巩中军[1]2004年在《烟夜蛾触角普通气味结合蛋白2cDNA的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达》文中研究指明昆虫能够感受空气中的挥发性物质，并依此作为寻偶、觅食和寻找产卵场所的信息。而昆虫触角感受器中的气味结合蛋白被认为是运输气味分子至嗅觉的受体，是昆虫专一性识别外界气味物质的第一步生化反应，对于昆虫与外界进行信息交流具有重要意义。该论文开展了烟夜蛾触角普通气味结合蛋白2基因的克隆和表达研究。 根据已发表的其它昆虫的核苷酸序列设计引物，利用RT-PCR技术扩增了编码烟夜蛾雌雄虫触角普通气味结合蛋白2的cDNA片断，并通过TA克隆的方法将其克隆至pGEM-T Easy载体(GenBank登录号为AY351670)，获得了GOBP2基因成熟蛋白阅读框序列。将目的片断和原核表达载体pET-30a(+)经双酶BamHI／XhoI酶切重组到表达型质粒中，并转化入原核细胞中表达。序列测定结果表明，烟夜蛾触角普通气味结合蛋白基因的成熟蛋白阅读框全长489bp，编码162个氨基酸残基，预测分子量和等电点分别为18.2kDa和5.35。推导的氨基酸序列与已报道的10种昆虫普通气味结合蛋白2高度同源(74％～99％)，并具有气味结合蛋白的典型特征。其中与谷实夜蛾的同源性最高，11种昆虫GOBP2氨基酸的相似程度与这11种昆虫的亲缘关系并不完全一致。SDS-PAGE和Western印迹分析表明，经IPTG诱导，GOBP2基因能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，电泳检测到一条约23kDa大小的外源蛋白，与预测的融合蛋白分子量大小相应。 本研究将烟夜蛾普通气味结合蛋白2基因整合入原核表达载体表达，得到的重组蛋白在其N-端融合有His·Tag纯化标记，为下一步获得大量GOBPZ重组蛋白，研究GOBPZ蛋白的结构及配体的研究奠定了基础。
王宇[2]2012年在《苜蓿夜蛾和大豆食心虫气味感受相关蛋白基因的克隆分析及表达》文中提出苜蓿夜蛾(鳞翅目：夜蛾科)和大豆食心虫(鳞翅目：小卷蛾科)是大豆生长期和结荚期的两种主要害虫,随着近年来免耕和重迎茬面积增加,两种害虫的发生明显加重,成为造成大豆品质和产量降低的主要因素之一。昆虫触角是嗅觉感器分布集中的部位,触角上的各种感器调节着昆虫行为与化学、物理等各种环境刺激因子的关系,在昆虫的寄主定位、识别、取食、觅偶、交配、繁殖、栖息、防御与迁移等过程中起着极为重要的作用。因此,研究其嗅觉感器的形态与结构是探索昆虫嗅觉行为和识别机制的必要前提。昆虫的嗅觉识别过程是非常复杂的,多种蛋白参与了这一过程,这些蛋白主要包括气味结合蛋白、气味受体以及气味降解酶。深入研究嗅觉识别过程中的几个主要蛋白的结构与功能对于阐明嗅觉识别的分子机理非常重要。因此,本试验以苜蓿夜蛾和大豆食心虫为研究对象,利用扫描电镜对触角的超微结构进行了观察,利用RT-PCR和RACE的方法克隆得到了嗅觉识别的相关基因,并对相关基因的功能进行了分析,以期为阐明这两种害虫嗅觉识别的分子机理提供依据。利用扫描电镜对苜蓿夜蛾触角上的感受器类型进行观察,结果表明,雌雄苜蓿夜蛾的触角类型都是线状触角,由柄节、梗节和鞭节组成。触角上有8种感器分布,分别为毛形感器、刺形感器、锥形感器、腔锥形感器、耳形感器、鳞形感器、栓锥形感器和Bohm氏鬃毛,触角感器主要分布于触角的迎风面和侧面,柄节周围被鳞片包被,鞭节背风面有半包围状整齐排列的鳞片,鳞片结合处有零星分布的磷形感器、刺形感器；在整个触角上,感器主要集中在鞭节,柄节和梗节较少。不同类型感器相比而言,以毛形感器数量最多,刺形感器排列较为整齐和规律。