晏飞1胡月2董志3傅洁民4
(1武警重庆总队一支队卫生队重庆401329；2重庆江北区妇幼保健院重庆400020)
(3重庆医科大学药理学教研室重庆400016；4重庆医药工业研究院重庆400061)
【摘要】目的：探讨花旗松素(Taxifolin)对大鼠脑缺血/再灌注（cerebralischemia/reperfusion，CI/R）损伤的保护作用及其机制。方法线栓法制备大鼠大脑中动脉局灶性脑栓塞模型，缺血1h再灌注24h。光镜观察海马CA1区组织病理学改变；分光光度法测定脑组织中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、髓过氧化物酶（MPO）的活性；免疫组化法测定海马CA1区核因子-κB（NF-κB）的表达；RT-PCR法测定脑组织中细胞间粘附分子-1（ICAM-1）mRNA的表达。结果花旗松素能减轻脑组织病理学损害，降低脑组织MDA含量，升高SOD活性并降低MPO的活性以及ICAM-1mRNA和NF-κB的表达。结论花旗松素对大鼠CI/R损伤具有明显保护作用，其机制与其抑制脂质过氧化和抗炎有关。
【关键词】花旗松素脑缺血再灌注损伤脂质过氧化炎症反应
【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）05-0076-02
临床上处理脑缺血性损伤的原则是尽早恢复血液再灌注，使缺血脑组织重新得到氧的供应。恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现了更加严重的脑机能障碍，称之为脑缺血再灌注（cerebralischemiareperfusion,CI/R）损伤，抑制再灌注损伤成为目前治疗缺血性脑卒中的关键环节。花旗松素（Taxifolin）又名二氢槲皮素，是一种二氢黄酮醇类化合物，化学名为5，7，3'，4'-四羟基二氢黄酮醇。具有抗氧化、抗炎、抑制糖醛还原酶、抗病毒、抗肿瘤等作用[1–5]。本实验采用短暂阻塞大鼠大脑中动脉制备局灶性脑缺血1h再灌注24h模型，观察花旗松素对大鼠CI/R损伤的保护作用，并探讨其保护作用的机制。
1材料与方法
1.1实验动物健康雄性SD大鼠48只，SPF级，体重250～350g，由重庆市中药研究院实验动物研究室提供，许可证：SYXK(渝)2007-0004。
1.2主要试剂花旗松素（纯度≥98%，购自sigma公司），用乙醇进行溶解，再用生理盐水稀释成不同的浓度（乙醇含量不能超过0.001%）；氯化三苯基四氮唑(TTC，购自中国医药集团上海化学试剂公司)；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、髓过氧化物酶（MPO）试剂盒(均购自南京建成生物工程研究所）；兔抗NF-κBP65亚单位多克隆抗体（购自美国SantaCruze公司）；链霉亲合素-生物素-过氧化氢酶复合物(SABC)检测试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（购自武汉博士德公司）；PCR引物（上海生工合成）；RNA抽提纯化试剂盒，RT-PCR试剂盒（购自大连宝生物公司）；
1.3局灶性CI/R模型的制备参照Longa等[6]建立方法制备大鼠右侧大脑中动脉栓塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)模型。10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，分离、结扎并切断右侧颈外动脉，由颈外动脉残端沿颈总和颈内动脉缓慢插入头端膨大的尼龙栓线约18mm，阻塞大脑中动脉人口造成缺血。缺血1h后拔出栓线进行24h再灌注；假手术组仅分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，但不插入栓线阻断大脑中动脉血流供应。模型成功的标志：(1)右侧Homer征；(2)左侧出现以前肢为重的偏瘫。
1.4动物分组及给药48只大鼠随机分为4组，假手术（Sham＋NS）组、脑缺血再灌注（CI/R＋NS）组、花旗松素低剂量（CI/R＋0.5T）组和花旗松素高剂量（CI/R＋5T）组。缺血1h后，花旗松素低剂量组和花旗松素高剂量组分别经股静脉注射0.5ug?kg-1、5ug?kg-1的花旗松素，假手术组和脑缺血再灌注组注射相同体积的的生理盐水（NS），再灌注24h后处死。
1.5检测指标
1.5.1病理学观察以4%多聚甲醛在体灌流固定大鼠脑组织，取出脑组织后经固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色，光学显微镜观察。
1.5.2脑组织MDA含量及SOD、MPO活性测定再灌注24h后，迅速将大鼠断头处死，取缺血侧皮层和尾状核组织，制备10%脑组织匀浆。按试剂盒说明测定MDA含量和SOD、MPO活性。
1.5.3免疫组织化学染色检测NF-κB活性石蜡切片经脱蜡，微波抗原修复，新鲜配制的3%H2O2溶液灭活内源性过氧化物酶后，0.1molPBS洗；加兔抗NF-κBP65，经预定实验定为稀释度1:200，37℃，1小时后置4℃过夜，再用0.1MPBS冲洗；依次加入生物素化羊抗兔和辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，DAB显色。阳性细胞为光镜下细胞核内出现棕黄色物质。
