朱丹[1]2003年在《小鼠器官发育中β-1，3（4）-半乳糖基转移酶的表达及功能的研究》文中指出胚胎发育过程中伴随着细胞表面糖链表达水平及结构的改变，研究表明这些改变参与介导了胚胎细胞之间的粘附联系，因此，糖链对于胚胎正常发育是必须的，一些糖链结构(如N-连接糖链，糖鞘脂，透明质酸，唾液酸等)的表达缺失能导致小鼠死亡于胚胎的早期发育阶段。复杂的糖链结构是由糖基转移酶依此加工合成的，糖基转移酶在发育过程中的表达水平及生物活性决定了某一特定糖链在发育中的表达变化。Galβ1→3(4)GlcNAc为两种常见的寡糖链结构，其中Galβ1→3GlcNAc为1型链结构，由β-1，3-半乳糖基转移酶(β3GalT)家族合成；Galβ1→4GlcNAc为2型链结构，由β-1，4-半乳糖基转移酶(β4GalT)家族合成。β4GalT-1基因敲除的小鼠表现为生长迟缓，出生后死亡率增加，上皮过度增生和内分泌失调等发育障碍，而至今尚未有β3GalT-1基因敲除小鼠的研究报道。β-1，3-半乳糖基转移酶-1(β3GalT-1)主要在脑中表达，而β-1，4-半乳糖基转移酶-1在睾丸中表达较高，且精子细胞表面的β-1，4-半乳糖基转移酶-1在精卵结合后的顶体反应中发挥了重要的生理作用。本课题重点分析了在小鼠脑及睾丸发育过程中β-1，3(4)-半乳糖基转移酶的表达变化，检测了它们在组织中的表达定位，并初步研究了β-1，3(4)-半乳糖基转移酶在脑和睾丸发育过程中的生理功能。 我们首先检测了在脑发育过程中β-1，3-半乳糖基转移酶-1的表达变化。我们用Northern Blot的分析方法发现在18天龄胚鼠、新生鼠和1周龄鼠的脑组织中β3GalT-1表达很高，随着发育进程，它的表达水平明显降低：灰度扫描定量分析表明1周龄鼠脑中β3GalT-1的表达量大约是12周龄鼠脑表达水平的10倍，这说明β3GalT-1的表达是受发育调控的。我们也检测了此家族中其他两个重要的参与合成1型链结构的成员——β3GalT-2和β3GalT-5在小鼠脑发育过程中的表达水平。β3GalT-2的表达在发育的各个时期都相对较低，而在小鼠脑发育的整个过程中，Northern Blot都检测不到β3GalT-5mRNA的表达，这说明在小鼠脑中β3GalT-1可能是负责1型链结构合成的关键酶。我们进一步分析了β3GalT-1转录产物的脑区域分布。我们发现：在大脑皮质和海马中，β3GalT-1的表达水平在发育进程中都相对较高；在间脑和脑干中，β3GalT-1的表达水平则较低；而在小脑中，β3GalT-1在新生鼠中表达很高而在成年鼠中表达明显下降。原位杂交分析显示新生鼠小脑中，β3GalT-1在蒲肯野细胞和颗粒层细胞中有强表达，而在成年鼠小脑中，2000级博士生学位论文p3GalT一1在颗粒层细胞的表达基本消失，这可能是p3GalT一1在小脑发育前后表达差异的原因。我们对p3Ga1T一1在脑发育过程中的功能也做了初步研究，我们通过免疫组织化学实验分析了1型链结构在小鼠脑发育中的表达变化及分布定位。我们发现在小脑中1型链结构的变化与邵GalT一1的表达变化基本一致:在新生鼠小脑中，1型链结构在蒲肯野细胞和颗粒层细胞中都有表达，而在成年鼠小脑中，1型链结构仅在蒲肯野细胞中表达。然而在海马中，尽管p3Ga1T一1的表达水平持续较高，却未能检测到1型链结构的表达。 我们其次分析了p一1，4一半乳糖基转移酶家族在翠丸发育过程中的表达变化。我们发现在小鼠辜丸发育过程中，p一1，4一半乳糖基转移酶家族的6个成员表达方式各不相同:p4Ga1T一1的转录体大小约为4.Ikb，在第1，2周龄的小鼠翠丸中表达较高，而在这之后，其表达量急剧下降。相反，p4Ga1T一2转录体的表达在发育过程中逐渐增高，并在成年小鼠的翠丸中保持最高水平。p4Ga1T一3和p4GalT一5在发育的每一个阶段的表达都比较低;p4Ga1T一4仅在一周龄小鼠的翠丸中有较低水平的表达;而p4Ga1T一6的表达量在小鼠翠丸的整个发育过程中都没有检测到。由于p4Ga1T一2在成年小鼠皋丸中表达最高，我们进一步用原位杂交分析了其在生精小管内的表达定位。我们发现p4Ga1T一2的表达水平是生精周期特异的，在精子发生早期阶段(I一V期)相应的生精上皮中的表达水平较低，而在位于精子发生晚期(VI一XH期)阶段相应的生精上皮中则表现出较高的表达量。我们也对p4Ga1T在皋丸发育过程中的功能做了初步研究，凝集素组织化学实验表明p一l，4一半乳糖基转移酶家族成员在皋丸发育中的差异性表达能够影响2型链结构的表达水平及分布:随着发育成熟，2型链结构主要表达定位在生精小管中央精子细胞密集区。 我们的实验研究表明p一1，3(4)一半乳糖基转移酶在小鼠特定器官中的表达水平是受发育调控的，其表达定位也可以随着发育成熟而发生变化，p一1，3(4)一半乳糖基转移酶的活性也是受发育调控的并能影响其催化产物Galpl~3(4)GlcNAc的表达水平及分布定位。
