抗A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的研制与不同试剂盒临床检测差异性分析

论文摘要

禽白血病病毒（Avianleukosisvirus,ALV）属于反转录病毒科禽C型反转录病毒属,与禽类多种肿瘤性疾病及生产性能息息相关。该病毒主要引起禽类产生肿瘤以及慢性消耗性死亡,造成免疫抑制及生长迟缓,产蛋率大幅度下降,给养禽业带来巨大损失。ALV通过垂直和水平两种方式传播,限制本病的主要方法是淘汰阳性鸡,净化种群中的ALV-A、B、C、D、J和K等亚群。不同亚群病毒有不同的生物学特性以及临床症状,临床上选择合适的试剂盒是净化该病毒的关键。本研究通过研制针对A亚群禽白血病病毒gp85的单克隆抗体,并分析不同试剂盒检测禽白血病的差异性,为生产实践中禽白血病的净化提供研究基础。1 抗A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的制备与鉴定Gp85是ALV的囊膜蛋白,由ALV基因组中env基因编码,具有亚群特异性。本研究首先设计出一对针对A亚群禽白血病病毒env基因的特异性引物,PCR扩增本实验室分离保存的ALV-A-AH10毒株的gp85基因,然后构建原核表达载体PET32a-AH10-gp85,通过转化入BL21感受态细胞,筛选阳性转化质粒并经IPTG诱导表达,对表达的菌体进行超声波破碎,取离心后的上清和沉淀分别作SDS-PAGE分析,结果获得大小约53KD的目的蛋白。纯化后的PET32a-AH10-gp85蛋白与适量佐剂乳化后免疫6-8周龄BALB/c雌性小鼠,三次免疫后测小鼠血清抗体效价,对免疫效果较好的加强免疫,三天后取脾脏与骨髓瘤细胞进行融合。用感染AH10病毒的DF1细胞板,固定后,对融合成功的杂交瘤细胞进行IFA筛选。阳性孔经过2-3次亚克隆,结果获得五株稳定分泌单克隆抗体,分别命名为ALV-A-1B12、ALV-A-1C12、ALV-A-1E5、ALV-A-1F8 和 ALV-A-3D11。Western-blot 和 IFA试验结果表明,所获单抗3D11只针对ALV-A/B囊膜蛋白gp85抗原,而其余四株可与J亚群病毒发生荧光反应。本次研究成功制备出一株针对ALV-A/B的单克隆抗体（3D11）,为快速筛检田间感染A/B亚群禽白血病病毒的鸡群提供了临床诊断试剂。2不同试剂盒检测禽白血病肛拭阳性率的差异性分析建立快捷准确,成本低,可用于大批量田间试验的诊断技术是防制禽白血病的重要一环。ELISA检测方法因其具有灵敏、快捷、适用于大面积检测等特点,在众多方法中脱颖而出,被广泛应用于禽白血病的种群净化中。为探索不同ELISA试剂盒针对禽白血病p27抗原检测灵敏度的差异性,本研究将60只2周龄黄羽雏鸡（包括30只活鸡、30只死鸡）进行编号并采集肛拭、血样及组织样本。分别用IDEXX公司p27抗原检测试剂盒和sELISA试剂盒检测其肛拭样本。血样及组织样本接种DF1细胞分离病毒,7天后取培养上清进行p27抗原检测及鉴定,分析比较肛拭阳性率差异,并通过PCR、RT-PCR及间接免疫荧光法验证。结果显示,sELISA试剂盒肛拭阳性检出率为68%,IDEXX试剂盒阳性检出率为27%,且IDEXX公司阳性检出样本均存在于sELISA试剂盒阳性检出的样本中。阳性差异样本通过测序分析,进一步确认为感染K亚群禽白血病病毒,这一结果显示,sELISA试剂盒能够更灵敏有效地检测阳性肛拭样本,特别是检测肛拭中的禽白血病K亚群病毒。