每一鞭小节背风面都覆盖有鳞片,后排鳞片的前缘盖着前排鳞片的基部,层层相迭,绝大多数感器着生在触角的迎风面和侧面。利用RT-PCR和RACE的方法得到了苜蓿夜蛾和大豆食心虫的五个气味结合蛋白(OBP)和一个气味受体蛋白(Or83b)基因的全长,其中包括两种昆虫的信息素结合蛋白(PBP)和普通气味结合蛋白1(GOBP1),苜蓿夜蛾的普通气味结合蛋白2(GOBP2)和受体蛋白Or83b蛋白。用苜蓿夜蛾的信息素结合蛋白、普通气味结合蛋自1和2叁条序列构建了叁个基因的原核表达载体,并且在大肠杆菌中成功进行了表达。苜蓿夜蛾PBP基因cDNA序列的全长为625个碱基,包括一个510个碱基的开放读码框,编码170个氨基酸组成的多肽,推导出的分子量为19.0kD,预测等电点pI为5.65。在27-28位为信号肽切割位点,并存在1个N位糖基化位点。大豆食心虫PBP基因cDNA序列的全长为610个碱基,包括一个504个碱基的开放读码框,编码168个氨基酸组成的多肽,推导出的分子量为19.3kD,预测等电点pI为5.55。在24-25位为信号肽切割位点,并在52的位置上有一个N位糖基化位点。通过和已知昆虫PBP基因cDNA序列的对比,发现两种昆虫的PBP基因氨基酸序列有典型OBP家族特点的六个保守的半胱氨酸,苜蓿夜蛾和大豆食心虫PBP与其他已知鳞翅目昆虫PBP的同源性分别在44%-96%和45%-70%之间,对比过程中发现在已研究昆虫PBPs的研究发现多种昆虫中存在叁种PBPs,也就是PBP存在不同的亚型,多种PBP存在的特征可能与昆虫间信息素成分的多样性有关。苜蓿夜蛾GOBP1基因cDNA序列的全长为973个碱基,包括一个495个碱基的开放读码框,编码164个氨基酸组成的多肽,推导出的分子量为19.0kD,预测等电点pI为5.32。在19-20位为信号肽切割位点。大豆食心虫GOBP1基因cDNA序列的全长为920个碱基,包括一个492个碱基的开放读码框编码163个氨基酸组成的多肽,推导出的分子量为18.8kD,预测等电点pI为5.29。在19-20位为信号肽切割位点。通过和已知昆虫GOBP1基因的cDNA序列对比,发现两种昆虫的GOBP1基因氨基酸序列有典型OBP家族特点的六个保守的半胱氨酸,苜蓿夜蛾和大豆食心虫GOBP1与其他已知鳞翅目昆虫GOBP1的同源性分别在63%-95%和65%-82%之间。苜蓿夜蛾GOBP2基因cDNA序列全长为624个碱基,包括一个489个碱基的开放读码框,编码162个氨基酸组成的多肽,推导出的分子量为18.2kD,预测等电点pI为5.30。在21-22位为信号肽切割位点。通过和已知昆虫GOBP2基因的cDNA序列对比,发现有典型OBP家族特点的六个保守的半胱氨酸,与已知鳞翅目昆虫GOBP2的同源性在75%-99%,说明GOBP2基因在鳞翅目昆虫中比较保守。苜蓿夜蛾Or83b基因cDNA序列全长1715个碱基,包括一个1422个碱基的开放读码框,编码473个氨基酸,分子量约为53.5kD,多肽的预测等电点pI为8.37。对苜蓿夜蛾Or83b氨基酸序列进行分析预测,发现苜蓿夜蛾Or83b氨基酸序列中存在2个N位糖基化位点,N-端无信号肽,含有7个跨膜区域,N末端在细胞膜内,而C末端在细胞膜外,符合昆虫气味受体的结构特征。通过和已知昆虫的Or83b基因的cDNA序列对比,发现苜蓿夜蛾的Or83b和其他鳞翅目昆虫Or83b同源性达到96%以上。对五条气味结合蛋白的生物信息学分析,发现这五条基因编码的蛋白具有昆虫气味结合蛋白的典型特征：小分子量、水溶性酸性蛋白；序列中有6个保守的半胱氨酸,N-末端有信号肽,具有分泌蛋白的特征。苜蓿夜蛾气味受体蛋白Or83b具有昆虫气味受体的典型特征：具有七个跨膜区,N末端在细胞膜内,C末端在细胞膜外,N-无信号肽。对苜蓿夜蛾PBP、GOBP1、GOBP2和Or83b四条基因在雌雄成虫的触角、腹部和足叁个器官的表达情况进行了研究,结果表明四条基因在雌雄触角、腹部和足中均有表达,同时通过对苜蓿夜蛾PBP各器官荧光定量分析,发现苜蓿夜蛾PBP主要存在于雄虫触角中,在雄虫触角中表达量是雌虫的30倍以上,而雌虫触角中的表达量也是其他器官的3倍以上。
