张伟[1]2004年在《严重胸部创伤肺泡及间质巨噬细胞TLR4表达差异及意义》文中指出严重胸部创伤常并发创伤性急性肺损伤(acute lung injury，ALI)，并发展成为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。尽管对ARDS的研究已有30余年，但ARDS发生后的死亡率仍高居在50～60％，没有明显下降，其发病机制仍不清楚。对其发病机制的探讨是当今创伤研究领域的热点，也是临床工作中迫切需要解决的课题。 严重胸部创伤导致体内促炎介质和抗炎介质泛滥入血，一方面引起机体过度炎症反应，另一方面产生免疫功能抑制，引起全身免疫功能紊乱，使机体陷入难以控制的严重感染，在这个病理过程中，肺内巨噬细胞具有重要作用。巨噬细胞是肺组织内的常居细胞，是防御病原微生物和损伤的第一道防线，在启动天然免疫和获得性免疫中具有关键作用。同时，巨噬细胞具有功能异质性，不同巨噬细胞亚群在创伤后免疫紊乱机制中发挥不同效应。已证实在人和动物肺部中存在肺泡(AM)及间质(IM)巨噬细胞，两者具有功能异质性，在机体的免疫应答中发挥着不同作用。 前期研究表明，严重胸部创伤能引起机体内毒素(LPS)升高。新近发现的FLR4(Toll-like receptor 4)是Toll家族成员之一，被认为是LPS胞内信号转导的重要通路。TLR4启动的胞内信号转导最终激活NF-κB，从而诱导单核／巨噬细胞产生免疫炎性细胞因子、共刺激分子，或扩大非特异性防御反应，或诱发特异性免疫，因而是极为重要的天然免疫受体。将其应用于创伤研究领域，对阐明ALI的发病机制无疑具有重要科学意义，也为调控创伤后的免疫紊乱状态，防治创伤并发症提供理论基础。 基于以上认识，本研究通过建立大鼠严重胸部创伤模型，采用机械结合酶消化法分离AM与IM，对其进行形态学比较；动态观察创伤对AM、IM吞噬、抗原提呈以及分泌功能的影响；同时，利用Nothern、Western分子生物学技术检测创伤前后肺内两种巨噬细胞亚群TLR4 mRNA及蛋白表达水平的变化，探讨其作用机制，为临床防治创伤性ALI提供实验及理论依据。通过本课题研究我们得出以下结果和结论：第叁军医大学博士学位论文 1.用小型多功能生物撞击机以400KPa驱动压力对大鼠右侧上胸壁进行致伤，能够建立稳定可靠并符合临床特点的严重胸部创伤模型。 2.通过气管支气管、肺血管床耗竭灌洗，机械结合酶消化的方法可获取高纯度的肺间质巨噬细胞群，对于进一步研究其形态、功能具有十分重要意义。 3.大鼠AM与IM在形态结构上存在明显差异。 4.AM吞噬功能强于IM，创伤复合内毒素攻击对两种巨噬细胞的吞噬功能表现为先增强后抑制，复合LPS攻击能进一步增强创伤后IM的吞噬能力;IM抗原提呈功能强于AM，创伤复合内毒素攻击能抑制它们的抗原提呈功能;AM分泌TNF一Q强于IM;】M分泌几一6强于AM，创伤复合内毒素攻击能明显增强两者产生TNF-。、IL一6的能力。AM与IM具有功能异质性，在创伤后机体免疫功能紊乱状态中具有不同的地位，IM不应被单纯看作为AM的前体细胞。 5.AM、IM有基础TLR4表达，但两者有表达差异;创伤可上调TLR4在两种细胞内的表达，AM表达高峰在伤后8h，IM在伤后8，16h，TLR4的上调参与了创伤后失控性炎症反应的病理生理过程，本研究为创伤性急性肺损伤的发病机制提供了一定的实验及理论依据。
