王志方[1]2003年在《猪促卵泡激素β亚基基因克隆及表达研究》文中研究说明猪促卵泡激素β亚基基因克隆及表达研究
廖鸣娟[2]2003年在《大熊猫等濒危动物FSH/LH和GH/GHR基因的克隆及其表达研究》文中研究指明野生动物是自然生态环境的重要组成部分，保护野生动物尤其是拯救濒危野生动物，对维持地球生态平衡和保持生物多样性具有重要意义。圈养人工繁殖，是移地保护濒危动物，增加动物种群数量的重要手段之一。但在圈养条件下，多数濒危动物繁殖率都较低，严重阻碍移地保护的进程。特别是大熊猫，其生殖能力和育幼能力高度特化，生殖率和幼仔存活率低已成为目前圈养繁殖面临的两大急待解决的问题。研究表明生殖率低与生殖轴系中的各种激素内分泌失调，尤其是促性腺激素(FSH和LH)分泌不足有关。幼仔存活率低则与出生幼仔先天发育不全，免疫系统发育尚不完善相关。至今关于大熊猫生殖力和幼仔存活率低的分子基础仍不清楚。因此，本研究针对以大熊猫为主的濒危动物繁殖率低的两大主要问题，以大熊猫、小熊猫和东北虎为研究对象，开展了在动物生长发育和生殖过程中发挥重要作用的促性腺激素(FSH/LH)、生长激素及其受体(GH/GHR)的基因克隆、序列分析和表达研究，并探讨了今后生物工程生产大熊猫等濒危动物FSH/LH和GH用于人工繁殖实践的意义和可能性。主要结果如下： 1．利用RT-PCR技术从垂体组织扩增出大熊猫促性腺激素α、FSHβ和LHβ亚基编码区序列，它们分别编码120、129和141氨基酸的前体蛋白质，预测的分子量分别为13.6kD，14.6kD和15kD。同源性分析表明叁个亚基的核苷酸和氨基酸序列与已报道的人、猪、牛、鼠和羊的序列高度同源(＞74％)。对位比较发现大熊猫序列也具有明显的氨基酸特异性，这些氨基酸是否会影响大熊猫FSH及LH的分子构型进而影响其功能、或最终引起大熊猫促性腺激素的分泌障碍则有待进一步的研究。 2．将构建的真核表达载体pcDNA/α分别与pcDNA/FSHβ和pcDNA/LHβ共转染COS7细胞，进行瞬时表达。RT-PCR检测，表明叁个亚基基因在COS7细胞中得到正常转录。体外生物学活性分析表明，表达的FSH和LH的培养液能有效刺激大鼠睾丸Sertoli和Leydig’s细胞产生雌二醇和睾酮，证实COS7表达的FSH和LH已被正确地装配和糖基化修饰，能从COS7细胞有效分泌，且具有天然FSH和LH相似的生物学活性。此结果为将来利用CHO细胞稳定表达获得大熊猫重组FSH和LH，并将它们应用于大熊猫人工繁殖的深入研究奠定基础。 3．构建大熊猫α，FSHβ和LHβ亚基基因的原核表达载体pGEX-α，pGEX-FSHβ和pGEX-LHβ，IPTG诱导后在BL21宿主菌中得到高效融合表达，表达的融合蛋白GST-α，GST-FSHβ和GST-LHβ的分子量分别约为36kD、38kD和41kD，并以不溶的包涵体形式存在于细胞中。无法直接用谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析柱纯化。为了在变性条件下亲和层析纯化表达蛋白，本浙江大学博士学位论文试验分别SM尿素和o.IM NaOH为溶剂，对溶解融合蛋白的条件进行了优化。结果发现尿素溶解的融合蛋白不能进一步纯化，而0.IM NaoH溶解的蛋白能得到一定程度的纯化。表明经0.IMNaoH溶解的融合蛋白能重折迭，从而能与层析柱上琼脂糖树脂结合而得到纯化，为进一步研究打下基础。4.克隆并测序小熊猫Q和LHp亚基的编码区序列，相似于大熊猫序列，它们也编码120和141个氨基酸的前体蛋白，预测的分子量分别为13.skD和巧.IkD，两种动物LH序列的同源性达到95%以上。