王舒[3]2013年在《八字地老虎气味感受相关蛋白基因的序列分析及表达》文中研究说明八字地老虎Agrotis c-nigrum（鳞翅目：夜蛾科）是重要的农业、草原切根性害虫，目前的防治方法主要有喷施化学药剂以及诱杀成虫，尚无有效的方法从根本上控制其危害的发生，是造成农作物长势不好的主要因素之一。利用信息物质调控来防治害虫，是生物防治的趋势之一，而昆虫触角是获取信息物质的主要器官之一，且昆虫大部分行为活动的重要环节都是受化学气味信息调节的，因此，研究昆虫的触角和它的感受器的外形、位置、结构，来分析感受器可能具有的功能，来解释昆虫行为和气味识别的过程，说明机理，通过系统的对比和分析找到生物防治害虫的方法。昆虫了解外界环境主要依靠的是它们的嗅觉系统。昆虫的嗅觉感器是极其灵敏的化学感受器，在嗅觉感受器中有多种蛋白并且这些蛋白参与并完成了昆虫识别外界气味物质信息的过程。因此对这几种蛋白的深入研究以及对触角感受器的数量、分布和区别的研究，有助于了解昆虫嗅觉识别系统的机理。所以，本研究以八字地老虎为供试昆虫，采用扫描电镜、克隆、蛋白表达等方法对八字地老虎触角的超微结构和气味结合蛋白等相关基因的功能进行研究分析。本研究利用扫描电镜对八字地老虎雌、雄成虫触角感器的形态及分布。结果表明，八字地老虎成虫触角呈线型，成虫触角由柄节、梗节和分为61-67个亚节的鞭节组成；触角迎风面覆盖鳞片和鳞形感器，栓锥形感器、毛形感器、B hm氏鬃、耳形感器、乳头状感器、刺形感器、腔锥形感器毛位于触角的腹面和侧面，在八字地老虎触角中共8种感器。其中，毛型感器有两种形态，耳型感器有两种形态。柄节、梗节上分布B hm氏鬃毛、毛型感器2型、鳞型感器，共3种；鞭节上分布着毛形感器1型、腔锥形感器、耳形感器、乳头状感器、刺形感器、鳞形感器、栓锥形感器，共7种，其中乳型感器与耳型感器伴随着出现，在鳞翅目昆虫触角上少有发现。雌、雄个体之间触角感器的长度、数量有差异，推测可能与雌、雄个体的行为差异有关。其中雌虫长为11969.28μm明显长于雄虫11123.95μm；B hm氏鬃毛在2000平方微米的数量p=0.05水平上差异显着，雌蛾多于雄蛾。利用RT-PCR和RACE的方法，克隆得到了八字地老虎信息素结合蛋白（Pheromon bindingprotein，PBP）和普通气味结合蛋白1（General odorant binding protein1，GOBP1）和普通气味结合蛋白2（General odorant binding protein2，GOBP2）。并对八字地老虎的信息素结合蛋白、普通气味结合蛋白1和2叁条序列构建的重组质量成功的在大肠杆菌中表达。本研究克隆了八字地老虎信息素结合蛋白cDNA的全长序列共有1280个碱基，其中包括一个516个碱基的开放读码框，编码171个氨基酸组成的多肽，在19-20位存在一个信号肽切割位点，并存在1个N位糖基化位点。预测分子量为18.0kD，等电点pI为5.34。八字地老虎信息素结合蛋白序列已经登录GenBank并获得登录号。登录号为JX978463。