宗灿华[2]2013年在《奶牛乳腺主要乳成分合成代谢的转录组学研究》文中研究指明乳腺是哺乳动物特有的器官,乳腺的功能是泌乳。哺乳动物乳腺经历了形态和结构上-系列的变化,这些变化与乳腺的物质代谢密切相关,乳腺物质代谢直接影响乳的质量和产量。目前尚缺乏对乳腺物质代谢的系统研究。本实验以荷斯坦奶牛为实验材料,采用荧光定量PCR技术检测αs1-casein、αs2-casein、 β-casein、κ-casein、β-lactoglobin、WAP基因在乳腺发育各时期的表达,结果显示,这些蛋白质基因在泌乳期表达均上调。PCR技术检测与乳腺蛋白质转录和翻译作用相关的PRLR、 AKT1、STAT5、 ELF5、EIF4EBP1、S6K基因表达,结果显示,EIF4EBP1的基因表达下调,其它基因表达上调,并且与乳蛋白质基因表达趋势基本一致,提示EIF4EBP1对泌乳具有抑制作用,其它基因在转录或翻译水平调控乳蛋白质的合成。PRLR通过JAK2激活STAT5在转录水平发挥作用,AKT1则通过mTOR对EIF4EBP1的负调控和对S6K的正调控在翻译水平发挥作用。采用HPLC方法检测乳腺中β-酪蛋白,最早出现在妊娠6个月。采用荧光定量PCR技术检测乳腺发育各时期一系列乳脂合成相关基因,脂肪酸摄入(VLDLR、LPL)、外源胆固醇运输(ABCA1、ABCG2)、细胞内脂肪酸运输(FABP3、ACBP)、长链(ACSL1)和短链脂肪酸(ACSS2、ACSS1)的活化、脂肪酸从头合成(ACACA、FAS)、去饱和(SCD、FADS1、FADS2)、叁酰基甘油合成(AGPAT6、GPAM、LPIN、DGAT1、DGAT2)、脂质小滴形成(BTN1A1、XDH、ADFP)(?)口转录调节(PPARG、SREBF1、SREBF2)等基因的表达,结果显示这些基因在泌乳期表达上调。SREBP1、SREBP2和PPARG对乳脂合成相关的许多基因表达具有调控作用,PRLR、AKT1对奶牛乳腺脂代谢的调控主要是通过PRLR、AKT1对SREBP1的调控来实现。采用气相色谱方法检测乳中脂肪酸组成及含量,荷斯坦奶牛乳脂肪酸中C18：1含量最高,其次为C16：0、C18：0。采用荧光定量PCR技术检测乳腺发育各时期GLUT1、HKⅠ、HKⅡ、LALBA、β-1,4-半乳糖基转移酶基因的表达,结果表明,这些基因在泌乳期表达上调,表明奶牛乳腺组织在泌乳期合成大量的乳糖。乳糖主要由β-1,4-半乳糖基转移酶和LALBA催化合成。采用HPLC方法检测乳腺乳糖含量,直到妊娠6月乳腺开始出现乳糖。采用Western blotting (?)(?)免疫荧光法对奶牛乳腺发育各时期GLUT1蛋白水平表达及GLUT1蛋白定位进行检测,结果表明：在乳腺发育各时期,GLUT1蛋白水平和GLUT1mRNA水平表达趋势相似。青春期,乳腺中GLUT1mRNA和蛋白的表达量较低；妊娠期开始升高,整个泌乳期持续高表达,泌乳140日达到峰值,此后开始下降。进入退化期,乳腺上皮细胞凋亡,GLUT1蛋白和GLUT1mRNA表达显着下降。青春期和妊娠早期,GLUT1主要定位在乳腺导管上皮细胞；妊娠晚期和泌乳期,GLUT1主要定位在乳腺上皮细胞基底侧细胞膜和顶膜；这些研究结果表明,奶牛乳腺主要通过GLUT1吸收葡萄糖为乳腺发育和泌乳提供能量和底物。
党凯[3]2016年在《冬眠不同时期达乌尔黄鼠比目鱼肌糖蛋白质组学的研究》文中研究表明废用性肌萎缩是临床上亟待解决的重要问题之一。尽管科研人员已经作了大量的研究,但目前仍未找到阻止和治疗废用性肌萎缩的有效措施,其主要的原因在于我们对废用性肌萎缩的分子机制仍缺乏了解。冬眠是冬眠动物应对冬季低温和食物缺乏等不利因素所特有的生存策略,其过程可以长达数月。在历经长期的冬眠期不活动后,冬眠动物的骨骼肌并未出现明显的废用性肌萎缩。因此,冬眠动物是一个天然的抗废用性肌萎缩研究模型。阐明冬眠动物骨骼肌这种特殊适应现象的发生机制是生理生态学领域亟待研究的重要课题,对航天、临床、运动及康复医学等领域亦有重要借鉴意义。蛋白的糖基化(glycosylation)是指将糖或者寡糖通过酶促反应连接到蛋白质上,这是蛋白质最重要的翻译后修饰方式之一。据估计,人类约70%的蛋白质被多种糖结构所修饰。越来越多的证据表明多种病理状况引起的肌肉萎缩与蛋白的糖基化密切相关。作为糖基化方式之一,O-乙酰葡萄糖胺(O-acetylglycosamine,O-GlcNAc)可以通过控制肌蛋白合成来调控废用性肌萎缩；蛋白的唾液酸化(sialylation)水平的降低是导致肌纤维降解、肌肉力量减弱及肌重减轻的重要原因之一；多种导致肌肉萎缩或功能障碍的肌肉疾病如有镶边空泡远端肌病(distal myopathy with rimmed vacuoles, DMRV)和先天性肌营养不良(congenital muscular dystrophy, CMD)均被证实与肌肉中蛋白糖基化的异常紧密相关。我们本次研究以达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus)为实验对象,选取典型的慢肌比目鱼肌(soleus, SOL)为代表,首次对冬眠不同时期黄鼠比目鱼肌糖蛋白组质学进行系统研究,从新的角度探讨冬眠动物骨骼肌的抗废用性肌萎缩机制。第一部分：采用凝集素芯片技术检测冬眠不同时期达乌尔黄鼠比目鱼肌中糖蛋白糖基化的变化情况,并使用凝集素组化技术对芯片结果进行验证。