张伟, 蒋耀光, 谢志坚, 吕凤林, 胡承香[2]2004年在《急性肺损伤肺间质巨噬细胞TLR4的表达及意义》文中进行了进一步梳理目的 观察严重胸部创伤致急性肺损伤肺间质巨噬细胞TLR4基因及蛋白表达水平的变化,并探讨其意义。方法 建立严重胸部创伤致急性肺损伤模型。肺组织机械剪碎,然后用胶原酶、DNA酶消化肺组织,分离、培养肺间质巨噬细胞,利用免疫印迹蛋白、Northern Blot等分子生物学技术检测创伤前以及创伤后2、4、8、16和24 h肺泡巨噬细胞TLR4蛋白及基因表达。结果 利用小型多功能生物撞击机以400 kPa驱动压力对大鼠右侧上胸壁进行致伤,能够建立稳定可靠并且符合临床特点的严重胸部创伤模型;严重胸部创伤可以上调TLR4蛋白及基因在肺间质巨噬细胞内的表达,表达高峰在伤后8和16 h,伤后24 h恢复正常。结论 TLR4的上调参与了创伤后失控性炎症反应的病理生理过程。
杜权[3]2008年在《大鼠创伤后巨噬细胞TLR2/4的表达及神经内分泌激素的调节》文中认为创伤后常发生免疫抑制,易继发感染、脓毒症,甚至多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),最终影响结局。针对损伤、感染天然免疫很快启动非特异的细胞、体液反应,成为机体的第一道防线,其在创伤后炎症反应的发生、发展动态过程中具有重要作用。巨噬细胞是参与天然免疫的重要细胞,Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)家族中的两个重要受体TLR2、TLR4主要表达于巨噬细胞。近来发现TLR4不仅是LPS的模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs),还能识别众多内源性损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs),作为感知组织损伤的“哨兵”而介导无菌性炎症反应。TLR2能识别较TLR4更多的病原体,也参与了组织损伤后炎症反应。TLR2/4与各自的配体结合后,通过相似信号转导最终导致NF-κB活化,产生炎症细胞因子、趋化因子、共刺激分子等,并被认为在机体防御损伤、感染的天然免疫中具有开关作用。在发生天然免疫改变的同时机体发生了神经内分泌反应,表现为交感神经系统兴奋并伴以不同程度的下丘脑-垂体-肾上腺轴活化,产生肾上腺素(epinephrine,E)、去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)、糖皮质激素等,除了能调节机体一般功能外,由于神经-内分泌-免疫网络的存在,它们常影响免疫功能,以维持稳态。以往研究显示,创伤后腹腔、脾巨噬细胞对LPS的反应性降低,但其机理不清。TLR2/4是TLR家族两种主要的受体,其表达水平与对配体的敏感性密切相关。尽管对其信号转导进行了大量研究,但是对其表达的调节还不清楚。研究TLR2/4在创伤后表达变化及神经内分泌激素的调节,对于揭示创伤后免疫功能失常的机制并预防、治疗相关并发症以提高临床救治率均具有重要意义。基于以上认识,本研究采用大鼠创伤模型,以腹腔巨噬细胞为研究对象,进行了以下研究:采用RT-PCR动态观察了创伤后巨噬细胞TLR2/4 mRNA表达变化;以不同浓度Pam3CSK4、LPS刺激创伤后24小时的巨噬细胞,测定产生TNF-α水平以反映受体反应性;采用HPLC测定了创伤后24小时不同时间点血清E和NE水平的变化,同时,采用放射免疫法测定了血清ACTH、皮质醇、T3、T4、TSH、β-EP、PRL,观察了神经内分泌激素变化规律;进一步进行离体实验,以不同浓度皮质酮(corticosterone,CORT)、E、NE刺激巨噬细胞不同时间后,以实时定量PCR和半定量RT-PCR方法研究了TLR2/4 mRNA表达;最后,于创伤前行颈交感神经干离断术(TCST)以观察其对创伤后神经内分泌激素的可能调节作用。通过研究,得出以下结果:1.大鼠创伤后巨噬细胞TLR2/4 mRNA表达在伤后2小时后即降低,直至创伤后24小时。创伤后巨噬细胞对Pam3CSK4、LPS刺激后的反应性降低。2.