序列分析结果表明，八字地老虎的信息素结合蛋白氨基酸序列有六个保守的半胱氨酸，同时八字地老虎信息素结合蛋白与其他已知昆虫信息素结合蛋白的同源性分别在77%-88%之间，说明八字地老虎信息素结合蛋白符合OBP家族的特点。本研究克隆了八字地老虎普通气味结合蛋白1cDNA的全长序列共有1259个碱基，其中包括一个486个碱基的开放读码框，编码了161个氨基酸组成的多肽，预测分子量为18.6kD，等电点pI为5.14。八字地老虎普通气味结合蛋白1序列已经登录GenBank并获得登录号。登录号为JX978464。序列分析发现八字地老虎的GOBP1基因氨基酸序列有六个保守的半胱氨酸是OBP超家族典型特点的，在16-17位为信号肽切割位点。同时八字地老虎普通气味结合蛋白1与已报道的昆虫普通气味结合蛋白1基因的cDNA序列对比，八字地老虎GOBP1与其他已知鳞翅目昆虫GOBP1的同源性分别在71%-97%之间。说明八字地老虎普通气味结合蛋白1符合OBP家族的特点。本研究克隆了八字地老虎普通气味结合蛋白2cDNA全长序列共有702个碱基，其中包括一个489个碱基的开放读码框，编码162个氨基酸，分子量为18.1kD，等电点pI为5.20。八字地老虎普通气味结合蛋白2已经登录GenBank并获得登录号。登录号为JX978465。序列分析发现八字地老虎普通气味结合蛋白2有典型OBP家族特点的六个保守的半胱氨酸，在21-22位为信号肽切割位点。同时通过八字地老虎普通气味结合蛋白2与已知昆虫普通气味结合蛋白基因的cDNA序列对比，同源性在84%-99%，说明GOBP2基因在鳞翅目昆虫中比较保守，并且是OBP家族的基因。分别对叁条气味结合蛋白进行原核表达，并对普通气味结合蛋白1进行了Western blot验证分析结果表明，原核表达结果与预期结果相符，确为八字地老虎的叁条基因的表达。利用生物信息学对叁条气味结合蛋白进行的分析，结构表这叁条蛋白是昆虫气味结合蛋白超家族的一员，同时分析结果表明气味结合蛋白可能具有运输的功能。
吴少英[4]2005年在《烟夜蛾触角气味结合蛋白基因克隆、序列分析及真核表达载体的构建》文中研究指明昆虫能够感受空气中的挥发性物质,并依此作为寻偶、觅食和寻找产卵场所的信息。而昆虫触角感受器中的气味结合蛋白被认为是运输气味分子至嗅觉的受体,这些气味受体多为脂溶性的小分子化合物,气味结合蛋白溶解并运输脂溶性气味化合物。是昆虫专一性识别外界气味物质的第一步生化反应,对于昆虫与外界进行信息交流具有重要意义。利用这一特性来检测和诱杀害虫是一个有效的预测和防治途径,这种方法和其它方法具有很好的兼容性,并且不污染环境,不杀伤天敌。该论文开展了烟夜蛾触角气味结合蛋白(PBP、GOBP1)基因的克隆、序列分析、原核及真核表达载体构建的研究。 根据已发表的其它昆虫的核苷酸序列设计引物,利用RT-PCR技术扩增了编码烟夜蛾雌雄虫触角气味结合蛋白GOBP1和PBP的cDNA片断,并通过TA克隆的方法将其克隆至pGEM-T Easy载体(GenBank登录号为AY864774和AY864775),获得了GOBP1和PBP基因成熟蛋白阅读框序列。将目的片断和原核表达载体PGEX-4T-1经双酶BamHI和EcoRI酶切重组到表达型质粒中,并转化入原核细胞中表达。序列测定结果表明,烟夜蛾触角普通气味结合蛋白基因1的成熟蛋白阅读框全长441bp,编码147个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为17.2KD和4.71。性气味结合蛋白基因的成熟蛋白阅读框全长405bp,编码135个氨基酸残基,预测分子量和等电点分别为15.1KD和5.2。推导的GOBP1氨基酸序列与已报道的5种昆虫普通气味结合蛋白1高度同源达74%～99%,并具有气味结合蛋白的典型特征。