芯片的分析结果显示,有8种凝集素的荧光强度值在冬眠过程中发生了显着性变化,分别为马鞍树凝集素-Ⅱ(Maackia Amurensis Lectin Ⅱ, MAL-Ⅱ)、四棱豆凝集素-Ⅰ(Psophocarpus Tetragonolobus Lectin Ⅰ,PTL-Ⅰ)、紫藤花凝集素(Wisteria Floribunda Lectin, WFA)、加纳子凝集素-Ⅰ(Griffonia Simplicifolia Lectin I, GSL-Ⅰ)、四棱豆凝集素-Ⅱ(Psophocarpus Tetragonolobus Lectin Ⅱ, PTL-Ⅱ)、曼陀罗凝集素(Datura stramonium, DSA)、欧洲卫矛凝集素(Euonymus Europaeus Lectin,EEL)和菜豆凝集素-E+L(Phaseolus vulgaris Agglutinin E+L,PHA-E+L)。我们的结果显示：1)与冬眠前组相比,冬眠组凝集素MAL-Ⅱ所识别的糖链结构唾液酸(Sialic acid, SA)α2-3半乳糖(Galactose, Gal) (SAa2-3Gal)显着降低,而在激醒组和出眠组显着增加,恢复到冬眠前水平；2)PTL-Ⅰ所识别的αN-乙酰半乳糖胺(αGalNAc)和Gal结构与SAa2-3Gal的变化趋势相似,即在冬眠中显着下降,在激醒和出眠时显着增加；3)与冬眠组相比,激醒组和出眠组的WFA特异性识别的末端GalNAc (Terminal GalNAc)结构显着增加；4)与其它叁组相比,GSL-Ⅰ和PTL-Ⅱ特异性识别αGalNAc和Gal结构在激醒组中显着性的增加；5)与冬眠前组相比,DSA识别的GlcNAc结构在冬眠组显着性增加,而在激醒组和出眠组显着下降,恢复到冬眠前水平；6)与其它叁组相比,凝集素EEL识别的半乳糖α1-3(岩藻糖α1-2)Gal(岩藻糖,Fucose, Fuc)结构在冬眠组显着增加；7)与冬眠前组相比,冬眠组、激醒组和出眠组SOL的PHA-E+L特异性识别的叁天线和四天线复杂型N-糖链(Tri-and tetra-antennary complex-type N-glycan)结构显着性增加。我们选取了MAL-II, PTL-I,DSA和PHA-E+L四种凝集素作了凝集素组化实验。组化的结果与凝集素芯片的结果相一致,进一步验证了凝集素芯片的实验结论。总之,这一部分的结果提示,黄鼠周期性阵间激醒过程中,SAa2-3Gal结构的显着性增加有效地补偿了其在冬眠过程中的减少,对于维持冬眠黄鼠骨骼肌正常的结构和功能,防止其废用性萎缩起到了重要作用；由于PTL-Ⅰ、WFA、GSL-Ⅰ、PTL-Ⅱ四种凝集素特异性识别的糖链结构均为O-连接的糖链,因此推测,O-连接的糖链在激醒过程中的增加可能与冬眠黄鼠特有的保护性机制有关；此外,叁天线和四天线型的糖蛋白N-糖链在整个冬眠过程中均显着性增加,可能与黄鼠骨骼肌对冬眠废用的生理适应机制有关。第二部分：本文第二章的结果表明,黄鼠周期性阵间激醒过程中,SAa2-3Gal结构的显着性增加有效地补偿了其在冬眠过程中的减少,而正常的唾液酸含量对于维持肌肉的形态、结构、功能有着重要的作用。因此,本部分实验的研究目的是通过测定冬眠不同时期黄鼠比目鱼肌中β-半乳糖-α-2,3-唾液酸糖基转移酶(sialyltransferasebeta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferases)(包括ST3Gall、ST3Gal2、 ST3Gal3、ST3Gal4、T3Gal5、ST3Gal6)与唾液酸糖苷酶(sialidases)(包括NEU1、 NEU2、NEU3、NEU4) mRNA表达的变化情况,从糖相关基因mRNA水平对SAa2-3Ga在冬眠不同时期的变化机制进行分析。我们的结果显示,与冬眠前组相比,冬眠组ST3Gall的mRNA表达量显着性降低(-55.00%；P<0.01),而激醒组和出眠组ST3Gall的mRNA表达量与冬眠组相比,均显着性升高(114.30%和126.20%,P<0.01),与冬眠前组相比无显着性的差异(P>0.05)。相比于冬眠前组,ST3Gal2的mRNA表达量在冬眠组显着性降低(-42.70%,P<0.01),而与冬眠组相比,激醒组和出眠组mRNA表达量均显着性升高(77.30%和76.50%,P<0.01),冬眠前组、激醒组与出眠组的ST3Gal2的mRNA表达量无显着性的差异(P>0.05)。冬眠组ST3Gal5的mRNA相对表达量相比于冬眠前组显着性降低(-60.91%,P<0.01),而在激醒组和出眠组中ST3Gal5的mRNA表达量分别较冬眠组出现显着性升高(160.56%和125.48%,P<0.01),与冬眠前组相比没有显着的差异(P>0.05)。NEU1、NEU3和ST3Gal6的mRNA表达量在冬眠四组中没有显着的差异(冬眠前组,冬眠组,激醒组,出眠组)(P>0.05)。我们的结果提示,ST3Gall、ST3Gal2及ST3Gal5 mRNA相对表达量的改变,即在冬眠中明显下降,在阵间激醒过程中和出眠后又恢复至冬眠前水平,可能是造成黄鼠SOL的SAa2-3Gal结构在冬眠期间变化的主要因素。