根据小熊猫、大熊猫与其它10种代表性哺乳动物的序列构建的分子进化树，与传统的物种分类地位基本吻合;但a亚基基因分析表明，小熊猫和后兽亚纲分枝具有基因同源性与物种分类地位极不相符现象，推测哺乳动物尤其是后兽亚纲有袋类Q亚基的进化速度十分缓慢，其序列可能与哺乳动物的祖先Q亚基基因非常接近。本试验绘制的进化树也不支持“小熊猫与大熊猫归于同一科”的观点，从而为解决大、小熊猫的分类地位问题提供了又一分子生物学依据。5.与多数哺乳类动物相似，克隆的东北虎。、FsHp亚基的开放阅读框为363bp和393bp，编码120和129个氨基酸的蛋白，分子量为13.5山和14.7山。但LH旦亚基序列具明显特异性，编码142个氨基酸的前体蛋白，在信号肤部分比其它物种多一个Leu，其预测分子量为巧.1叨。在核昔酸和氨基酸水平，东北虎叁个亚基序列与其它物种相应序列也具有较高的同源性(64.7一96.6%)。6.FSH和LH在畜牧业生产中被广泛用于促发情和排卵，目前己在大熊猫、东北虎等濒危动物人工繁殖中得到试用，但是效果普遍较差，其原因不甚清楚，可能与所用异源激素的异质性有关，使用高同源性激素可能会产生更好的效果。本试验比较了克隆的大熊猫、东北虎及小熊猫FSH或LH亚基与人、鼠、羊、牛和猪哺乳动物相应序列，发现叁个物种序列都与猪的序列具有最高的同源性，提示猪促性腺激素可能是大熊猫、东北虎和小熊猫人工繁殖研究应用中外源性异种激素的最佳选择。7.克隆和分析了进化上较保守，并在生长发育、生殖和免疫调节中发挥重要作用的大熊猫GH栩届H)和GHR伽届HR)基因。结果显示，月届H cDNA编码26氨基酸的信号肤和190氨基酸的成熟肤。月届HR则编码638氨基酸的前体蛋白，由18氨基酸信号肤和620氨基酸成熟肤组成。同源性比较发现，大熊猫GH和GHR的核昔酸和氨基酸序列，与己报道哺乳动物相应序
吕学斌[3]2003年在《梅山猪LH-β基因克隆及其表达效应研究》文中指出鉴于LH-β是动物生殖和发育调节中十分关键的性激素，国内外对猪LH-β基因的研究甚少，尚未见到对其在体内外转基因表达及其对动物免疫和生殖系统的深入研究，因此，我们就梅山猪LH-β基因的克隆及其原核、真核表达和体内转基因表达对小鼠生殖和免疫系统作用和机理进行了较系统的研究，为研制畜用新型高效生殖调节基因制剂奠定坚实基础。 首先，我们率先克隆了优良高产地方猪种梅山猪LH-β基因。从梅山猪脑垂体样品提取RNA后，用RT-PCR的方法克隆获得了梅山猪LH-β基因，与其他地方来源于猪LH-β有98％同源，其开放阅读框长度为417bp，编码139个氨基酸残基，分子量为14.7kD，等电点为7.80，疏水氨基酸占55.4％，亲水氨基酸占31.7％，碱性氨基酸占7.9％，酸性氨基酸占5.0％。基因的1-31位核苷酸编码10个氨基酸残基的信号肽，31-448位核苷酸编码139个氨基酸残基的成熟片段。 第二，用DNA重组技术将已克隆的猪LH-β cDNA片断插入pGEX-1λT质粒，构建了猪LH-β基因的原核表达质粒pGPLH-β，转化大肠杆菌，以质粒PCR和BamHI、EcoRI双酶切筛选鉴定转化子，获得了含420bp插入克隆基因正确的重组子。以IPTG诱导融合蛋白表达，经RT-PCR检测发现420bp的特异性LH-β条带；通过SDS-PAGE分析，在43KD处出现GST-PLH-β融合蛋白条带，其表达量占总细菌蛋白量的23％，证明吕学斌:梅山猪LH一p基因的克隆及表达效应研究猪LH一日基因得到了正确转录和表达。提取纯化回收融合重组蛋白，并以重组蛋白免疫家兔，制备了特异性抗体滴度为25600抗猪LH一p的高免兔血清。 第叁，首次将克隆到的猪LH一p基因亚克隆到真核表达型载体VRIO20上，通过质粒PCR的方法在转化子中筛选阳性克隆，用BamHI、Bglll双酶切鉴定重组子。得到的重组真核表达质粒转染Cos7细胞株，RT一PCR检测猪LH一p。结果显示:通过质粒PCR和双酶切分析，得到猪LH一p基因以正确方向插入的重组真核表达质粒VPLH一p。