1.5.4RT-PCR法检测ICAM-1的mRNA表达用RNA抽提纯化试剂盒提取大鼠大脑皮层总RNA进行RT-PCR扩增。RT-PCR引物如下：ICAM-1(上游：5'-GGCGTCCATTTACACCTATTA-3'，下游：5'-TTCCTTTTCTTCTCTTGCTTG-3'；413bp)；GAPDH(上游：5'-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3'，下游：5'-AGATCCACAACGGATACATT-3'；307bp)。条件：94℃预变性5min，94℃变性30S、58℃退火30S、68℃延伸1min共35个循环。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，Quantityone4.5.0软件进行分析，以目的基因与GAPDH的吸光度比值作为ICAM-1mRNA表达的相对值。
1.6统计学处理结果均以x-±S表示，采用SPSS10.0统计软件进行统计分析。多组均数之间的比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)。
2结果
2.1花旗松素对CI/R大鼠脑组织病理学影响脑缺血lh再灌注24h可使脑组织海马CA1区产生明显的神经元损伤，表现为锥体细胞变性呈三角形，核浓缩而深染，数目明显减少，排列紊乱。脑缺血后给予花旗松素，细胞数目增加，可见明显核仁，排列较整齐，形态趋于正常，见图1。
图1花旗松素对缺血脑组织病理学影响（A:Sham＋NS;B:CI/R＋NS;C:CI/R＋0.5T;D:CI/R＋5T;HE，×400）
2.2花旗松素对CI/R大鼠脑组织中MDA含量、SOD和MPO活性的影响脑缺血lh再灌注24h后，CI/R＋NS组大鼠脑组织MDA含量和MPO活性明显增加，SOD活性降低（P<0.01）。与CI/R＋NS组相比，花旗松素可不同程度降低脑组织MDA含量，升高SOD活性，降低MPO活性，呈剂量依赖性（P<0.05），见表1。
表1花旗松素对CI/R大鼠脑组织中
MDA含量、SOD和MPO活性的影响(x-±s,n=6)
1)与Sham＋NS组比较：P<0.01，2)与CI/R＋NS组比较：P<0.05
2.3花旗松素对大鼠CI/R脑组织中NF-κB表达的影响脑缺血lh再灌注24h后，CI/R＋NS组大鼠脑组织NF-κB阳性细胞数明显增加（P<0.01）。与CI/R＋NS组相比，花旗松素可不同程度降低脑组织NF-κB阳性细胞数，呈剂量依赖性（P<0.05），见表2、图2。
表2花旗松素对大鼠CI/R脑组织中NF-κB表达的影响(x-±s,n=6)
1)与Sham＋NS组比较：P<0.01，2)与CI/R＋NS组比较：P<0.05
图2花旗松素对大鼠CI/R脑组织中NF-κB表达的影响（A:Sham＋NS;B:CI/R＋NS;C:CI/R＋0.5T;D:CI/R＋5T;SABC，×400）
2.4花旗松素对大鼠CI/R脑组织中ICAM-1mRNA表达的影响Sham＋NS组的大鼠脑组织中ICAM-1mRNA表达量低。脑缺血lh再灌注24h后，CI/R＋NS组大鼠脑组织中ICAM-1mRNA表达明显增加。与CI/R＋NS组相比，CI/R＋5T组ICAM-1mRNA的表达明显受到抑制（P<0.05），见图3。
图3花旗松素对大鼠CI/R脑组织中ICAM-1mRNA表达的影响。
*与CI/R＋NS组比较：P<0.05
3讨论
CI/R损伤中，自由基的生成、脂质过氧化、炎症反应是其重要的损伤机制。因此抑制脂质过氧化，减少炎症反应成为治疗脑缺血再灌注损伤的重要方向。花旗松素可以减轻脑缺血再灌注对海马CA1区神经元细胞的损伤，提示花旗松素对CI/R具有保护作用。
ICAM-1属免疫球蛋白超家族成员，正常情况下表达少，但在脑缺血等病理情况下，ICAM-1明显上调，使得白细胞与血管内皮细胞间粘附力增加，进而贴壁、滚动、嵌塞微血管，造成局部血液动力学环境改变。白细胞跨过内皮细胞问隙进人周围组织，释放大量炎性介质和细胞因子，造成缺血区域的脑组织损伤。研究表明[7]，应用ICAM-1单克隆抗体能使缺血脑组织损伤体积缩小，使白细胞浸润明显降低。MPO主要存在于中性粒细胞的嗜天青颗粒中，每个细胞所含的酶量是一定的，测定MPO活性可定量反映脑组织内中性粒细胞浸润情况。本实验结果发现，大鼠脑缺血再灌注后脑组织中MPO活性以及ICAM-1mRNA表达明显升高，而花旗松素可明显降低缺血再灌注大鼠脑组织MPO活性和ICAM-1mRNA表达，发挥对缺血脑组织的保护作用。
