真菌高产次级代谢产物Sorbicillinoids的机理研究

论文摘要

里氏木霉（Trichoderma reesei）因其蛋白分泌量大、遗传性状稳定、生长繁殖迅速、培养条件简单和生物安全性良好等特点,在工业上被广泛用做表达多种同源蛋白或异源蛋白的宿主。随着对里氏木霉研究的深入,发现该菌在特定条件下可以大量产生抗菌、抗癌、抗病毒和抗氧化的次级代谢产物sorbicillinoids,这些化合物因可作为新治疗剂和新药引的潜在来源以及在医学、药学和生物技术中的潜在应用而备受关注,具有极高的研究价值。但目前仅知道sorbicillinoids是由包含两个聚酮合酶基因的八个基因组成的基因簇所合成,具体生产机制尚不明确。另外,在未来工业规模生产sorbicillinoids时,里氏木霉高产纤维素酶的特性会增加下游分离提纯sorbicillinoids过程的难度。因此,研究sorbicillinoids生产调控机制,开发高产sorbicillinoids、低产纤维素酶（易于分离）的稳定性菌株是目前的当务之急。本论文中,我们主要围绕sorbicillinoids基因簇的基因开展了如下三方面的工作:1.构建高产sorbicillinoids的基因工程菌Sor3-C30。Sor3基因是基因簇的合成途径基因,编码一种黄素腺嘌呤核苷酸依赖性单加氧酶。本文通过单酶切基因重组构建双元载体、利用农杆菌介导里氏木霉RUT-C30单核孢子技术,首次得到导入Sor3基因的里氏木霉工程菌Sor3-C30。该基因工程菌在以葡萄糖为碳源的TMM（Trichoderma minimal media）培养基中,其sorbicillinoids产量是迄今所有文献报道的里氏木霉菌株中最高的。2.在里氏木霉RUT-C30中导入Ypr1时,Sorbicillinoids产量显著上升,总纤维素酶活大幅度下降,表明Ypr1基因是sorbicillinoids次级代谢的正调控因子。Ypr1基因是sorbicillinoids基因簇的转录因子,掌控整个基因簇的转录和表达。为了研究Ypr1基因对sorbicillinoids生成的影响,论文以里氏木霉RUT-C30为出发菌株,利用农杆菌介导里氏木霉孢子技术,首次得到导入Ypr1基因的里氏木霉基因工程菌Ypr1-C30。检测该基因工程菌在以葡萄糖或纤维素为诱导条件下的TMM培养基中sorbicillinoids的产量和纤维素酶各组分的酶活,发现sorbicillinoids的产量显著上升,总纤维素酶活大幅度下降,且Ypr1-C30产sorbicillinoids具有高度的碳源依赖性。3.首次利用一种筛选标记介导真菌多次遗传转化。以里氏木霉基因工程菌ZC121为出发菌株,利用农杆菌介导孢子的方式在ZC121菌株中导入Sor5基因。里氏木霉基因工程菌ZC121为潮霉素抗性菌株,继续用潮霉素筛选Sor5-ZC121,正确率高达40%,首次利用同一种抗性基因实现在里氏木霉中进行二次农杆菌介导遗传转化。此外,用携带不同基因的农杆菌（Sor3、Sor5和Ypr2）与里氏木霉RUT-C30孢子共培养,实现了只用一种筛选标记,将多个基因同时导入一个受体中。另外,实验结果表明Sor5基因导入ZC121菌株中对sorbicillinoids的产量和纤维素酶各组分的酶活影响不大。