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摘要

Abstract

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计量单位

禽白血病概述

1 禽白血病病毒的基本形态及特性

1.1 病毒的分类

1.2 病毒的基因组结构

1.3 病毒的理化特性

1.4 病毒的细胞受体

1.5 病毒的致病性及致病机理

2 禽白血病的流行状况

2.1 传播方式

2.2 流行现状

3 禽白血病的诊断与检测

3.1 病毒的分离鉴定

3.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）

3.3 免疫荧光技术

3.4 聚合酶链式反应（PCR）技术

3.5 血清型诊断

4 禽白血病的预防与控制

5 本研究的目的和意义

研究内容一抗A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的研制与鉴定

1 实验材料

1.1 病毒与细胞来源

1.2 菌株与载体

1.3 主要试剂及材料

1.4 主要仪器

1.5 主要试剂配制

2 实验方法

2.1 目的片段的扩增

50测定'> 2.1.1 病毒扩增与TCID₅₀测定

2.1.2 细胞基因组DNA的提取

2.1.3 引物的设计与合成

2.1.4 目的片段的扩增

2.2 目的片段的克隆

2.2.1 目的片段的回收

2.2.2 回收产物与pGEM-T-easy的连接

2.2.3 连接产物转化感受态细胞DH5a

2.2.4 阳性克隆的鉴定

2.3 原核表达载体PET32a-AH10-gp85的构建

2.3.1 目的基因和表达载体PET-32a的酶切及回收

2.3.2 目的片段和表达载体PET-32a的连接

2.3.3 连接产物转化至BL21感受态细胞

2.3.4 阳性克隆的鉴定

2.4 重组蛋白的诱导表达

2.4.1 重组蛋白的诱导表达

2.4.2 菌体的超声波裂解

2.4.3 重组蛋白的SDS-PAGE分析

2.4.4 IPTG诱导浓度的优化

2.4.5 重组蛋白的大量表达

2.5 重组蛋白的纯化和鉴定

2.5.1 重组蛋白的纯化

2.5.2 包涵体的复性

2.5.3 重组蛋白western-blot分析

2.6 单克隆抗体的制备

2.6.1 实验动物、细胞及病毒

2.6.2 主要试剂耗材及仪器

2.6.3 免疫原的准备

2.6.4 实验动物的免疫

2.6.5 骨髓瘤细胞的准备

2.6.6 小鼠脾淋巴细胞的准备

2.6.7 细胞融合

2.7 阳性杂交瘤细胞的筛选及亚克隆

2.8 单克隆抗体亚类的鉴定

2.9 单克隆抗体腹水的制备

2.10 单克隆抗体的特异性鉴定

2.11 Western blot鉴定单抗的反应性

3 结果与分析

3.1 目的基因的扩增

3.2 重组质粒PET32a-AH10-gp85的双酶切鉴定

3.3 重组蛋白的诱导表达

3.4 诱导表达条件的优化

3.5 纯化蛋白的SDS-PAGE分析

3.6 重组蛋白的western-blot分析

3.7 阳性杂交瘤细胞株的筛选

3.8 单克隆抗体的特性鉴定

3.8.1 单克隆抗体的亚类鉴定

3.8.2 单克隆抗体的特异性鉴定

3.8.3 单克隆抗体的生物活性鉴定

4 讨论与小结

研究内容二不同试剂盒检测禽白血病效果差异性分析

1 实验材料

1.1 主要试剂和仪器

2 实验方法

2.1 样品采集与病毒分离

2.2 ELISA检测处理后样本

2.3 病毒基因组提取及PCR检测

2.4 RT-PCR检测活鸡差异样本

2.5 间接免疫荧光检测

3 结果与分析

3.1 ELISA检测结果

3.2 PCR检测结果

3.3 RT-PCR检测结果

3.4 IFA检测结果

4 讨论与小结

全文总结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 沈习

导师: 秦爱建

关键词: 禽白血病,抗原,原核表达,单克隆抗体,试剂盒,差异分析

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

基金: 国家科技基础性工作专项2013FY113300-4,国家重点研发计划项目(2016YFD0500800),江苏高校优势学科建设工程资助项目,江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

分类号: S852.65

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.001663

总页数: 64

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抗A亚群禽白血病病毒单克隆抗体的研制与不同试剂盒临床检测差异性分析

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