第叁部分：本文第二章的研究表明,达乌尔黄鼠比目鱼肌中凝集素MAL-Ⅱ特异性识别的糖链结构SAa2-3Gal在冬眠过程中的显着变化可能在其抗废用性肌萎缩机制中起到重要作用。因此,本部分实验制备制备凝集素MAL-Ⅱ-磁性微粒复合物,分别从冬眠前和冬眠黄鼠比目鱼肌中提取末端为SAa2-3Gal的糖蛋白,利用LC-ESI-MS/MS对提取的糖蛋白进行鉴定,通过生物信息学对鉴定的糖蛋白进行进一步分析。从冬眠前组和冬眠组中分别鉴定出糖蛋白227个和185个。其中,只在冬眠前组鉴定出的糖蛋白为141个,只在冬眠组鉴定出的糖蛋白为99个,在两组中均鉴定出的糖蛋白数为86个。GO (Gene Ontology)功能注释分析显示：根据细胞成分注释,鉴定的糖蛋白主要是胞内蛋白,并且很多为大分子蛋白质,主要分布在细胞器中和膜结构上。根据分子功能注释,这些糖蛋白具有结合、催化以及结构分子活性等方面的功能。根据参与的生物过程注释,这些糖蛋白主要涉及细胞过程、刺激应答、代谢过程以及生物调节等生物过程。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析显示,从冬眠前组和冬眠组SOL分离出的糖蛋白显着性富集的通路分别为40条和36条,其中,只在冬眠前组显着性富集的通路有14条,而只在冬眠组显着性富集的有10条。使用IntAct数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用分析,利用Cytoscape欠件分布构建了冬眠前组和冬眠组糖蛋白的蛋白质相互作用网络图(The protein-protein interaction network, PPI network),筛选出9个度值(degree)大于30的核心蛋白质。第四部分：本部分实验选取了2个糖蛋白进行验证,分别为热休克同源蛋白(heat shock cognate 70,HSC70)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK),检测冬眠过程中其蛋白表达和SAa2-3Gal结构的变化情况。此外,检测黄鼠SOL中14-3-3 protein epsilon蛋白表达在冬眠不同时期的变化情况,分析其在抗废用性肌萎缩机制中的潜在作用。我们的结果显示,与冬眠前相比,冬眠组的HSC70蛋白的表达量显着降低了37.39%(P<0.01),与冬眠组相比,激醒组的HSC70蛋白的表达量显着上升了51.39%(P<0.01),出眠组显着上升了41.67%(P<0.01),冬眠前组、激醒组和出眠组叁组之间无显着性差异(P>0.05)；PK蛋白的表达在四组之间无显着性差异(冬眠前组,冬眠组,激醒组,出眠组)(P>0.05)；与冬眠前组相比,冬眠组的14-3-3 protein epsilon的表达量显着降低了42.59%(P<0.01),与冬眠组相比,激醒组的14-3-3 protein epsilon的表达量显着性上升了51.61%(P<0.01),出眠组显着性上升了58.06%(P<0.01),冬眠前组、激醒组和出眠组叁组之间无显着性差异(P>0.05)；与冬眠前组相比,冬眠组糖蛋白HSC70的SAa2-3Gal结构显着减少30.08%(P<0.01),与冬眠组相比,激醒组的SAa2-3Gal结构显着增加了37.66%(P<0.05),而出眠组显着性增加54.50%(P<0.01),冬眠前组、激醒组和出眠组叁组之间无显着性差异(P>0.05)；与冬眠前组相比,冬眠组糖蛋白PK末端SAa2-3Gal结构显着减少29.40%(P<0.01),与冬眠组相比,激醒组的SAa2-3Gal结构显着增加了30.91%(P<0.05),出眠组显着性增加34.41%(P<0.05),冬眠前组、激醒组和出眠组叁组之间无显着性差异(P>0.05)。结果表明,冬眠不同时期黄鼠比目鱼肌中HSC70、PK、14-3-3 protein epsilon叁种蛋白的变化(包括蛋白表达和SAa2-3Gal糖结构)可能与其特有的抗废用性肌萎缩机制相关。
仇灏[4]2010年在《β3-乙酰氨基葡萄糖基转移酶对白血病细胞分化的影响及其调控机制》文中研究表明已有大量的文献报道:当细胞恶变或分化时,细胞糖复合物上的糖链结构常发生变化,而这种变化来源于某些合成该糖链的相应的糖基转移酶表达的改变。β1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(β3GnTs)家族参于合成其产物中的β1,3-乙酰氨基葡萄糖连接键,其中β3GnT-2, -4, -8亚型合成糖蛋白上N-或O-连接型糖链中的多聚乙酰氨基乳糖结构。本研究探讨这叁种酶的表达和四株白血病细胞分化间的关系,以及转录因子Ets-1对β3GnT-2, -4, -8表达的调控。本论文分为叁个部分:一、β3GnT-2, -4, -8和人急性早幼粒白血病细胞株HL60及NB4分化的关系目的:研究糖基转移酶β3GnT-2, -4, -8表达变化和人急性早幼粒白血病细胞株HL60及NB4分化的关系。方法:RT-PCR检测β3GnT-2, -4, -8在六种不同白血病细胞株中的表达情况。其次,使用ATRA处理HL60和NB4两种人急性早幼粒白血病细胞株,使其向粒细胞方向分化;或用TPA(PMA)处理两种细胞株,使其向单核细胞方向分化。