论文目录

摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 引言

1.2 里氏木霉的研究进展

1.3 里氏木霉产sorbicillinoids的研究进展

1.3.1 Sorbicillinoids的分类

1.3.2 Sorbicillinoids的生物活性

1.3.3 里氏木霉产sorbicillinoids的调控机制

1.4 里氏木霉产纤维素酶的研究进展

1.5 本文的研究内容及意义

第二章里氏木霉基因Sor3在Sorbicillinoids生产中的作用和机理

2.1 引言

2.2 实验材料与方法

2.2.1 菌株、质粒

2.2.2 本实验中所用的引物

2.2.3 培养基的配制和培养条件

2.2.4 实验试剂

2.2.5 实验室常用试剂的配制

2.2.6 里氏木霉RUT-C30 DNA的提取

2.2.7 大肠杆菌质粒的提取

2.2.8 Sor3表达载体的构建

2.2.9 菌株遗传转化

2.2.10 Sorbicillinoids的定量分析

2.2.11 纤维素酶活的测定

2.3 结果与讨论

2.3.1 Sor3基因的扩增及琼脂糖凝胶电泳验证

2.3.2 Sor3基因表达载体的构建及琼脂糖凝胶电泳验证

2.3.3 单克隆的测序验证

2.3.4 里氏木霉转化子的筛选及琼脂糖凝胶电泳验证

2.3.5 导入Sor3 基因的里氏木霉工程菌高产sorbicillinoids

2.3.6 Sor3基因的导入抑制纤维素酶活

2.3.7 Sor3基因的导入对蛋白分泌的影响

2.3.8 Sor3基因的导入对菌株生长和孢子萌发的影响

2.3.9 不同碳源诱导条件下sorbicillinoids的产量

2.4 本章小结

第三章 Ypr1在Sorbicillinoids生产中的机理和研究

3.1 引言

3.2 实验材料与方法

3.2.1 菌株、质粒

3.2.2 本实验中所用的引物

3.2.3 培养基的配制和培养条件

3.2.4 实验试剂

3.2.5 实验室常用试剂的配制

3.2.6 里氏木霉RUT-C30 DNA的提取

3.2.7 大肠杆菌质粒的提取

3.2.8 Ypr1表达载体的构建

3.2.9 菌株遗传转化

3.2.10 纤维素酶活的测定

3.3 结果与讨论

3.3.1 Ypr1基因的扩增及琼脂糖凝胶电泳验证

3.3.2 Ypr1基因表达载体的构建及琼脂糖凝胶电泳验证

3.3.3 单克隆的测序验证

3.3.4 里氏木霉转化子的筛选及琼脂糖凝胶电泳验证

3.3.5 在里氏木霉孢子中导入Ypr1 基因提高sorbicillinoids的产量

3.3.6 Ypr1基因的导入对纤维素酶活的影响

3.3.7 Ypr1基因的导入对蛋白分泌的影响

3.4 本章小结

第四章农杆菌介导真菌多个基因的遗传转化

4.1 引言

4.2 实验材料与方法

4.2.1 菌株、质粒

4.2.2 本实验中所用的引物

4.2.3 培养基的配制和培养条件

4.2.4 实验试剂

4.2.5 实验室常用试剂的配制

4.2.6 里氏木霉RUT-C30 DNA的提取

4.2.7 大肠杆菌质粒的提取

4.2.8 Sor5和Ypr2 表达载体的构建

4.2.9 菌株遗传转化

4.2.10 纤维素酶活的测定

4.3 结果与讨论

4.3.1 Sor5和Ypr2 基因的扩增及琼脂糖凝胶电泳验证

4.3.2 Sor5和Ypr2 基因表达载体的构建及琼脂糖凝胶电泳验证

4.3.3 单克隆的测序验证

4.3.4 里氏木霉转化子的筛选及琼脂糖凝胶电泳验证

4.3.5 农杆菌介导的多基因同时导入

4.3.6 Sor5 基因的导入对sorbicillinoids的影响

4.3.7 Sor5基因的导入降低纤维素酶活

4.3.8 Sor5基因的导入对蛋白分泌的作用

4.4 本章小结

第五章总结与展望

5.1 总结

5.2 展望

致谢

参考文献

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 乔影

导师: 林凤鸣

关键词: 里氏木霉,基因簇,天然产物,次级代谢物

来源: 东南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 东南大学

分类号: Q935

DOI: 10.27014/d.cnki.gdnau.2019.004341

总页数: 86

文件大小: 3792k

下载量: 10

真菌高产次级代谢产物Sorbicillinoids的机理研究

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