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基因编辑基因Cas9背景表达玉米株系的筛选培育及玉米茎尖高通量转化辅助器材的设计与初步测试

2020-12-08阅读(978)

基因编辑基因Cas9背景表达玉米株系的筛选培育及玉米茎尖高通量转化辅助器材的设计与初步测试

论文摘要

基因编辑技术指能够定向改变目标基因序列,从而对特定的DNA片段进行敲除、插入等的技术。CRISPR/Cas9技术作为新一代基因组编辑技术,与ZFNs、TALENs技术相比,具有操作简便、结构简单、切割效率高、靶位点多等优点,在生物基因功能的研究方面和性状改良方面能够得到迅速推广与应用。本研究通过构建pSCZ3-Cas9表达载体并转入玉米植株中,共获得235个独立转基因株系。通过遗传分析和实时荧光定量PCR分析,筛选单染色体插入株系并检测Cas9基因表达水平,选择其中表达效率相对较高的单染色体插入转基因株系,可作为基因编辑的Cas9表达背景材料,进行高通量基因编辑材料库创建和基因功能研究。为了建立高效的玉米转基因体系,本研究设计了一套用于高通量玉米茎尖转化的辅助器材,并初步进行了测试。主要结果如下:（1）玉米基因编辑表达载体构建利用本实验室提供的带有2×35S强启动子和Bar基因筛选标记的质粒pSCZ3为骨架,从水稻基因编辑载体pP1C.1中克隆Cas9基因,将之通过酶切连接的方法插入到pSCZ3载体骨架上,成功构建了适于玉米转基因高通量筛选的双元表达载体pSCZ3-Cas9。（2）玉米转基因株系的获得及遗传分析构建成功的pSCZ3-Cas9载体送交北京博美兴奥生物科技公司进行大规模遗传转化,共获得235个独立的转基因株系。对T0植株和T1株系进行PCR检测后,根据孟德尔遗传定律筛选出xx个T0为单染色体插入的转基因株系。（3）转基因株系Cas9基因表达分析利用RT-qPCR对23个阳性转基因株系进行Cas9基因的表达分析。结果表明,不同株系的Cas9基因表达水平存在显著差异,高表达量株系与低表达量株系的表达水平相差55-350倍。对4个株系的T1进行Cas9基因表达水平比较分析表明,表达水平可稳定遗传。（4）高通量玉米茎尖转化辅助器材的设计及使用效果本研究设计了一套能够用来进行高通量玉米茎尖转化的辅助器材。可提高操作效率5-8倍。辅助器材成本低廉,具有良好的推广潜力;受体植株全程在有菌土壤中培育,不仅节省了MS培养基的使用,而且解决了使用现有方法转化过程易发生污染的问题,降低了对转化环境的要求;采用本辅助器材进行操作过程时,仅对植株生长点进行定点损伤,减少了现有方法对整个植株的机械损伤风险,有利于转化后植株的成活和健壮生长。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  •   1.1 基因编辑技术
  •     1.1.1 CRISPR/Cas9 系统基本结构
  •     1.1.2 CRISPR-Cas9 基因编辑技术的发展历史
  •     1.1.3 CRISPR/Cas系统的主要类型
  •     1.1.4 CRISPR/Cas9 系统的作用原理
  •     1.1.5 CRISPR/Cas9 系统的构建及在植物中的研究进展
  •     1.1.6 Cas9 基因表达效率研究现状
  •   1.2 玉米转化方法
  •     1.2.1 玉米遗传转化方法
  •     1.2.2 玉米转化的体系
  •   1.3 本研究的目的意义
  • 第二章 基因编辑基因Cas9 背景表达玉米株系的筛选培育
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 植株材料
  •     2.1.2 菌种及载体
  •     2.1.3 化学试剂及培养基的配置
  •     2.1.4 仪器设备
  •     2.1.5 PCR 引物设计
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 Cas9 蛋白基因表达载体构建
  •     2.2.2 遗传转化
  •     2.2.3 Cas9 基因检测
  •     2.2.4 Cas9 相对表达量的检测
  •   2.3 结果与分析
  •     2.3.1 Cas9 蛋白基因表达载体的构建
  •     2.3.2 第一批转化植株检测结果
  •     2.3.3 第二批转化植株检测结果
  •     2.3.4 单染色体插入转基因植株Cas9 相对表达量检测
  •   2.4 结论
  • 第三章 玉米茎尖高通量转化辅助器材的设计与初步测试
  •   3.1 实验材料
  •     3.1.1 辅助器材所需材料
  •     3.1.2 植物材料
  •     3.1.3 菌种及载体
  •     3.1.4 仪器设备
  •     3.1.5 培养基的配制
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 植株幼苗的培养
  •     3.2.2 工程菌的制备
  •     3.2.3 玉米生长点的损伤与遗传转化
  •   3.3 .实验结果与比较
  •     3.3.1 幼苗培养方面
  •     3.3.2 植株幼苗生长点剥露效率
  •     3.3.3 移栽效率
  •     3.3.4 对植株的损伤程度
  •   3.4 结论
  • 参考文献
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 林哲

    导师: 宋建成,赵吉强,陈磊

    关键词: 玉米,荧光定量,茎尖转化,辅助器材

    来源: 烟台大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,农作物

    单位: 烟台大学

    分类号: S513;Q943.2

    总页数: 57

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