PBP氨基酸序列与已报道的8种昆虫性气味结合蛋白同源性高,达40%以上,并具有气味结合蛋白的典型特征。其中与棉铃虫的同源性最高。丰富了昆虫气味结合蛋白家族,克隆出的GOBP1和PBP连接到原核表达载体中,为下一步获得大量的OBP重组蛋白打下坚实基础。 随着分子生物学技术的发展,微生物表达系统被广泛应用于外源基因产物的生产,基于酵母菌都有的一些特点。本实验采用粟酒裂殖酵母表达系统和毕赤酵母表达系统两种真核表达系统,真核表达系统虽然操作相对复杂,成本较高,但是有真核生物的蛋白翻译后修饰和加工,背景蛋白少,纯化简单等诸多优点。粟酒裂殖酵母可以具有很多高等真核生物的性质,使得粟酒裂殖酵母在分子生物学研究中成为一种提供准确信息的真核生物模型,但目前表达目的蛋白还不是很多;毕赤酵母是一种嗜甲醇单细胞真核生物,依据利用甲醇的高低,可分为Mut~+和Mut~s。作为表达外源基因的系统,该表达系统已经是成熟的表达系统,表达出大量的外源蛋白。两种系统都具有高表达、高分泌、高稳定的特点。烟夜蛾普通气味结合蛋白2基因整合入真核表达载体pPIC9k,构建毕赤酵母表达载体pPIC9k-GOBP2,并已经检测出阳性重组子;烟夜蛾普通气味结合蛋白2基因整合入真核表达载体PESP-2,构建了粟酒裂殖酵母表达载体PESP-2-GOBP2,也检测出阳性重组子。为下一步获得大量GOBP2重组蛋白,研究GOBP2蛋白的结构及配体的研
张国辉[5]2012年在《梨小食心虫嗅觉相关蛋白基因的分子生物学特性及其原核表达研究》文中提出昆虫在漫长的进化过程中形成了复杂的嗅觉系统，并以此来感受环境中的信息化学物质，进而做出有利于自身生存和繁衍的行为反应，如寻找食物、求偶交配、定位寄主、躲避天敌等。利用昆虫这种生命活动过程中的特性采取适当的措施进行害虫防治，已成为害虫综合治理的重要手段。梨小食心虫是一种严重危害桃、梨等多种果树的世界性重要害虫，在包括我国在内的许多国家和地区猖獗发生，对果业生产造成了严重危害。目前，生产上主要依靠果实套袋和化学防治，但前者操作费工、费时，且随劳动力价格的上涨已面临严峻的挑战；化学防治则因该虫钻蛀危害，隐蔽性强而效果较差。鉴于此，研发经济高效的梨小食心虫防治新技术已成为生产中亟待解决的问题。深入研究梨小食心虫成虫嗅觉识别系统，阐明梨小食心虫与寄主植物之间信息联系的本质，必将有助于研发梨小食心虫的新型引诱剂和趋避剂，为防治梨小食心虫提供新的思路与途径。本论文从梨小食心虫成虫感受信息化合物的生理基础入手，系统研究了梨小食心虫成虫的行为习性及其日生理节律，触角感受器的形态、结构和分布；在此基础上研究了梨小食心虫成虫嗅觉识别系统的分子基础——普通气味结合蛋白和化学感受蛋白，取得的主要结果如下。1、成虫行为节律研究在人工气候箱（室温23.5～24.5℃、相对湿度60%～80%、光周期15L:9D）条件下，对梨小食心虫成虫羽化、交配及产卵行为及其日节律进行了系统观测。结果表明，梨小食心虫成虫的羽化、交配和产卵节律均具明显时间特点。成虫的羽化主要集中在05:00-10:00，此时成虫的羽化数量达总羽化数量的90%以上，其中以5:00-6:00成虫羽化率最高，显着高于其它时段；雌雄成虫求偶交配多发生在羽化后第3天，雌雄两性呈“一”字形进行交配，单次交配持续时间的平均值为22.07min，交配活动主要集中在17:00-21:00，交配发生率超过90%；雌成虫的产卵时间与雌雄成虫的交配时间基本一致，也主要集中在17:00-21:00，此时雌成虫产卵量达总产卵量的87.43%，显着高于其它时段。