大鼠创伤后2小时血E、NE水平即明显升高,ACTH、GC也明显升高,直至创伤后24小时。垂体-甲状腺轴变化表现为创伤后T3、T4均降低,但是TSH变化不显着。非垂体-肾上腺轴激素β-EP也于创伤后2小时即升高,PRL于创伤后24小时升高。3.CORT刺激巨噬细胞后能下调TLR2 mRNA表达,其作用具有时间、剂量依赖性,但是对TLR4 mRNA表达的影响不明显。E刺激巨噬细胞后能下调TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达,其作用也具有时间、剂量依赖性。不同浓度NE(0～10000ng/ml)刺激巨噬细胞不同时间(0～48小时)后不能明显下调TLR2/4 mRNA的表达。4.TCST不能减轻创伤后2小时明显神经内分泌激素变化,能降低24小时的血清NE、皮质醇水平。总之,本研究得出以下结论:1.大鼠创伤后巨噬细胞TLR2/4 mRNA表达降低,这对于防止创伤后机体过度炎症反应可能具有一定意义,但与此同时,也意味着机体对病原体(如G+、G-菌)处理能力降低。创伤后巨噬细胞反应性降低,可能与TLR2/4表达降低有关。2.大鼠创伤后发生明显神经内分泌反应,交感神经系统、HPA轴活化,并伴以垂体-甲状腺轴、非垂体-肾上腺轴激素明显变化,共同调节机体以维持稳态。3.较高水平CORT、E刺激巨噬细胞较长时间后能下调TLR2 mRNA或TLR4 mRNA表达。4.TCST能一定程度减轻创伤后神经内分泌激素变化,可能有一定意义。通过研究,为创伤后TLR2/4表达变化及其调节提供了一定的实验及理论依据。
吴英达[4]2004年在《肺泡表面蛋白A对内毒素诱导的肺泡巨噬细胞活化的免疫调节作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理肺的免疫防御系统是机体最易于受到病原微生物攻击的原发性防御体系，肺内的原发性防御包括结构上的防御，气道内的抗微生物体分子防御以及由局部肺泡巨噬细胞和炎症后聚集到肺内的多聚核白细胞(PMNs)提供的吞噬性防御。肺的原发性抗微生物体防御主要是肺上皮细胞，局部肺泡巨噬细胞和原发性免疫系统的蛋白质组分。过去10年来的研究提供了充分的证据表明，肺泡腔中的表面活性物质组分肺泡表面蛋白A(SP-A)作为肺内原始的内源性的免疫调节剂发挥着重要的作用。位于肺的液气交界面的肺泡表面活性物质由大约90％的脂质和10％的蛋白质组成，脂质中90％为磷脂，主要(75％)是二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC)使得肺泡呼气末表面张力较小。蛋白质组分中包含水溶性的表面蛋白A(Surfactant protein A，SP-A)和SP-D，以及脂溶性的SP-B和SP-C。SP-A的结构、分布和特性使得人们预期它的功能主要在于肺泡膜的形成和肺泡表面张力的减少，但是SP-A-／-鼠的研究却并不能肯定SP-A在表面活性物质代谢中的主要作用，这些基因缺陷鼠的呼吸功能大多正常而对许多病原微生物的易感性较之野生型鼠却大为增加，这些结果充分说明SP-A的主要功能在于调节肺的免疫反应。 细菌内毒素(Lipopolysaccharide，LPS)是最早明确的SP-A的特异性配体之一，离体研究表明无LPS的SP-A不仅抑制了LPS诱导的细胞反应，而且增加了细胞对LPS的去乙酰化和清除。后者被认为有助于免疫细胞对LPS的解毒作用。更重要的是，SP-A-／-鼠较野生型鼠在LPS刺激后支气管内产生更多的TNF-α和NO，气管内给以外源性的SP-A则能纠正这些野生型鼠对LPS的反应。这些离体和在体的研究结果都强有力的提示了SP-A在调节LPS诱导的细胞反应中起着重要的作用。本实验研究着重探讨了SP-A的抗炎性作用与LPS诱导的NF-κB／IκB-α信号转导通路之间的关系。 