江宏兵[1]2004年在《颅神经嵴干细胞的体外分离培养及其成牙分化诱导研究》文中进行了进一步梳理本课题结合牙胚发育生物学、干细胞生物学及组织工程技术的有关研究成果和方法,探索性地分离培养牙胚发生的上游干细胞—颅神经嵴干细胞(cranial neural crest stem cell, CNCSC),并以其为种子细胞,进行成牙本质样细胞表型分化的定向诱导,旨在确立CNCSC用于牙再生的可行性,为进一步开展功能性牙组织工程研究奠定理论和方法学基础。 颅神经管组织块无血清条件培养法分离培养CNCSC,形态学、BurdU渗入及免疫荧光细胞化学等方法鉴定其生物学性状及干细胞特征。原代培养的CNCSC形态上呈梭形成纤维样细胞,特异性标记物HNK-1阳性表达;表现为克隆样生长、自我更新以及在不同诱导条件下出现多向分化能力等干细胞特征。本实验成功地获取CNCSC,并呈现多潜能干细胞的生物学性状,为研究其牙向分化诱导确立细胞学基础。 无血清条件培养法培养颅神经管组织块,通过Hoxa2原位杂交及vimentin免疫荧光细胞化学染色鉴定细胞分化表型。结果发现,迁出前颅神经嵴细胞在100ng/ml FGF8作用下,呈现第一鳃弓外胚间充质细胞表型分化,呈现Hoxa2阴性表达而vimentin阳性表达。本实验证实,FGF8可诱导CNCSC向第一鳃弓外胚间充质细胞表型分化,且具有早期诱导时相性特征,为进一步诱导其牙向分化提供理论及实验
刘小博[2]2017年在《小鼠神经嵴干细胞体外培养及其成牙潜能的研究》文中研究指明蕾状期后的小鼠牙胚间充质具有成牙潜能,能与非牙源性上皮重组形成牙齿,因此常被用于诱导具有干细胞特性的上皮细胞参与再生牙齿的构建。已知牙胚间充质是由神经嵴干细胞迁移到第一鳃弓发育而来的,我们已建立人iPS向神经嵴细胞分化的平台,但如何将iPS衍生的神经嵴细胞诱导成具有成牙潜能的成牙间充质细胞尚不明确。基于人与鼠在牙齿发育过程中的相似性,本研究将对鼠源神经嵴干细胞进行体外培养及其成牙潜能的研究。本研究将从8.5天的胎鼠中分离获得神经嵴干细胞,在体外建立合适的培养环境后,通过特异基因表达和表面标记分子分析对所获得的神经嵴干细胞进行评价,同时对神经嵴干细胞进行矿化成骨的诱导,检测神经嵴干细胞是否具有分化成骨的能力,为神经嵴干细胞成牙分化能力提供基础和保障。通过CCK8实验来进一步对第叁代神经嵴干细胞的增殖能力进行评价。将神经嵴干细胞与小鼠胚胎14.5天(E14.5)的牙胚上皮重组、移植等实验,探索神经嵴干细胞是否具有成牙潜能。本研究发现,将8.5天胎鼠分离的出的神经管贴到细胞培养皿中,神经干细胞从神经管中迁移出来,围绕神经管的四周,细胞呈梭状型。通过免疫荧光实验显示这些细胞在P0代时,E-Caherin、Pax3、P75和HNK1上呈阳性表达,Pax6的阴性表达;而在P3时期的细胞显示在P75、HNK1和Ap2α上的呈阳性表达,而在Pax6上呈阴性表达。P0代细胞和P3代细胞都分别表达了神经嵴的特性,并且没有表达神经干的特性。说明在体外的环境下利用无血清条件培养基来培养小鼠神经嵴干细胞,可以保持小鼠神经嵴干细胞的特性;通过qPCR实验检测不同代数的神经嵴干细胞,结果表明:虽然神经嵴基因在传代的过程中有缺失,但是其神经嵴基因水平仍比较高。牙源基因虽然有表达但是表达水平比较低。神经干细胞基因在后期传代的神经嵴细胞中少量表达;通过CCK8实验检测,结果表明:随着培养天数的增加,神经嵴干细胞呈逐渐增长的形式。说明神经嵴干细胞可以在我们所提供的培养基中稳定的生长,维持细胞的繁殖;将神经嵴干细胞在体外成骨诱导分化后,通过茜素红染液染色,出现桔色沉积。通过qPCR实验发现,矿化后的神经嵴干细胞在四组成骨基因中其表达均有增高,尤其在Ocn、Bmp3和Bmp2叁组的其表达远高于其他叁组对照,检测结果表明,神经嵴干细胞可以分化成骨;将神经嵴干细胞与牙胚上皮重组、移植等实验,通过HE染色我们可以观察到在P3和P5中显示存在牙齿结构,证明神经嵴干细胞是具有成牙潜能。综述所述,通过神经嵴干细胞体外的培养、鉴定、检测等实验,证明神经嵴干细胞具有成牙潜能。这个结果为寻找神经嵴干细胞在体外诱导获得牙源间充质细胞的途径提供了良好的基础,进而为人iPS衍生的神经嵴细胞向成牙间充质细胞的分化提供重要的参考依据,从而推动干细胞体外定向分化为成牙间充质细胞的实现。
参考文献：
[1]. 颅神经嵴干细胞的体外分离培养及其成牙分化诱导研究[D]. 江宏兵. 四川大学. 2004
[2]. 小鼠神经嵴干细胞体外培养及其成牙潜能的研究[D]. 刘小博. 吉林大学. 2017