2、成虫触角感器研究采用扫描电镜对梨小食心虫成虫触角进行观察和研究表明，梨小食心虫成虫触角上共存在7种感器，分别为毛形感器、锥形感器、刺形感器、栓锥形感器、腔锥感器、耳形感器和B hm氏鬃毛。不同触角感器的形态构造和分布特点各异，说明其功能有别。3、普通气味结合蛋白基因的克隆和表达特性研究采用反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）和cDNA末端快速扩增（RACE）技术，从梨小食心虫雌成虫触角组织克隆到2个编码普通气味结合蛋白（GOBP）的cDNA全长序列GmolGOBP1（Genbank登录号：JN857939）和GmolGOBP2（Genbank登录号：JN857940）。序列分析表明，梨小食心虫的2个GOBP的cDNA序列全长分别为1090bp和637bp，开放性阅读框分别为492bp和483bp，编码164和161个氨基酸残基，预测其N-末端均具由20个氨基酸残基组成的信号肽序列。梨小食心虫的2个普通气味结合蛋白基因推导的氨基酸序列与已知鳞翅目其它昆虫普通气味结合蛋白具很高同源性，但GmolGOBP1和GmolGOBP2之间的同源性仅48%，说明它们归于不同的昆虫普通气味结合蛋白类群。RT-PCR研究结果显示GmolGOBP1和GmolGOBP2均仅在雌雄成虫触角组织中特异性表达。Real-time PCR研究结果表明，GmolGOBP1在雄成虫触角的表达量较高，而GmolGOBP2在雌成虫触角的表达量较高。另外，研究发现GmolGOBP1在雌雄两性触角及GmolGOBP2在雌虫触角中明显的上调表达均发生在光期的末段及整个暗期，而雄成虫触角中GmolGOBP2在整个光周期各时段表达量相似，据此结果，对GmolGOBP1和GmolGOBP2可能的生理功能进行了探讨。4、化学感受蛋白基因的克隆及序列分析采用RT-PCR和RACE技术克隆了梨小食心虫化学感受蛋白基因GmolCSP（GenBank登录号：JQ821389）。GmolCSP开放性阅读框全长384bp，编码127个氨基酸，N-末端含18个氨基酸组成的信号肽序列，成熟蛋白预测分子量为12.80kD，等电点为8.33，且GmolCSP具有4个保守半胱氨酸，符合昆虫化学感受蛋白的一般特征。通过序列相似性及系统发育树分析，GmolCSP与云杉卷蛾Choristoneura fumiferana（CfumCSP3）亲缘关系最近，相似性为73%其次是烟芽夜蛾Heliothis virescens（HvirCSP2），相似性为68%，与其他昆虫仅有34～46%的相似性。RT-PCR研究结果显示，GmolCSP不仅在梨小食心虫触角中表达，在去触角的头，胸、腹、足和翅中均有表达。5、普通气味结合蛋白2与化学感受蛋白基因的原核表达在成功克隆梨小食心虫普通气味结合蛋白（GmolGOBPs）和化学感受蛋白（GmolCSP）基因的基础上，将GmolGOBP2和GmolCSP与原核表达载体pET-32a进行重组，在大肠杆菌BL21（DE3）中表达，Western Blots结果显示，大肠杆菌中表达的蛋白正是pET/GmolGOBP2和pET/GmolCSP重组蛋白，从而实现了GmolGOBP2和GmolCSP在大肠杆菌中的表达。异源表达的实现为今后研究蛋白功能及提示梨小食心虫嗅觉识别系统奠定了良好基础。