用实时定量PCR(Real-time PCR)检测β3GnT-2, -4, -8的mRNA诱导分化前后在两个细胞株中的表达变化,并结合细胞形态学观察鉴定ATRA、TPA处理前后两个细胞株的形态变化。结果:β3GnT-2在白血病细胞株SHI-1,THP-1,K562,HL60,U937,NB4中都有不同程度的表达。β3GnT-4仅在NB4细胞中表达;而β3GnT-8则相反,在NB4细胞中不表达,而在其它5株细胞中有不同程度的表达。在10-7mol/L ATRA或10ng/ml TPA作用2h或3d后,不管HL60和NB4细胞株向何方向分化,其β3GnT-2, -4, -8的mRNA表达与不加分化诱导剂的对照组相比均见不同程度的升高。其中以β3GnT-4的改变最为显着,且有时间依赖性变化。β3GnT-8和β3GnT-2的上升幅度大致相近。ATRA使HL60和NB4细胞向粒细胞分化时,βGnTs的上调较TPA使两种细胞向单核细胞分化时明显;而HL60细胞的β3GnTs对两个分化诱导剂的上调作用较NB4细胞更为敏感。结论:早幼粒白血病细胞HL60和NB4在ATRA或TPA诱导向不同方向分化时,可见β3GnT-2, -4, -8的表达有不同程度的增加。ATRA的作用强于TPA;而HL60细胞对分化诱导剂的敏感性强于NB4细胞。二、β3GnT-2, -4, -8和人单核白血病细胞株SHI-1及THP-1分化的关系目的:研究糖基转移酶β3GnT-2, -4, -8表达变化和人单核白血病细胞株SHI-1及THP-1分化的关系。方法:在第一部分研究的基础上,改用人单核白血病细胞株SHI-1及THP-1为研究对象,用实时定量PCR(Real-time PCR)继续检测β3GnT-2, -4, -8的mRNA在ATRA、TPA处理前后两个细胞株中的表达变化,并结合细胞形态学观察鉴定。结果:SHI-1细胞在10-7mol/L ATRA作用2h后,β3GnT-2的mRNA表达即被下调,但3天后回复;而10ng/ml TPA作用2h或3d后,β3GnT-2均上调,第叁天更甚。β3GnT-4在TPA处理SHI-1细胞3d后,才见上调,其升高程度与β3GnT-2相仿。β3GnT-8在ATRA或TPA处理3d后才见轻度上调。THP-1细胞对ATRA、TPA均不敏感,其β3GnT-2, -4, -8的表达未见明显改变。与细胞形态学变化一致。结论:人单核白血病细胞株对ATRA及TPA的反应均不如人急性早幼粒白血病细胞株敏感,其β3GnT-2, -4, -8的mRNA表达变化不明显。尤其是THP-1细胞对本文所用浓度的ATRA及TPA都没有反应,与细胞形态学不改变相一致。叁、转录因子Ets-1对β3GnT-2, -4, -8表达的调控研究目的:探讨白血病细胞诱导分化过程中Ets-1的表达及其对糖基转移酶对β3GnT-2, -4, -8的转录调控。方法:采用Real-time PCR检测HL60、NB4、SHI和THP-1四种白血病细胞中转录因子Ets-1的mRNA在ATRA或TPA处理后的表达变化,并进一步采用染色质免疫沉淀(ChIP)结合凝胶迁移实验(EMSA)检测分析研究前叁种细胞中Ets-1和β3GnT基因DNA的结合以及Ets-1对β3GnT的转录调控。结果:在ATRA或TPA诱导分化下,HL60细胞中Ets-1 mRNA的表达均有不同程度的升高,且ATRA的作用似乎强于TPA。相反,NB4细胞和SHI-1细胞在ATRA或TPA作用后,总体上,Ets-1的表达都是下降的。THP-1细胞Ets-1的表达基本不变。ChIP检测发现:各个β3GnT的基因DNA检出谱基本上和第一部分用RT-PCR法检出的β3GnT mRNA的表达谱一致,结合EMSA证实有活化的Ets-1结合至β3GnT-2或/和β3GnT-8基因DNA片段,但未能检测到Ets-1对β3GnT-4的表达调控。结论:Ets-1很可能参与HL60和SHI-1细胞株中β3GnT-2和β3GnT-8在ATRA和TPA诱导分化时的表达调控,至少也是调控因素之一。但NB4细胞中的β3GnT不受Ets-1的调节。
杨圣菊[5]2007年在《β-1，4半乳糖基转移酶-I与瘢痕疙瘩胶原合成的初步研究》文中进行了进一步梳理目的:研究β-1,4-半乳糖基转移酶-I(β-1,4-galactosyltransferase-I,β-1,4GalT-I)在瘢痕疙瘩中的表达变化,以及β-1,4GalT-I与胶原合成的关系,初步探讨β-1,4GalT-I在瘢痕疙瘩纤维化进程中的作用。方法:收集瘢痕疙瘩标本10例,同时以正常人皮肤6例、增生性瘢痕7例作对照,常规制备冰冻切片,H-E染色、饱和苦味酸-天狼猩红偏振光法观察组织学结构及胶原的形态与分布,运用形态学图象分析软件计算组织中I、III型胶原的比例;试剂盒法检测标本中的羟脯氨酸(Hydroxyproline, HP)含量,估算其中胶原蛋白的含量,观察瘢痕疙瘩胶原合成情况;采用半定量RT-PCR法观察瘢痕疙瘩中β-1,4GalT-I的表达变化,以各泳道中β-1,4GalT-I与GAPDH条带的光密度比值表示β-1,4GalT-I mRNA的相对表达量,使用Stata7.0统计学软件进行单因素方差分析和两两比较,并应用相关分析判断各组织中β-1,4-GalT-I mRNA表达量与组织中胶原含量的相关性。