促进雨生红球藻不动细胞累积虾青素的代谢规律研究

论文摘要

天然虾青素（Astaxanthin）是一种安全高效的着色剂和抗氧化剂,在水产养殖、化妆品、食品和医药等领域具有非常大的应用潜力。雨生红球藻（Haematococcus pluvialis,以下简称红球藻）是天然左旋虾青素的优质来源,是已知虾青素含量最高的生物,养殖该藻是目前获取天然虾青素的最佳途径。不断提高红球藻生物量和虾青素含量是提高虾青素生产效率的关键,这两方面的研究因兼具理论和应用价值,备受国内外关注。然而,目前与实际生产应用相结合的研究较少,且缺乏针对不动细胞阶段促进虾青素累积的代谢规律研究。本论文以雨生红球藻H6为实验藻株,重点关注不动细胞阶段藻细胞的虾青素累积情况,及其生理特性和代谢水平。首先基于产业规模化培养过程,利用光响应曲线（the photosynthesis-irradiance（P-I）curve）,分析管道式光生物反应器中,不同培养时期的红球藻细胞对户外高光的响应机制。其次,目前已确定添加醋酸钠能显著促进红球藻生物量积累和虾青素含量,但对醋酸钠如何影响藻细胞的生理特性及其代谢过程认知不足。本研究在不动细胞阶段添加醋酸钠,（1）通过检测呼吸速率和光合速率、最大光化学效率（Fv/Fm）及非化学光淬灭（NPQ）等,分析添加醋酸钠后红球藻虾青素积累过程中的生理变化;（2）结合代谢组学分析,并检测油脂含量及虾青素几何异构体组成,来探究外源醋酸钠对红球藻虾青素积累过程中细胞内代谢过程的影响。通过以上研究来进一步挖掘添加醋酸钠影响红球藻内物质的合成代谢机制,为在工业化培养中推广不动细胞阶段添加醋酸钠促进虾青素累积提供基础数据和理论支持。此外,前期研究已证实抑制光呼吸会显著抑制红球藻虾青素积累,本研究结合代谢组学分析又进一步探究了光呼吸途径与虾青素合成的代谢相互关系,阐明光呼吸在虾青素积累过程中的重要作用。本研究还基于实际生产应用中的问题,初步摸索最适接种比例。接种比例是指原藻液（旧液）体积与新培养基体积的比例,在大规模工业化的培养过程中,接种比例会影响红球藻虾青素生产效率。因此,研究不同接种比例在绿色游动细胞阶段对增殖生长的影响,及其后续在红色不动细胞阶段对虾青素积累的影响,以及不同接种比例的藻细胞在整个培养过程中的生理变化。该研究对于产业化培养红球藻生产虾青素是非常有必要的。主要结果如下:1、根据细胞形态和色素变化,雨生红球藻在管道式光生物反应器中的户外培养过程可以分为细胞转化阶段（由绿色游动细胞转变为绿色不动细胞）和虾青素积累阶段（逐步形成富含虾青素的红色不动细胞）。在前一阶段,干重和原生质体直径显著增加;在后一阶段,单个藻细胞的虾青素含量快速增加并形成多层细胞壁。此外,细胞转化阶段的净光合速率,最大净光合速率,光饱和点等光合参数都高于虾青素积累阶段,说明前一阶段具有更好的光合能力。由此推测在细胞转化阶段,光合作用的物质和能量主要用于生物量的积累和细胞的增大;在随后的虾青素积累阶段,虾青素积累及合成多层细胞壁所需的底物和能量主要来源于其他物质的转化。2、在不动细胞阶段添加醋酸钠,虾青素含量增加,藻细胞的光合活性受到抑制,而其呼吸速率提高。可以推测,在添加醋酸钠后,呼吸作用的增强对促进虾青素积累起到了重要作用。此外,与凌晨相比,中午Fv/Fm的下降程度代表光抑制程度,添加醋酸钠Fv/Fm的下降程度在培养第4天和第6天均低于空白对照组,说明添加醋酸钠后红球藻所受的光抑制水平降低。同时,NPQ值在醋酸钠处理组藻细胞中显著增加,表明添加外源醋酸钠可诱导缓解藻细胞受光抑制的保护机制。综上所述,在不动细胞阶段添加外源醋酸钠,既增强了虾青素的积累,又提高了红球藻的光保护能力。