重组质粒VPLH一p经脂质体介导转染Cos7细胞，培养不同时间后提取mRNA进行RT一PCR，发现转染细胞RNA中含有与LH一p基因对应的mRNA:这些结果表明己成功构建了PLH一p的真核表达质粒，能正确转录表达LH一p。 第四，为了探讨vPLH一p体内转基因表达对小鼠生殖和免疫系统的调节作用和机理，，我们首次制备阳离子脂质体包装VPLH一p质粒，与PMSG和hCG以及重组LH一旦蛋白分别肌肉注射小鼠，系统地研究了它们对小鼠的生殖和免疫机能的影响。实验结果发现:各实验组小鼠外周血液的免疫细胞数量均较对照组增多，在14天时差异显着(P<0 .05);血清IgG含量亦较对照小鼠明显增加，其中眺D、E、F组较突出。各实验组血清中LH和FSH的水平均比对照组升高，实验组之间差异不明显 (P>0.05)。实验组白鼠每窝产仔数及成活率均高于对照组，平均多1.4只，但各实验组间差异不显着〔p>0.05)。这些结果初步表明:本实验克隆构建的猪VPLH一p质粒、重组LH一p蛋白均能发挥明显的生殖生理调节作用，可较好地促进雌性动物的排卵、怀孕和正常产仔;并且对动物的免疫机能无不良影响，还表现出一定的免疫增强效应。阳离子脂质体分子包装VPLll一p质粒体内转染表达安全无毒副作用。本实验为进一步深入研究新型动物生殖生育调节墓因制剂、开辟高效安全、经济简便的促进动物繁殖的新途径奠定了良好的纂础。
李儒曙, 汪涛, 刘宇, 伍时达[4]2009年在《猪促卵泡激素α和β亚基基因的克隆及其重组腺病毒表达载体的构建》文中提出为探索人工制备猪促卵泡激素的可行性,从猪的脑垂体中抽提总RNA,通过RT-PCR方法,克隆了猪促卵泡激素α、β亚基基因,并将其分别定向插入腺病毒穿梭质粒中,通过转化BJ5183-AD-1细胞继而构建含有猪促卵泡激素α、β亚基基因的重组腺病毒质粒;将含有猪促卵泡激素α、β亚基基因的重组腺病毒质粒转染AD-293细胞,细胞产生病变,证实猪促卵泡激素α、β亚基基因重组腺病毒表达载体构建成功。
吴井生[5]2008年在《OPN和BMP15基因对小梅山猪产仔数的遗传效应研究》文中认为小梅山猪以其高繁殖力而闻名世界,猪的繁殖性状是一个重要的经济性状,繁殖性能的高低直接影响到养猪业的经济效益。有研究表明:OPN基因和BMP15基因是影响猪繁殖性能的候选基因。为此,本研究即以小梅山猪和大白猪作为研究对象,研究这两个基因的遗传变异情况以及对猪繁殖性能的影响,以期丰富这两个基因的研究内容,并探讨这两个基因在小梅山猪育种工作中的应用。1、本研究,根据GenBank上公布的猪OPN基因序列,设计6对引物进行PCR扩增,结果显示在P1位点上存在一个微卫星标记;利用PCR-SSCP技术检测其它5个位点,结果发现P3和P5位点上存在叁个突变,分别是430T↓431G→A,473G→A;402T→G。2、利用最小二乘分析法,研究OPN基因不同多态位点对猪产仔性能的影响。结果表明:P1位点上两个品种不同基因型母猪总产仔数和产活仔数存在显着差异(P<0.05),并呈现一定趋势DF>AD>BD;P3位点上,小梅山猪不同基因型经产母猪的总产仔数和产活仔数之间的差异达到显着水平,大白猪不同基因型二胎和经产母猪的差异也达到显着水平(P<0.05);P5位点上,两个品种不同基因型母猪总产仔数和产活仔数差异不显着(P>0.05)。3、根据GenBank上公布的猪BMP15基因序列,设计P7和P8两对引物,利用PCR-RFLP技术检测其多态性。结果表明:P7引物扩增片段内没有检测到多态位点,P8引物的扩增片段内检测到1处突变,是猪BMP15基因外显子2第62位T→A突变,该突变能导致限制性内切酶Bcu I酶切位点发生改变,并且检测到猪BMP15基因的叁种基因型BMP15AA、BMP15~(AB)和BMP15~(BB)。4、利用PCR-RFLP技术,对小梅山猪和大白猪的BMP15基因进行分子扫描。结果表明BMP15基因在这两个品种间基因频率和基因型频率存在显着差异,与国内外研究结果相一致。5、利用最小二乘分析法,研究了猪BMP15基因对猪产仔性能的影响,结果表明两个品种不同基因型母猪的总产仔数和产活仔数存在显着差异,并有AA>AB>BB的趋势。综合考虑,认为A基因为提高产仔数的有利基因,AA基因型为有利基因型。