结果:⑴与正常人皮肤相比,瘢痕疙瘩中真皮乳头层丰富,网状层增厚,含有大量胶原纤维束,粗大致密,排列密集,呈漩涡状的结节或板层状,其中成纤维细胞、毛细血管以及炎症细胞亦增多。⑵偏振光显微镜显示瘢痕疙瘩组织中含有大量且粗大致密的,发出强烈的红或黄色双折射光的I型胶原纤维,呈大块状或条索状分布,多呈波纹状平行排列,构成致密的宽带状纤维结构,约占(71.53±4.03)%;在I型胶原纤维束的周围区域可见散在的、发弱的绿色双折射光的、呈疏网状的III型胶原细纤维,约占(28.47±4.03)%,I、III型胶原比例为(2.56±0.53);与正常人皮肤组比较均有统计学意义(P<0.05);与增生性瘢痕组比较差异无显着性(P>0.05)。⑶瘢痕疙瘩组织中HP含量为(10.98±1.55)μg/mg,明显高于正常人皮肤组织(5.38±0.47)μg/mg,差异有统计学意义(P<0.01),与增生性瘢痕组(10.21±1.25)μg/mg比较差异无显着性(P>0.05),提示瘢痕疙瘩和增生性瘢痕纤维化程度明显高于正常人皮肤组。⑷瘢痕疙瘩组织中β-1,4-GalT-I mRNA的相对表达量为(0.2995±0.0825),也明显高于正常人对照(0.0451±0.0287),差异有统计学意义(P<0.01),与增生性瘢痕组(0.2769±0.0975)比较差异无显着性(P>0.05);β-1,4-GalT-I表达的高低与组织中胶原的含量具有相同的变化趋势,二者成正相关关系(r=0.9507,P<0.01)。结论:β-1,4-GalT-I表达的高低与瘢痕疙瘩组织中胶原合成密切相关,β-1,4-GalT-I可能参与了瘢痕疙瘩的发病过程并在胶原合成过程中发挥重要作用。目的:研究瘢痕疙瘩组织中β-1,4-糖苷键的合成及定位,探讨糖蛋白半乳糖基化作用在瘢痕疙瘩形成中的作用。方法:提取组织蛋白利用Lectin blotting法观察Galβ-1→4GlcNAc在瘢痕疙瘩组织中的表达;再利用特异性结合Galβ-1→4GlcNAc的RCA-I凝集素免疫荧光组织化学法检测Galβ-1→4GlcNAc在瘢痕疙瘩组织中的表达与定位,并与I型前胶原α1共定位,比较β-1,4-糖苷键在叁组组织中的表达变化。结果:⑴糖链染色结果发现,瘢痕疙瘩组织中的Galβ→1,4GlcNAc糖链结构与正常人皮肤组织之间有着细微的差别,在约30KD和40KD处的糖蛋白表达略增高,这表明瘢痕疙瘩组织中的部分糖蛋白半乳糖基化发生了相应的改变。⑵荧光显微镜下观察组化结果发现RCA-I受体——Galβ-1,4GlcNAc group基本均匀分布在瘢痕疙瘩组织成纤维细胞胞膜和细胞浆内,与正常人皮肤相比,该受体的表达量明显增加;增生性瘢痕组织成纤维细胞中有类似的表现。⑶RCA-I受体与I型前胶原α1有很好的共定位,主要位于成纤维细胞细胞膜和细胞浆内,在增生性瘢痕组织成纤维细胞中分布大致相同,表达量也明显增加,。结论:Galβ-1,4GlcNAc在瘢痕疙瘩组织中的表达量发生了变化,提示Galβ-1,4GlcNAc可能参与了瘢痕疙瘩修复过程中纤维过度形成的修饰调控。
陈晓月[6]2008年在《禽流感重组枯草芽孢杆菌的构建及实验免疫研究》文中研究说明为研制安全有效并能常温保存的粘膜免疫AIV疫苗,本研究采用枯草芽孢杆菌(B.S.)识别的启动子和信号肽构建了表达载体pBC38C,并将GFP基因克隆到pBC38C中,筛选阳性重组质粒,转化入B.S.,阳性菌的菌体和菌落均有明显荧光,证实了表达载体能实现外源基因在B.S.中表达。在选择压力条件下,质粒遗传稳定率为96 %左右,无选择压力下,稳定性下降,为56 %左右。以lacZ为报告基因,测定表达载体的活性,β-半乳糖苷酶活性最高为26 mU/mL。对小鼠进行大剂量、长时间饲喂,结果证实菌株对动物安全,能非特异性地提高小鼠细胞免疫水平。将AIV H5N1 HA基因克隆到pBC38C中,构建HA基因重组B.S.,以CTB为基因佐剂,Western blot、IFA等检测表明,HA基因在B.S.中得到表达。小鼠免疫试验结果表明,所构建的重组菌能刺激小鼠产生较高水平的抗AIV HA特异性细胞免疫和粘膜免疫以及低水平的体液免疫,CTB作为粘膜免疫佐剂,能提高粘膜免疫水平。