3、在不动细胞阶段添加醋酸钠（Ac）,游离虾青素单体及虾青素酯的含量均显著增加,且对虾青素几何异构体的组成比例有影响。通过GC-MS共鉴定出78种代谢产物,其中氨基酸27种,有机酸16种,脂肪酸12种,多元醇7种,磷酸3种,糖3种,胺2种,其它化合物8种。根据藻液颜色收集红球藻藻细胞样品,并将其划分为绿色（I,第0天）、棕色（II,第6天）和红色（III,第12天）三个阶段。加入Ac后,在棕色和红色阶段丙酮酸大量积累,参与TCA循环的柠檬酸、延胡索酸、琥珀酸和苹果酸也大量积累,能与乙醛酸相互转化的草酸、甘油酸也大量积累;同时果糖和葡萄糖含量降低,蔗糖显著增高。此外,尽管Ac组的游离脂肪酸含量在红色阶段显著低于CK组,然而Ac组的总脂含量和虾青素酯含量在棕色和红色阶段均显著高于CK组,脂肪酸合成的前体物质丙二酸含量也显著高于CK组,说明Ac能促进脂肪酸的生物合成,而脂肪酸则可进一步用于合成油脂或虾青素酯。根据以上结果推测,外源添加的醋酸钠进入藻细胞后转化为乙酰辅酶A,参与TCA循环和乙醛酸循环,为虾青素的生物合成提供底物和能量（NAD（P）H、ATP）;同时,以乙酰辅酶A的形式可能还参与了脂肪酸的生物合成,并且合成的脂肪酸与已合成的游离虾青素单体酯合形成虾青素酯,进一步直接提高虾青素含量;此外,脂肪酸合成加快也提高了油脂含量,形成油滴保护虾青素从而间接促进虾青素累积。4、在不动细胞阶段,光呼吸抑制剂CM对光呼吸的抑制作用并不影响藻细胞的生物量,对其叶绿素含量影响较小,而对虾青素的生物合成有显著的抑制作用。根据藻液颜色收集红球藻藻细胞样品,并将其划分为绿色（I,第0天）、棕色（II,第6天）和红色（III,第12天）三个阶段。通过多元统计分析（主成分分析、偏最小二乘判别分析）和层次聚类分析揭示了代谢物的聚类。加入CM后,甘氨酸和乙醇酸在棕色和红色阶段大量积累,说明CM确实抑制了红球藻的光呼吸途径,并且在虾青素积累过程中光呼吸始终被抑制。同时加入CM后果糖和葡萄糖含量降低,参与TCA循环的中间产物（柠檬酸、延胡索酸、琥珀酸和苹果酸）在棕色阶段也减少,推测抑制光呼吸也影响了TCA循环。然而,在光呼吸被抑制后,许多胞内的细胞保护代谢物,如氨基酸、多胺、多元醇和蔗糖,都显著增加。以上结果表明,在虾青素积累过程中,光呼吸途径可能影响TCA循环,从而影响虾青素合成所需的底物和能量,因此光呼吸在红球藻虾青素积累过程中发挥重要作用。5、接种比例是指原藻液（旧液）体积与新培养基体积的比例,对绿色游动阶段的细胞生长和红色不动阶段的虾青素积累都有较大影响。接种比例较高（2:1,1:1）时生物量、细胞密度和虾青素含量都较高,但接种比例较低（1:7,1:3）时藻细胞的比生长速率较大,虾青素/叶绿素比率较高。在绿色阶段,接种比例对光合电子传递链（OJIP曲线）的影响随培养时间逐渐减小;而在红色阶段,接种比例对光合电子传递链有较大影响。叶绿素荧光参数(光系统II的实际光化学效率(（37）PSII)、光化学淬灭（qP）、光系统II的最大光化学效率（Fv/Fm）及光能转换效率（Fv’/Fm’）)表明,绿色阶段的光合能力要显著高于红色阶段,而接种比例为2:1时在红色阶段藻细胞的光合活性也优于其他低接种比例组。因此,在大规模商业化培养红球藻生产虾青素过程中,若需要尽快达到较高生物量和虾青素含量,可选择高接种比例2:1;若需要获得快速增殖的藻细胞和尽快收获虾青素产品,可选择低接种比例1:7。以上研究有助于更深入地理解促进红球藻不动细胞累积虾青素的代谢规律,在生产中更有目的的通过人工调控避免光抑制发生、定向提高虾青素合成能力,创造更高的经济价值;也为通过基因工程等手段对红球藻进行遗传改良,提高其虾青素合成能力提供新思路和新靶点。

