AtHIR3蛋白的单分子研究及其与AtVHA-A的相互作用

论文摘要

拟南芥过敏性诱导反应蛋白（hypersensitive induced reaction proteins,AtHIRs）是植物中特有的具有SPFH（stomatin/prohibitin/flotillin/Hflk/C）结构域的蛋白,与膜筏的形成密切相关并在植物免疫过程中发挥重要功能。本研究通过激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope,LSCM）和可变角度全内反射荧光显微镜（variable-angle total internal reflection fluorescence microscope,VA-TIRFM）对拟南芥AtHIR3蛋白进行研究,发现AtHIR3-EGFP在拟南芥幼苗的不同组织中均有表达,并主要定位于液泡膜,进一步观察发现AtHIR3-EGFP在液泡膜上的分布不均匀。AtHIR3-EGFP在液泡膜上的运动方式包括布朗运动、受限运动、定向运动和混合运动。蛋白质谱分析发现,V-ATPase（液泡膜H+-ATPase）复合体的VHA-A亚基与AtHIR-EGFP处于同一复合体。运用双分子荧光互补（BiFC）和酵母双杂交实验进一步证明,AtHIR3和AtVHA-A蛋白存在相互作用。共聚焦显微镜观察发现AtHIR3与AtVHA-A共定位于拟南芥的液泡膜上。在Athir3突变体中,AtVHA-A-EGFP的扩散系数、运动范围和荧光漂白后恢复速率均大于野生型。此外,Athir3拟南芥幼苗根表皮细胞液泡的pH值略有升高,在NaCl处理1h后,Athir3突变体中液泡pH值升高的幅度高于野生型。进一步分析NaCl对AtHIR3-EGFP在液泡膜上运动的影响,发现NaCl使其扩散系数降低,运动范围减小。综上,AtHIR3蛋白主要位于拟南芥液泡膜,并与V-ATPase的VHA-A亚基相互作用,限制了 VHA-A蛋白在液泡膜上的运动。这些结果表明,AtHIR3蛋白可能通过招募VHA-A蛋白到液泡膜膜筏微区,促进V-ATPase将H+转运到液泡内的过程,相关结果为阐明V-ATPase的H+转运调控机制提供了新观点。

论文目录

摘要

ABSTRACT

1 引言

1.1 膜筏与SPFH蛋白

1.1.1 膜筏及其功能

1.1.2 SPFH蛋白与膜筏的关系

1.2 过敏性诱导反应蛋白

1.2.1 过敏性诱导反应蛋白的发现

1.2.2 过敏性诱导反应蛋白的定位

1.2.3 过敏性诱导反应蛋白的功能

1.3 液泡膜蛋白及其功能

1.3.1 液泡膜蛋白的种类

1.3.2 液泡膜蛋白的动力学特征

1.3.3 液泡膜蛋白的功能

1.4 AtHIR3蛋白及其特点

1.5 VHA-A蛋白及其特点

1.6 研究技术

1.6.1 可变角度全内反射荧光显微术

1.6.2 荧光漂白恢复技术

1.6.3 荧光相关光谱技术

1.7 本论文的研究内容与意义

2 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 拟南芥材料及培养方法

2.1.2 烟草材料及培养方法

2.1.3 菌株

2.1.4 质粒

2.1.5 试剂

2.1.6 溶液配制

2.2 实验方法

2.2.1 AtHIR3蛋白与其他物种中HIR蛋白的进化分析

2.2.2 AtHIR3启动子序列的获取及分析

2.2.3 AtHIR3蛋白质序列及三维结构分析

2.2.4 拟南芥基因组DNA的提取

2.2.5 拟南芥cDNA的获得

2.2.6 质粒小量提取

2.2.7 琼脂糖凝胶DNA的回收

2.2.8 大肠杆菌感受态的制备

2.2.9 农杆菌感受态的制备

2.2.10 大肠杆菌的转化与阳性克隆鉴定

2.2.11 农杆菌的转化与阳性克隆鉴定

2.2.12 融合蛋白载体构建

2.2.13 烟草瞬时表达

2.2.14 拟南芥稳定转化及转基因植株的筛选

2.2.15 突变体鉴定

2.2.16 拟南芥植株的杂交

2.2.17 激光扫描共聚焦显微镜观察

2.2.18 全内反射荧光显微镜的图像采集与处理

2.2.19 原生质体和液泡的提取与观察

2.2.20 免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）

2.2.21 双分子荧光互补技术（BiFC）

2.2.22 酵母双杂交技术

2.2.23 液泡pH检测

3 实验结果

3.1 AtHIR3的克隆及编码蛋白分析

3.1.1 AtHIR3基因的扩增

3.1.2 AtHIR3基因的启动子分析

3.1.3 AtHIR3与其他物种HIR的进化分析

3.1.4 AtHIR3蛋白质序列分析及三维结构预测

3.2 AtHIR3载体的构建及其在拟南芥中的稳定表达

3.2.1 AtHIR3载体的构建

3.2.2 将AtHIR3载体转入拟南芥植株中并稳定表达

3.3 AtHIR3定位于液泡膜

3.3.1 AtHIR3-EGFP在拟南芥幼苗不同组织中均有表达

3.3.2 AtHIR3-EGFP的亚细胞定位

3.4 AtHIR3-EGFP在液泡膜上的分布和动力学分析

3.4.1 AtHIR3-EGFP在子叶表皮和胚轴细胞液泡膜上的运动状态分析

3.4.2 AtHIR3-EGFP在液泡膜上的分布和运动方式分析

3.5 AtHIR3蛋白的互作蛋白分析

3.5.1 AtHIR3蛋白的质谱结果

3.5.2 BiFC实验检测AtHIR3与AtVHA-A互作

3.5.3 酵母双杂交实验检测AtHIR3与AtVHA-A互作

3.5.4 AtVHA-A-EGFP蛋白在拟南芥中的表达

3.6 野生型和Athir3液泡膜上AtVHA-A-EGFP的动力学分析

3.6.1 野生型和Athir3液泡膜上AtVHA-A-EGFP的运动状态检测

3.6.2 荧光相关光谱技术检测VHA-A-EGFP的扩散系数

3.6.3 野生型和Athir3突变体液泡膜VHA-A-EGFP的荧光漂白恢复检测

3.7 Athir3突变体的液泡pH值较高

3.8 AtHIR3-EGFP在液泡膜上的运动状态受NaCl的影响

4 讨论

5 结论

6 参考文献

个人简介

导师简介

获得成果目录清单

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 隋鑫

导师: 荆艳萍

关键词: 液泡膜,动力学,蛋白相互作用

来源: 北京林业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 北京林业大学

分类号: Q946.1

DOI: 10.26949/d.cnki.gblyu.2019.000753

总页数: 80

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