马娜娜[7]2013年在《番茄NAC1转录因子的功能分析》文中指出肉质果实成熟是一个精细的遗传调控过程，涉及植物激素、生长调节因子和多种生物与非生物环境因子的相互影响。番茄是生物学和遗传学研究的模式植物，尤其是在成熟通路方面，包括乙烯、类胡萝卜素、细胞壁代谢以及上游信号和转录因子的研究。尽管为了揭示果实成熟的机理前人做了很多努力，但是启动果实成熟过程的遗传组分的核心尚未确定。NAC（NAM，ATAF1/2，CUC2）转录因子是近十年来新发现的具有多种生物功能的植物特异性转录因子，也是植物中最大的转录因子家族之一。该转录因子家族成员在植物的生长和发育过程中起着重要的作用，通过不同的时、空表达调节着胚胎的发育，顶端分生组织的形成，侧根的发育，次生细胞壁的形成，植物的衰老和果实的成熟等。除此之外，NAC转录因子还参与激素信号的调控以及植物对生物和非生物逆境反应等。本研究从番茄叶片中克隆到一个NAC转录因子SlNAC1，发现其通过调节乙烯和ABA的合成在果实成熟过程中起调节作用，并且过表达该基因提高了番茄植株的耐冷性。因此，开展SlNAC1的功能研究不仅对揭示番茄果实成熟的分子机理，而且对阐明NAC参与的植物低温响应机制同样具有十分重要的科学意义。本研究主要结果如下：（1）通过NCBI查得该基因的全长mRNA序列，设计特异引物，利用RT-PCR的方法获得该基因的全长cDNA。SlNAC1全长954bp，开放阅读框906bp，编码302个氨基酸，分子量约34.8KDa，N端具有保守的NAC结构域，C端为转录激活区。qRT-PCR结果说明，SlNAC1在花和果实中表达量较高，并且随果实成熟表达量增加，同时该基因的转录物受低温，高温，盐，干旱，机械损伤、氧化胁迫以及多种激素诱导。（2）将SlNAC1::GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中瞬时表达，利用激光共聚焦显微镜观察到该融合蛋白定位于细胞核中。（3）构建了原核表达载体pET-SlNAC1,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21中表达，将诱导的蛋白纯化后免疫小鼠，制备抗体，测得效价为1:100,000。Western杂交表明NAC1在蛋白水平受到低温、高温、干旱和高盐的诱导。过表达株系中NAC1蛋白的表达量增加，而反义株系中该蛋白的表达受到抑制。（4）将SlNAC1的编码区与pBI121载体重组，成功构建了过表达载体和反义表达载体，利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄，通过PCR、qRT-PCR以及western杂交检测具有卡那抗性的转基因植株，结果表明获得了过表达SlNAC1和反义抑制SlNAC1表达的转基因植株。与野生型相比，过表达株系的成熟果实为黄色或橙黄色，心皮数目减少，果皮变薄，种子变大变多；相反，反义株系成熟果实为深红色，心皮数和种子数减少，果皮变厚，种子变小。HPLC分析表明过表达株系果实中番茄红素减少，叶黄素和β-胡萝卜相对含量增加；反义果实番茄红素增加。气相色谱分析表明过表达株系果实乙烯含量明显低于野生型,但果实软化较早；反义果实乙烯释放延迟并且呼吸峰较野生型变小，果实软化延迟。（5）qRT-PCR结果显示，与野生型相比，过表达株系果实中番茄红素合成相关的基因表达下调，而番茄红素分解生成下游叶黄素和β-胡萝卜的基因上调；乙烯合成和信号转导相关的基因下调；与细胞壁代谢相关的基因表达上调。而反义株系果实中上述基因的表达情况与过表达株系相反。基因芯片的结果与qRT-PCR结果一致。酵母单杂交分析表明SlNAC1直接调控ACS2、ACS4、ACO1和PSY1的表达。（6）与野生型相比，过表达株系果实中ABA含量增加，而反义株系果实中ABA含量减少。与同一时期未处理的果实相比，用NDGA处理过表达株系MG时期的果实后，果实的硬度增加，果实成熟延迟，用ABA处理反义株系MG时期的果实后，果实硬度降低，并且果实成熟提前。qRT-PCR分析表明，ABA合成的关键基因NCED1和NCED2在过表达株系中上调，而在反义株系中这两个基因下调。（7）低温弱光（4℃，100μmol m-2s-1）处理后，野生型和过表达株系中的H2O2和O2含量及相对电导率和MDA均增加，野生型增加的更多；过表达株系和野生型的放氧速率以及PSⅡ最大光化学速率都下降，但野生型下降的更为明显。qRT-PCR分析表明过表达株系中CBF1的表达高于野生型，这些结果表明，SlNAC1可能通过上调CBF1的表达激活了下游的冷响应基因，提高了番茄植株的低温抗性。
陈玉栋[8]2006年在《病毒诱导牙鲆上调表达基因的筛选及牙鲆色素上皮衍生因子的特征分析》文中研究指明牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国已经形成规模经济效益的几种重要海水养殖鱼类之一。随着养殖集约化程度的提高,近年来频繁遭受病毒性疾病的侵袭并导致巨大经济损失。因此,深入研究牙鲆免疫系统的分子机制将为牙鲆疾病特别是病毒病的预防提供理论依据。本研究选用紫外灭活的具有双链RNA基因组的草鱼出血病病毒(grass carp hemorrhage virus,GCHV)对牙鲆胚胎细胞(flounder embryonic cells, FEC)进行诱导,运用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH),成功构建了dsRNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞基因差异表达的差减cDNA文库。从差减cDNA文库中,通过PCR和斑点杂交两轮筛选,共得到有效ESTs为148个。所得序列通过生物信息学分析表明,这些EST代表的相应基因的功能包括细胞分裂、信号传导、细胞结构、细胞防御、蛋白表达和代谢等几个方面。