黄崇政[6]2011年在《家蚕感觉神经元膜蛋白基因BmSNMP的多角体融合表达、纯化与表达分析》文中认为昆虫在处理来自环境的化学信号过程中,嗅觉起着非常重要的作用,其对昆虫的栖息地的选择、觅食、信息传递以及寻找配偶、产卵场所、寄主和猎物等行为都具有重要的作用。感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane protein, SNMP)是参与昆虫气味识别的重要蛋白之一,在人类基因中属于CD36基因家族成员,是CD36家族中唯一在神经元中发现的基因。家蚕特别是其成虫的嗅觉是研究昆虫化学通讯的理想模型,一直备受关注。我们从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条序列。生物信息学分析发现此序列含一个1569 bp的开放阅读框(open reading frame, ORF),编码一个由522个氨基酸残基组成的蛋白,预测分子量为56.76 kD,等电点为8.58。由于其所编码的蛋白含有一个完整的CD36保守结构域,且与其他物种中的SNMP蛋白有很高的同源性,故将该基因命名为BmSNMP。GenBank登录号：NM 001043721。通过PCR扩增获得的BmSNMP基因,构建原核表达载体pET-32a(+)-polh-tev-BmSNMP,将构建的重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株感受态细胞,经IPTG诱导,高效表达重组融合蛋白。利用多角体蛋白的性质通过pH值的调节和离心及阴离子交换层析纯化蛋白Polh-tev-BmSNMP,纯化的蛋白用TEV酶切。构建转座载体pFastBac HTb-polh-BmSNMP,将polh-BmSNMP基因转座到杆状病毒基因组(Bacmid)上,构建Bacmid-polh-BmSNMP,通过脂质体将Bacmid-polh-BmSNMP转染家蚕BmN细胞获得重组病毒vBmpolh-BmSNMP。重组病毒感染正常家蚕细胞,Western blotting鉴定结果显示多角体融合的BmSNMP蛋白在家蚕细胞中获得成功表达。同理构建重组病毒vBmpolh-BmSNMP-EGFP,感染家蚕细胞后荧光显微镜下观察细胞体内的荧光,发现绿色荧光都在细胞膜附近,表明BmSNMP在真核细胞中表达且为膜蛋白。利用荧光定量PCR技术对BmSNMP基因在家蚕五龄幼虫各组织中的转录情况进行分析。荧光定量PCR结果显示,在五龄幼虫不同组织中BmSNMP基因的转录差异较大,从高到低依次为脂肪体、气门、丝腺、马氏管、中肠、性腺、头部和表皮。上述研究将为进一步研究BmSNMP蛋白的功能打下基础。此外,体外转录dsRNA,脂质体法转染BmN细胞,以MTT法检测干扰前后细胞活力,RNA干扰后的细胞活力上升；将细胞用PI染色后流式细胞仪分析,与对照组相比,干扰后S期细胞数量减少,说明polh融合的BmSNMP基因影响细胞周期,可能与细胞周期的调控有关。
参考文献：
[1]. 烟夜蛾触角普通气味结合蛋白2cDNA的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达[D]. 巩中军. 河南农业大学. 2004
[2]. 苜蓿夜蛾和大豆食心虫气味感受相关蛋白基因的克隆分析及表达[D]. 王宇. 东北农业大学. 2012
[3]. 八字地老虎气味感受相关蛋白基因的序列分析及表达[D]. 王舒. 东北农业大学. 2013
[4]. 烟夜蛾触角气味结合蛋白基因克隆、序列分析及真核表达载体的构建[D]. 吴少英. 河南农业大学. 2005
[5]. 梨小食心虫嗅觉相关蛋白基因的分子生物学特性及其原核表达研究[D]. 张国辉. 西北农林科技大学. 2012
[6]. 家蚕感觉神经元膜蛋白基因BmSNMP的多角体融合表达、纯化与表达分析[D]. 黄崇政. 浙江理工大学. 2011
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