蒋晓玲[6]2011年在《猪下丘脑—垂体—甲状腺轴五个关键基因的研究》文中研究表明候选基因鉴定法是分析数量性状基因的重要方法。本论文以在机体物质与能量代谢、个体生长发育调控中发挥重要作用的下丘脑-垂体-甲状腺轴五个关键调控基因：促甲状腺激素释放激素前体TRH基因、促甲状腺激素释放激素受体TRHR基因、组成促甲状腺激素的糖蛋白激素共同亚基CGA基因和促甲状腺激素β亚基TSHB基因,以及促甲状腺激素受体TSHR基因为研究对象,应用生物信息学、辐射杂交细胞系定位技术、3'RACE、实时荧光定量RT-PCR、PCR-RFLP、四引物ARMS-PCR等技术对HPT轴五个关键基因进行染色体定位、QTL分布分析、cDNA克隆、组织表达谱分析、遗传多态寻找以及与猪主要经济性状的关联分析研究,以期了解HPT轴该五个关键基因的分子生物学特性,并为猪主要经济性状遗传改良和标记辅助选择提供科学依据。实验主要得出以下一些结果：(1)应用生物信息学和辐射杂交细胞系定位技术,HPT轴五个关键基因分别被定位于猪13、4、1、4和7号染色体。根据QTL数据库查询结果,五个基因全部位于日增重、肌肉品质和脂肪性状相关QTL内,提示猪HPT轴基因多态与个体生长速度、肉质和脂肪性状差异可能存在重要关联,为相应QTL的位置功能候选基因。(2)本论文首次克隆获得猪TRHR基因mRNA序列,并在分子水平上进行了深入分析。猪TRHR基因与人TRHR基因进化上很接近。除TRHR基因的功能性转录本外,本论文实验中还发现了另外两种转录本类型。其中,转录本2为功能转录本1的截断型,仅含N端结构、跨膜螺旋1-5及部分胞内环3序列,缺失跨膜域6和7以及蛋白C端结构；而转录本3则恰与转录本2相反,剪切661 bp的选择性剪接内含子后,使之缺失了TRHR蛋白的N端编码序列,但保留有C端编码序列。然而选择性内含子的剪接,破坏了原阅读框,转录本3可能编码一种新的功能蛋白,也可能使用了不同的翻译起始位点。多种转录本存在的意义有待研究。(3)采用荧光定量RT-PCR技术,检测了HPT轴五个关键基因在大脑、下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、’肾、甲状腺、胰、胃、小肠、大肠,以及肌肉和皮下脂肪共15个组织中的表达分布。HPT轴激素及其受体在外周组织,如皮下脂肪中的共表达,提示相应激素可能通过旁分泌或自分泌方式对局部组织进行着生长发育调控。(4)以金华猪和皮特兰资源家系亲本个体为模板,共设计17对引物扩增HPT轴五个关键基因总长11,340 bp的DNA序列,进行PCR再测序以寻找核苷酸多态变异。分析基因测序峰图,共发现37个多态座位,其中位于TRH基因多态座位8个,TRHR基因多态座位7个,CGA基因多态座位14个,TSHB基因多态座位5个,TSHR基因多态座位3个。检测到的所有多态座位都提交到了国际SNP数据库dbSNP,并获得SNP登录号。根据多态座位彼此间距离间隔、侧翼序列特点及其潜在功能重要性,选择了其中20个座位,采用PCR-RFLP和四引物ARMS-PCR技术设计并优化了分型方法。(5)对49头纯种金华猪和24头纯种皮特兰猪进行HPT轴20个多态座位的分型,并采用HapBlock软件进行基因单倍型块分析和标签SNP选择。除TRH基因SNP在金华猪中分布于两个单倍型块外,其他基因的SNP座位均位于同一单倍型块中。