论文目录

摘要

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第1章绪论

1.1 虾青素

1.1.1 虾青素的基本结构

1.1.2 虾青素的旋光异构体

1.1.3 虾青素的几何异构体

1.2 虾青素的应用

1.2.1 水产养殖

1.2.2 人类健康和营养

1.3 雨生红球藻

1.3.1 雨生红球藻中虾青素的生物合成过程

1.3.2 雨生红球藻虾青素合成与其他代谢途径、细胞代谢物的关系

1.3.3 虾青素积累过程中转录水平的调控

1.4 雨生红球藻的养殖

1.4.1 二步培养法

1.4.2 藻株

1.4.3 培养模式

1.4.4 发展前景

1.5 研究内容及意义

第2章户外管道培养过程中雨生红球藻的生理变化

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 藻种

2.2.2 培养基

2.2.3 培养条件

2.2.4 实验指标测定

2.2.5 数据处理

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 结论

第3章在不动细胞阶段添加醋酸钠对虾青素积累过程的影响

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 藻种

3.2.2 培养基

3.2.3 培养方法

3.2.4 实验指标测定

3.2.5 数据处理

3.3 结果

3.3.1 醋酸钠对光合速率、呼吸速率的影响

3.3.2 醋酸钠对光合电子传递链的影响

3.3.3 醋酸钠对最大光化学效率（Fv/Fm）的影响

3.3.4 醋酸钠对非化学光淬灭的影响

3.3.5 醋酸钠对虾青素含量的影响

3.4 讨论

3.5 结论

第4章醋酸钠对雨生红球藻虾青素积累影响的代谢组学分析

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 藻种

4.2.2 培养基

4.2.3 培养方法

4.2.4 实验指标测定

4.2.5 数据处理

4.3 结果与讨论

4.3.1 色素含量及虾青素几何异构体

4.3.2 红球藻虾青素积累过程的代谢特性

4.3.3 糖代谢

4.3.4 糖酵解和TCA循环

4.3.5 光呼吸

4.3.6 乙醛酸循环

4.3.7 氨基酸

4.3.8 脂肪酸

4.3.9 醋酸钠对红球藻虾青素积累的代谢调控

4.4 结论

第5章红球藻中光呼吸与虾青素积累相互关系的代谢组学分析

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 藻种

5.2.2 培养基

5.2.3 培养方法

5.2.4 实验指标测定

5.2.5 数据处理

5.3 结果与讨论

5.3.1 干重和色素含量

5.3.2 红球藻虾青素积累过程的代谢特性

5.3.3 光呼吸

5.3.4 糖代谢

5.3.5 糖酵解和TCA循环

5.3.6 氨基酸

5.3.7 光呼吸对虾青素积累过程的代谢调控

5.4 结论

第6章接种比例对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 藻种

6.2.2 培养基

6.2.3 培养方法

6.2.4 实验指标测定

6.2.5 数据处理

6.3 结果

6.3.1 不同接种比例对游动细胞阶段藻细胞生长的影响

6.3.2 不同初始接种密度对不动细胞阶段色素含量的影响

6.3.3 接种比例对整个培养过程的影响

6.4 讨论

6.5 结论

第7章结论与展望

参考文献

致谢

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 张春辉

导师: 刘建国

关键词: 雨生红球藻,虾青素,醋酸钠兼养,光呼吸,代谢组学

来源: 中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)

基金: 国家自然科学基金(31572639,U1706209)

分类号: Q949.9

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