在上调表达的EST中,有叁个为色素上皮衍生因子(pigment epithelium- derived factor, PEDF)的同源基因(PoPEDF),该基因属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor, serpin)超家族中无抑制活性的成员之一,编码蛋白具有抗血管增生、神经营养和保护功能。但关于该基因与病毒诱导研究还未见报道。通过RACE-PCR方法,从SMART cDNA文库得到了PoPEDF基因的全长cDNA共1803bp,开放阅读框长1212bp,编码403个氨基酸。序列同源性比较、蛋白结构分析、基因组DNA的外显子与内含子组合及系统进化分析等都表明PoPEDF为哺乳动物PEDF的同源基因。PoPEDF与GFP共转染细胞及免疫组化结果表明,牙鲆PEDF是一种分泌蛋白,合成后的PEDF主要分布于细胞质而不在细胞核。连续观察发现表达的PEDF逐渐向细胞外分泌。在哺乳动物中,PEDF是一个多功能蛋白,其功能和调节机制非常复杂。以牙鲆和牙鲆胚胎细胞为材料,用不同的诱导剂诱导,对牙鲆PEDF的功能特性作了初步探讨。结果显示,PEDF对ATRA的诱导变化不明显;低葡萄糖浓度可以诱导PEDF的上调表达,随着葡萄糖浓度的升高,PEDF的表达逐渐降低;缺氧时,PEDF先上调表达,随后再下调表达;随着细胞培养时间的增加,
侯春喜[9]2009年在《人参皂苷生物合成关键酶基因MVD和βAS的克隆及βAS的反义表达》文中研究指明人参是我国道地中药植物,其活性成分主要是次生代谢过程中产生的人参皂苷。深入研究人参皂苷生物合成途径关键酶基因的结构与功能,以及利用基因工程手段调控这些关键酶基因活性,达到调控提高人参皂苷含量的目的,将具有重要的理论和实际应用价值。本论文选择二个具有代表性的基因为研究对象,开展了基因克隆及利用反义RNA技术调控人参皂苷生物合成的尝试工作。这二个基因分别是人参皂苷生物合成上游关键酶基因,既催化异戊二烯途径第一个前体物-异戊烯二磷酸(IPP)合成焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因(MVD),另一个基因是人参皂苷生物合成下游关键酶基因β-香树素合成酶基因(βAS),该基因编码的β-香树素合成酶是催化人参皂苷R0(人参次要活性成分)合成的关键酶。本论文用SMART RACE技术扩增人参MVD基因的保守序列,3’片段和5’片段,结果经过序列比对分析和拼接得到一个ORF为1254bp的片段,用此基因的ORF两端设计引物,扩增得到其cDNA全长。人参MVD基因在大肠杆菌中成功表达,其编码的蛋白分子量大小是46kd,与基因序列分析结果一致。(MVD基因在GenBank中的登录号:GQ455989)。利用反义表达策略,首次研究了βAS基因在人参皂苷生物合成中的功能。通过构建反义pBI121-AβAS植物表达载体,转入工程菌A4后转化人参根,对转化条件进行了筛选,获得反义人参发根系A5,A9,A19,A24和A30,Southern杂交结果显示目的基因拷贝数都是单拷贝。Northern杂交显示5株反义发根中的βAS转录水平显着下降,也说明反义βAS的导入确实可降低βAS的转录量,最多比对照组降低1/3。对酶活分析显示,反义发根系βAS活性均降低,同时,转基因发根系DAS活性被上调,DAS活性在所有的转化组中都获得增加,尤其在A19中增加了1.2倍。化学分析结果显示皂苷合成前体物2,3氧化鲨烯的积累增加。人参皂苷含量分析结果表明,齐敦果烷型人参皂苷R0含量均降低,最多降40%,转化发根的达玛烷型人参皂苷含量最高增加到原来的1.3倍,并且单体皂苷Rb1, Rb2, Rc, Rd,Re,Rf和Rg1均不同程度增加。这些研究成果对于促进MVD的异源表达、提高人参皂苷含量的种质资源的研究具有重要的指导作用,为调控人参皂苷的含量及人参代谢工程的研究奠定了理论和实践基础,具有广阔的应用前景。
参考文献：
[1]. 小鼠器官发育中β-1，3（4）-半乳糖基转移酶的表达及功能的研究[D]. 朱丹. 复旦大学. 2003
[2]. 奶牛乳腺主要乳成分合成代谢的转录组学研究[D]. 宗灿华. 东北农业大学. 2013
[3]. 冬眠不同时期达乌尔黄鼠比目鱼肌糖蛋白质组学的研究[D]. 党凯. 西北大学. 2016
[4]. β3-乙酰氨基葡萄糖基转移酶对白血病细胞分化的影响及其调控机制[D]. 仇灏. 苏州大学. 2010
[5]. β-1，4半乳糖基转移酶-I与瘢痕疙瘩胶原合成的初步研究[D]. 杨圣菊. 南通大学. 2007
[6]. 禽流感重组枯草芽孢杆菌的构建及实验免疫研究[D]. 陈晓月. 吉林大学. 2008
[7]. 番茄NAC1转录因子的功能分析[D]. 马娜娜. 山东农业大学. 2013
[8]. 病毒诱导牙鲆上调表达基因的筛选及牙鲆色素上皮衍生因子的特征分析[D]. 陈玉栋. 中国科学院研究生院（水生生物研究所）. 2006
[9]. 人参皂苷生物合成关键酶基因MVD和βAS的克隆及βAS的反义表达[D]. 侯春喜. 吉林大学. 2009
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