结合两个品种的单倍型区块和标签SNP集合信息,共选择了3个TRH基因标签SNP,3个TRHR基因标签SNP,5个CGA基因标签SNP,3个TSHB基因标签SNP和1个TSHR基因标签SNP,用于在金华猪与皮特兰资源家系中进行HPT轴基因多态遗传效应分析。(6)在金华猪与皮特兰资源家系共463头个体中分析了HPT轴基因多态性与猪生长、胴体和肉质共30个主要经济性状的关联性,并在在约克夏、杜洛克、长白猪以及嘉兴黑猪中进行了一定的验证分析。分析结果显示：1)在金皮资源家系中TRH ss325994933与个体生长发育后期,尤其是150-180日龄期间增重有显着关联,其在国内和国外猪种中的基因频率亦存在明显的对立分布差异,但在生长较慢的金华猪中占优势的插入突变却在资源家系中表现为生长优势。本研究认为TRH基因可能在中外猪种生长性状差异形成中有一定影响,是相关日增重QTL下的位置功能候选基因,但其多态座位效应仍有待进一步挖掘验证。2) TRHR基因多态性的种群间分化较大。在金皮资源家系中,其对个体头重和胴体长有极显着效应,对眼肌的导电率、pH值、系水力、肌内水份和肌内脂肪性状有显着影响。TRHR基因与多项肉质指标存在显着关联,且在肌肉组织中有表达,本文认为有必要对TRHR基因在猪肌肉组织中的功能进行深入研究。3)尽管本文发现CGA基因多态性与猪肌内水份含量存在显着关联,此前并未见肌内水份QTL定位于CGA基因。可能由于CGA基因内微卫星的存在,造成较频繁的基因内重组,而使基因效应表现不稳定。所有5个CGA SNP在国内外猪种中均未表现出明显对立的等位基因频率分布差异。因此本研究认为,CGA基因多态性可能在国内外猪种性状差异形成中不具有重要地位。4)TSHB基因的种群间分化也较大。在金皮资源家系中,TSHB基因多态性对猪90-120日龄期间增重、后腿肌肉重有统计显着效应,对猪胴体重、胴体长和平均背膘厚有极显着效应。含金华猪单倍型G-G-A纯合子个体较皮特兰单倍型A-G-G纯合子个体增重显着慢,与一般认为的金华猪生长速度慢相一致。并且含皮特兰单倍型A-G-G个体背膘厚显着小于含金华猪单倍型G-G-A个体。此外,在杜洛克群体中,TSHB SNP座位ss181129015与背膘厚也存在显着关联,在国外猪种中占优势的等位基因A有降低背膘厚的效应,验证了在金皮资源家系中的分析结果。因此本研究认为,TSHB基因,尤其是其SNP ss181129015且有作为遗传分子标记应用于猪背膘厚性状改良育种中的价值。5) TSHR基因多态性座位的等位基因A在所有猪种中均以低频出现。金皮资源家系中,TSHR基因多态性对个体生长发育后期120日龄至180日龄期间增重以及眼肌pH值有显着影响。在长白猪群体中的关联分析,进一步确证了TSHR与日增重的关联性。然而,在金皮资源家系中表现出生长优势的等位基因A,在长白猪群体中却表现为生长劣势。
参考文献：
[1]. 猪促卵泡激素β亚基基因克隆及表达研究[D]. 王志方. 南京工业大学. 2003
[2]. 大熊猫等濒危动物FSH/LH和GH/GHR基因的克隆及其表达研究[D]. 廖鸣娟. 浙江大学. 2003
[3]. 梅山猪LH-β基因克隆及其表达效应研究[D]. 吕学斌. 四川大学. 2003
[4]. 猪促卵泡激素α和β亚基基因的克隆及其重组腺病毒表达载体的构建[J]. 李儒曙, 汪涛, 刘宇, 伍时达. 中国兽医科学. 2009
[5]. OPN和BMP15基因对小梅山猪产仔数的遗传效应研究[D]. 吴井生. 扬州大学. 2008
[6]. 猪下丘脑—垂体—甲状腺轴五个关键基因的研究[D]. 蒋晓玲. 浙江大学. 2011
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