序与eIF4E互作的充分证据。已有研究表明YxxxxLΦ基序普遍存在于eIF4E互作蛋白中。构建含野生型PVY-CI与及突变体CIY513AL518A全长编码序列,和CI及突变体CIY513AL518AC端的酵母表达载体,结果未发现CI通过YxxxxLΦ基序与eIF4E、eIF（iso）4E互作证据。构建CI及突变体CIY513AL518A、eIF4E、eIF（iso）4E的BiFC载体,结果发现CI及突变体CIY513AL518A均与eIF4E体内存在互作。

论文目录

缩略词表

中文摘要

英文摘要

1 前言

1.1 马铃薯Y病毒（PVY）的研究进展

1.1.1 分布及危害

1.1.2 基因组结构

1.2 辅助成分蛋白酶HCpro

1.2.1 HCpro功能域的划分

1.2.2 HCpro参与马铃薯Y病毒属病毒症状形成

1.2.3 HCpro是抑制RNA沉默的关键病毒蛋白

1.2.4 病毒蛋白三维结构影响病毒症状形成

1.3 柱状内含体蛋白CI

1.3.1 CI参与马铃薯Y病毒属病毒症状形成

1.3.2 CI与寄主蛋白的互作

1.4 真核生物翻译起始因子eIF4E

1.4.1 eIF4E的功能

1.4.2 eIF4E与病毒蛋白互作影响病毒症状形成

1.5 研究蛋白互作的方法

1.5.1 酵母双杂交

1.5.2 双分子荧光互补

1.6 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料与试剂

2.1.1 供试植物

2.1.2 侵染性克隆及菌株

2.1.3 所用试剂及溶液

2.1.4 引物合成及测序分析

2.1.5 主要实验仪器

2.2 实验方法

2.2.1 马铃薯Y病毒HCpro突变体的构建

2.2.2 马铃薯Y病毒HCpro同源重组载体的构建

2.2.3 农杆菌感受态细胞GV3101 的制备及转化

2.2.4 农杆菌浸润接种寄主植物

2.2.5 荧光定量PCR检测基因表达水平

2.2.6 蛋白表达水平的检测

2.2.7 CI互作蛋白的筛选与鉴定

2.2.8 蛋白互作的验证

3 结果与分析

3.1 HCpro结构在PVY症状形成过程中的作用

3.1.1 IDAGGS标签的插入影响HCpro结构

3.1.2 改变HCpro结构影响PVY症状

3.1.3 突变HCpro对其沉默抑制能力的影响

3.2 CI Yxxxx LΦ基序在PVY侵染过程中的作用

3.2.1 CI Yxxxx LΦ基序对PVY病毒症状形成的影响

3.2.2 突变CI Yxxxx LΦ基序降低PVY病毒蛋白积累水平

3.2.3 突变CI Yxxxx LΦ基序减弱PVY病毒扩散能力

3.2.4 突变CI Yxxxx LΦ基序降低PVY病毒RNA积累水平

3.2.5 CI Yxxxx LΦ基序对PVY-CI与 NbeIF4E互作的影响

3.2.6 与CI互作的相关寄主蛋白的获得

4 讨论

5 结论

6 参考文献

7 附录

8 致谢

9 攻读硕士学位期间发表论文情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 栾雅梦

导师: 田延平

关键词: 马铃薯病毒,沉默抑制,基序,症状决定

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,植物保护

单位: 山东农业大学

分类号: S432.41

总页数: 77

文件大小: 3635K

下载量: 55

辅助成分蛋白酶和柱状内含体蛋白在马铃薯Y病毒病症状形成过程中的作用机制

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