首先，本研究结果表明就基础状态下TNF-α的释放和NF-κB的活化而言，SP-A对细胞没有刺激作用。Western印迹法显示SP-A剂量依赖地增加了IκB-α的基础水平，由于中等量的IκB-α增加即足以使核内p65再分布到胞浆内，因此SP-A导致的NF-κB 浙江大学博士学位论文一9-活化抑制很可能是IKB一a增加的结果。SP一A对NF一KB的影响在转染CD14和TLR的CHO细胞上也得到确认，流式细胞仪分析转染细胞膜表面CD25表达的结果说明TLRZ和TLR4都不是SP一A的应答性配体。上述结果强烈的提示本实验中所用的SP一A无内毒素和脂肤的污染。 其次，本研究发现SP一分别抑制了肺泡巨噬细胞内R-以及S一LPS诱导的细胞活化。在LPS刺激下，对照组细胞的胞浆IKB一。在30一40分钟左右迅速降解，1小时左右再度出现，而在SP一A预处理的实验组，胞浆IKB一。显着增加并提前再度出现。最新的研究发现IKB一a的抑制作用不仅仅是把NF一KB滞留在胞浆中，而且在核内阻止NF一KB与特异性DNA序列结合并将核内NF一KB运回到胞浆中。由此作者认为SP一A通过增加IKB一a蛋白而下调NF一KB依赖的基因表达成为可能。既然SP一A对R一LPS和S一LPS诱导的细胞反应均有明显的抑制，R一LPS能与SP一A相结合的;而S一LPS不是SP一A的配体，因此SP一A的抑制作用看来不依赖于LPS与SP一A的结合程度，而更可能是与肺泡巨噬细胞直接作用而产生的。 对于SP一A抑制LPS诱导的细胞活化的机制最近才开始研究。SP一A介导的胞内IKB一a蛋白增加可能是由于蛋白质合成的增加，或者是降解的减少，或者是影响了蛋白质在胞内的再分布。因为IKB一a基因本身是NF一KB转录依赖的，以前多个研究和本研究均未能发现SP一A自身导致NF一KB活化，并且蛋白合成抑制剂CHX和Rl’- PCR的结果均未能发现SP一A在转录水平上影响IKB一a，因此SP一A对IKB一a的影响可能发生于转录后和/或翻译后水平。据最近的文献报道，信号依赖的IKB一a逆转是磷酸化介导的，本实验中sP一A对LPs诱导下IKB一a的积聚也是通过影响其诱导性的丝氨酸磷酸化而产生。在LPs刺激下，sP一A预处理导致了IKB一a的丝氨酸磷酸化明显抑制而其上流激酶IKK则增加。有意义的是SP一A本身并不影响IKB一a的丝氨酸磷酸化，值得注意的是，除了丝氨酸磷酸化，IKB一a还有几个其他的磷酸化位点，其中升r42的酪氨酸磷酸化据报道可以抑制其诱导性磷酸化。通过免疫沉淀，本研究结果证实SP一A能快速的、时间依赖的诱导了肺泡巨噬细胞内IKB一a的酪氨酸磷酸化，显然其具体磷酸化的位点还有待与进一步阐明。到目前为止，SP一A自身的信号通路有很多方面仍不了解，尽管有数个细胞表面蛋白被认为是SP一A的可能受体，我们还不能排除SP一A作用于细胞膜上受体 浙江大学博士学位论文一10-而产生全面的胞内抑制性信号，而IKB一a的酪氨酸磷酸化只属于其下游事件的这一可能性。另一方面，有报道大约55%膜结合的SP一A能快速的被肺泡巨噬细胞内吞，因此在进入肺泡巨噬细胞以后，SP一A还有可能通过蛋白质一蛋白质之间的相互作用修饰IKB一a蛋白，从而阻止其诱导性?
参考文献：
[1]. 严重胸部创伤肺泡及间质巨噬细胞TLR4表达差异及意义[D]. 张伟. 第叁军医大学. 2004
[2]. 急性肺损伤肺间质巨噬细胞TLR4的表达及意义[J]. 张伟, 蒋耀光, 谢志坚, 吕凤林, 胡承香. 中国危重病急救医学. 2004
[3]. 大鼠创伤后巨噬细胞TLR2/4的表达及神经内分泌激素的调节[D]. 杜权. 第叁军医大学. 2008
[4]. 肺泡表面蛋白A对内毒素诱导的肺泡巨噬细胞活化的免疫调节作用及其机制研究[D]. 吴英达. 浙江大学. 2004