过氧化物酶体通过乙酸调节气孔开度的研究

论文摘要

气孔是由一对保卫细胞围合而成的功能特异的微孔。保卫细胞可以持续的感知叶片所处的环境变化,并通过自身的舒张或者收缩,控制着气孔的开放与关闭。气孔运动调控植物蒸腾作用和光合作用的进行,平衡水分的散失和二氧化碳的固定。因此,气孔运动与农作物的生长发育、抗性以及农产品的产量和品质密切相关。调控气孔运动的决定性因素是保卫细胞的渗透势,而有机酸也在其中扮演了重要角色。随着苹果酸在调控气孔运动中的功能发现,关于有机酸调控气孔运动的其他证据也逐渐被揭示出来。植物体在受到干旱胁迫时会产生乙酸,而拟南芥中定位于过氧化物酶体的基因At BZU1/At ACN1（acetate non-utilizing 1,ACN1）可以利用游离的乙酸生成乙酰辅酶A,并最终产生苹果酸（malate2-）,平衡胞内的K+,调节细胞的膨压,从而调控气孔运动。基于之前的研究（Dong et al.,2018）,本实验探究了有机酸在调控气孔运动中所发挥的功能。通过用不同的有机酸处理叶片后发现,正常条件下苹果酸、草酰乙酸和乙醛酸可以促进气孔开放,而包括乙酸在内的丙酮酸、延胡索酸、异柠檬酸钠、柠檬酸、琥珀酸和α-酮戊二酸都不能促进气孔的开放。基于乙醛酸代谢的独特性,我们猜测过氧化物酶体可能参与了气孔运动的调控。利用线粒体特异性抑制剂鱼藤酮使线粒体的活性受到抑制之后,去探究过氧化物酶体的功能。结果表明,在鱼藤酮处理的条件下乙酸促进了气孔的开放。我们推测原因是过氧化物酶体利用乙酸生成了苹果酸。突变体bzu1的实验结果证明了我们的猜想。利用abcb14突变体进一步证明了在抑制剂和乙酸共同使用的条件下促进气孔开放的苹果酸是由保卫细胞自身合成的。对处理后的叶片内参与三羧酸循环和乙醛酸循环的酶基因的表达量进行分析后发现,处理后的叶片内线粒体活性降低而过氧化物酶体活性增强。这些结果综合证明,在抑制剂和乙酸共同处理的条件下,气孔开度增加的原因是过氧化物酶体利用乙酸生成了苹果酸。通过进一步的实验又发现,当保卫细胞中苹果酸的浓度过高时,琥珀酸对气孔的开放具有一定的抑制效应,并且琥珀酸和苹果酸可以协同调控气孔的开度。据报道,丙酮酸对于ABA诱导的气孔关闭具有负调控作用,而乙酸正是由丙酮酸转化而来的。因此,我们进一步探索了有机酸在ABA处理的条件下对气孔开度的调控作用。结果表明,ABA可以诱导气孔关闭,而乙酸和丙酮酸可以抑制ABA诱导的气孔关闭,而在突变体bzu1中没有这样的效应。对处理后叶片内参与三羧酸循环和乙醛酸循环的酶基因的表达量进行分析后发现过氧化物酶体活性增强。代谢组学分析发现,处理后叶片中的乙酸、苹果酸和乙醛酸有明显的积累,并且根据苹果酸含量上升的趋势来判断,其浓度的增加正是由于乙酸造成的。这些结果综合证明,处理后的叶片内过氧化物酶体活性增强,特别是由乙酸生成苹果酸这条代谢通路活性的增强。至此,我们在过氧化物酶体中发现了一种新的由At BZU1基因介导的乙酸盐-苹果酸分流,它可以调节保卫细胞的膨压,从而提高拟南芥植株的抗旱性。这不仅在过氧化物酶体中发现了一条可以调控气孔运动的代谢通路,也为传统的气孔运动调节机制“苹果酸生成学说”提供了有力证据,而且在提高拟南芥对干旱胁迫的抗性方面还具有重要的应用价值。

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摘要

ABSTRACT

缩写词

1 前言

1.1 气孔概述

1.2 气孔运动

1.3 保卫细胞的代谢与气孔运动

1.4 ABA对线粒体功能的影响

1.5 过氧化物酶体的功能

1.6 立题依据

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.2 常用生物学网站及实验软件

2.3 主要试剂及药品

2.4 实验所用的引物

2.5 实验仪器

2.6 溶液和培养基

2.6.1 实验中常用溶液的配制

2.6.2 植物生长常用培养基

2.7 实验方法

2.7.1 拟南芥材料的种植与培养

2.7.2 拟南芥基因组DNA的提取

2.7.3 拟南芥突变体纯合体的鉴定

2.7.4 DNA琼脂糖凝胶的配制

2.7.5 拟南芥叶片的处理与气孔开度的观察和统计

2.7.6 拟南芥叶片的处理及叶片中代谢物的提取

2.7.7 拟南芥代谢物的检测

2.7.8 拟南芥叶片的处理、RNA的提取以及c DNA的合成

2.7.9 荧光定量PCR检测目的基因表达水平

3 结果与分析

3.1 实验所用拟南芥材料的获得与鉴定

3.1.1 点突突变体bzu1 的鉴定

3.1.2 T-DNA插入突变体的鉴定

3.2 有机酸对气孔开放的调节

3.2.1 乙酸对气孔开度的调节

3.2.2 其他有机酸对气孔开放的调节

3.3 线粒体抑制剂作用下有机酸对气孔开度的调节

3.3.1 线粒体抑制剂作用下乙酸对气孔开度的调节

3.3.2 线粒体抑制剂作用下乙酸对bzu1 突变体气孔开度的调节

3.3.3 保卫细胞中苹果酸的来源

3.3.4 线粒体抑制剂作用下线粒体中酶基因的表达情况

3.3.5 线粒体抑制剂作用下过氧化物酶体中酶基因的表达情况

3.3.6 线粒体抑制剂和乙酸作用下琥珀酸的抑制效应

3.3.7 线粒体抑制剂作用下琥珀酸和苹果酸协同调控气孔开度

3.4 ABA作用下有机酸对气孔开度的调节

3.4.1 ABA作用下乙酸对气孔开度的调节

3.4.2 ABA作用下有机酸对bzu1 气孔开度的调节

3.4.3 ABA作用下突变体气孔开度分析

3.4.4 ABA作用下叶片内部与有机酸代谢相关的酶基因的表达情况

3.5 ABA作用下叶片内部的代谢组学分析

3.5.1 ABA作用下线粒体内有机酸的代谢变化

3.5.2 ABA作用下过氧化物酶体内有机酸的代谢变化

4 讨论

4.1 有机酸调节气孔开度的相关研究

4.2 乙酸如何调控气孔开度

4.3 ABA作用下乙酸对气孔开度的调节

4.4 代谢组学研究ABA作用下叶片内部的代谢变化

4.5 胁迫条件下光合作用的糖如何调节气孔开度

5 结论

参考文献

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张俊莹

导师: 张宇

关键词: 气孔,过氧化物酶体,气孔运动,有机酸

来源: 河南大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 河南大学

分类号: Q945

总页数: 75

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过氧化物酶体通过乙酸调节气孔开度的研究

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