NF-κB是从B淋巴细胞抽提物检测到的一种能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB序列特异性结合的核蛋白因子，广泛存在于中枢神经系统中。非激活状态NF-κB二聚体与其抑制分子(IκB)以无活性的形式存在于胞浆中。CI/R损伤后，IκB磷酸化与NF-κB分离，活化的NF-κB转入细胞核中与靶基因结合，上调细胞因子、粘附分子、c-反应蛋白的表达，促进炎症反应发生[8]。Howard[9]发现，使离体人大脑微血管内皮细胞经受低氧/复氧应激，NF-κB迅速被激活，而后ICAM-1表达显著增加，应用NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯后，NF-KB激活和ICAM-1表达上调均被阻断，提示NF-κB可能通过促进内皮细胞表达ICAM-1，从而在白细胞浸润中发挥始动作用。本实验中，大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织的NF-κB表达上升，且与ICAM-1mRNA的表达相一致，提示活化的NF-κB通过促进其靶基因ICAM-1的表达而引发缺血区脑组织过度的炎症级联反应，引起CI/R损伤。花旗松素可能通过抑制NF-κB激活，下调ICAM-1的表达，抑制白细胞在血管内皮的粘附，减轻炎症反应。
自由基产生过量能引起脂质、蛋白质和核酸的过氧化，使膜结构遭到破坏，细胞发生不可逆改变最终死亡，引起脑组织的微循环障碍和血脑屏障通透性增加，作为氧自由基清除剂的SOD因消耗增加而减少。脑缺血后血流重建时，脑和血清中脂质过氧化物水平增多，同时组织损害加重脂质过氧化产物MDA增加。本实验结果表明，花旗松素可明显减少脑缺血再灌注损伤脑组织中MDA的含量，提高SOD活力，提示花旗松素可能通过抑制自由基产生，提高抗氧化剂活力，减轻再灌注损伤。
本实验初步研究了花旗松素对CI/R损伤的保护作用及其可能的机制。结果显示花旗松素能够降低神经元的损失，抑制中性粒细胞浸润、炎症反应以及提高抗氧化活力，提示花旗松素通过抗炎和抗氧化发挥对CI/R损伤的抑制作用。
参考文献
[1]YunBS,LeeIK,KimJP,etal.LipidperoxidationsinhibitoryactivityofsomeconstituentsisolatedfromthestembarkofEucalyptusglobules〔J〕.ArchPharmRes,2000,23(2):147-50.
[2]WangYH,WangWY,LiaoJF,etal.Preventionofmacrophageadhesionmolecule-1(Mac-1)-dependentneutrophilfirmadhesionbytaxifolinthroughimpairmentofproteinkinase-dependentNADPHoxidaseactivationandantagonismofGprotein-mediatedcalciuminflux〔J〕.Biochem.Pharmacol,2004,67(12):2251–62.
[3]UdaY,PriceKR,WilliamsonGetal.Inductionoftheanticarcinogenicmarkerenzyme,quinonereductase,inmurinehepatomacellsinvitrobyflavonoids〔J〕.Cancerlett,1997,120(2):213-6.
[4]ChuSC,HsiehYS,LinJY.Inhibitoryeffectsofflavonoidsonmoloneymarineleukemiavirusreversetranscriptasc〔J〕.JNatProd.1992,55(2):179-83
[5]DeviMA,DasNP.Invitroeffectsofnaturalplantpolyphenolsontheproliferationofnormalandabnormalhumanlymphocytesandtheirsecretionsofinterleukin-2〔J〕.CancerLett,1993,69(3):191-6.
[6]LongaEZ,WeinsteinPR,CarlsonS,etal.Reversiblemiddlecerebralarteryocclusionwithoutcraniectomyinrats〔J〕.Stroke,1989,20(1):84-91.
[7]ZhangRL,ChoppM,LiY,eta1.Anti-ICAM-1antibodyreducesischemiccelldamageaftertransientmiddlecerebralarteryocclusionintherat〔J〕.Neurology,1994,44(9):1747-51.
[8]BarnesPJ,KarinM.Nuclearfactor-kappaB:apivotaltranscriptionfactorinchronicinflammatorydiseases〔J〕.NEnglJMed,1997,336(15):1066-71.
[9]HowardEF,ChenQ,ChengC,eta1.NF-kappaBisactivatedandICAM-1geneexpressionisupregulatedduringreoxygenationofhumanbrainendothelialcells〔J〕.NeurosciLett,1998,248(3):199-203.