嗜热毛壳菌多糖单加氧酶的性质及协同作用研究

论文摘要

目前所开采利用的大多数能源属于不可再生能源,终究会开采殆尽。纤维素生物质因其丰富可再生的特点提供了成为替代能源的可能,纤维素生物质的利用成为了关键所在。木质纤维素能够经过一系列的酶促反应降解生成单糖,进而可转化为可利用的能源物质,因此高效快速的降解纤维素成为技术突破的重要方向。本文以嗜热毛壳菌AA9家族（Auxiliary Activity family 9）的多糖单加氧酶（PMO）为研究对象,将酶经毕赤酵母表达,对酶的最适反应温度、pH等性质进行探索;通过对酶降解磷酸膨胀纤维素后的产物运用TLC薄层层析法、基质辅助激光解析电离飞行质谱（MALDI-TOF-MS）等方法进行分析以确定PMO氧化的区域选择性;并测定PMO对外切纤维素酶CBH1,内切纤维素酶EG1和β-葡聚糖酶CT2三种纤维素酶的协同作用。本文将嗜热毛壳菌经微晶纤维素诱导培养后提取RNA并反转录为cDNA,设计引物进行PCR扩增得到12个完整的PMO基因片段。选择pPICZαA酵母甲醇诱导型表达载体构建pPICZαA-PMO重组表达载体质粒,将载体质粒经电击转化构建PMO酵母工程菌,工程酵母菌经甲醇诱导发酵7 d表达蛋白,用硫酸铵沉淀法沉淀后经蛋白纯化仪纯化蛋白,SDS-PAGE检测蛋白纯度和分子量大小,选择表达量高的PMO0728,PMO0762,PMO5456,PMO6622,PMO14091五个PMO蛋白继续后续试验。通过设置一系列的温度梯度和pH梯度分别反应,确定多糖单加氧酶的最适反应温度为50°C,反应最适pH为5.0。在最适反应条件下用表达的5种酶分别降解磷酸膨胀纤维素,然后对反应产物进行TLC分析,PMO5456产物量更多,活性最好,所以以PMO5456为后续试验研究对象。对PMO5456降解PASC产物进行的TLC分析显示可溶性产物中含有G2-G6寡糖,证明该酶具有降解PASC的活性。为进一步确定PMO5456的氧化作用方式,对其反应产物进行MALDI-TOF-MS分析,根据峰值大小对应分子量进行分析,产物中有C1氧化寡糖（aldonic acid,m/z+16）峰值和C4氧化寡糖（C4-ketoaldose,m/z-2）或C6氧化寡糖（C6-hexodialdose,m/z-2）的峰值。可以确定的是有C1氧化,但是无法区分出C4和C6氧化的各自峰值。为区分出C4和C6氧化,本文采取溴水氧化的方式对底物进行进一步氧化,产物再次进行MALDI-TOF-MS分析。C1氧化寡糖不会被溴水氧化,分子量不变;C4氧化寡糖与溴水发生反应,氧化后生成产物的分子量相比较氧化前增加14;若存在C6氧化寡糖,也会被Br2氧化,产物分子量相比较氧化前增加30;所以经Br2氧化后,C4和C6产物分子量产生差异。MALDI-TOF-MS分析图谱中的峰值可推断PMO5456降解PASC过程中有C4氧化也有C6氧化。最终确定PMO酶的氧化方式是C1、C4和C6氧化。PMO作为辅助活性家族成员,对纤维素酶活性的提高作用是其重要特性。本文选取了来自嗜热毛壳菌的CBH1,EG1和CT2三种酶,分别加入经过PMO5456预处理的PASC中,用DNS法测定酶活,并与原酶活进行比较,结果可见随着PMO5456处理底物时间增加,三种纤维素酶活性随之增加。PMO5456处理后,内切纤维素酶EG1的活性提高了3.6倍;外切纤维素酶CBH1提高了2.2倍;β-葡萄糖苷酶CT2的酶活提高了0.6倍。最终确定PMO5456的氧化方式包括C1,C4和C6。对不同纤维素酶的活性辅助作用有所区别,PMO5456对内切纤维素酶EG1的活性提高最明显,外切纤维素酶次之,β-葡萄糖苷酶的酶活提高幅度较低。

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中文摘要

Abstract

1 引言

1.1 纤维素生物利用

1.2 嗜热真菌研究进展

1.3 纤维素酶研究进展

1.3.1 纤维素酶分类

1.3.2 纤维素酶研究现状

1.3.3 纤维素酶应用

1.4 PMO研究进展

1.4.1 PMO命名与分类

1.4.2 PMO的氧化方式

1.4.3 PMO的协同作用

1.5 研究内容

1.5.1 本研究的技术路线

1.5.2 研究内容

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试验菌株与试剂

2.1.3 试验仪器

2.1.4 培养基

2.1.5 溶液配制

2.2 方法

2.2.1 嗜热毛壳菌AA9 家族序列及进化分析

2.2.1.1 嗜热毛壳菌AA9家族motif分析

2.2.1.2 嗜热毛壳菌AA9家族进化分析

2.2.2 嗜热毛壳菌RNA的提取,cDNA获得

2.2.2.1 嗜热毛壳菌RNA的提取

2.2.2.2 嗜热毛壳菌cDNA的获得

2.2.3 PMOs基因片段的扩增

2.2.4 克隆载体的构建

2.2.5 酵母工程菌构建

2.2.5.1 酵母表达载体的构建

2.2.5.2 表达载体质粒的线性化

2.2.5.3 电击转化

2.2.5.4 酵母工程菌的筛选及验证

2.2.6 PMOs蛋白的表达及分离纯化

2.2.6.1 PMOs蛋白的表达

2.2.6.2 PMOs蛋白分离

2.2.6.3 PMOs蛋白纯化

2.2.7 蛋白质SDS-PAGE检测

2.2.8 PMOs蛋白性质

2.2.8.1 最适反应温度测定

2.2.8.2 最适反应pH测定

2.2.9 PMOs酶解产物TLC鉴定

2.2.10 PMO5456氧化方式鉴定

2.2.10.1 PMO5456酶解产物的MALDI-TOF-MS鉴定

2氧化'> 2.2.10.2 PMO5456酶解产物的Br₂氧化

2.2.11 PMO5456蛋白与纤维素酶的协同作用

3 结果与分析

3.1 PMOs保守motif结构及进化分析

3.2 嗜热毛壳菌RNA的提取,cDNA获得

3.3 PMOs基因片段的扩增

3.4 酵母工程菌构建

3.4.1 克隆载体的构建

3.4.2 表达载体pPICZαA-PMO的构建

3.4.3 PMOs工程菌的构建

3.5 PMOs蛋白的真核表达及分离纯化

3.6 PMOs蛋白质分子量和纯度鉴定

3.7 PMOs最适反应温度

3.8 PMOs反应最适pH

3.9 PMOs氧化活性以及产物的TLC鉴定

3.10 PMO5456的C4、C6氧化鉴定

3.11 PMO5456酶与纤维素酶的协同作用

4 讨论

4.1 嗜热毛壳菌AA9家族序列分析

4.2 PMOs基因的克隆表达

4.3 PMO5456氧化位点选择性

4.4 PMO5456协同作用

5 结论

5.1 PMO5456氧化区域选择性

5.2 PMO5456与不同类型纤维素酶的协同作用

6 参考文献

7 致谢

8 论文发表情况

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王美霞

导师: 李多川

关键词: 嗜热毛壳菌,家族,多糖单加氧酶,区域选择性,氧化,协同作用

来源: 山东农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 山东农业大学

分类号: Q936

总页数: 83

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