基于DNA纳米技术的细胞膜界面调控

论文摘要

本论文将DNA纳米技术用于细胞膜的界面调控。细胞膜对细胞的生长代谢、胞吞与胞吐、信号转导、迁移和凋亡等生命活动有重要作用。而如何表征和控制细胞膜的生理过程就成了细胞生物学研究中的一个重要课题,传统的材料在细胞膜上相互缠绕,难以实现对细胞膜的精确调控。本论文立足于细胞膜界面调控这个科学问题,利用DNA分子精确的碱基互补配对原则和可编程性,合成各种DNA纳米结构,实现对细胞膜界面的定量调控,为细胞膜的研究提供新的视野和方法。本论文主要内容包括胆固醇—DNA修饰细胞膜、DNA四面体框架核酸（framework nucleic acids,FNA）监测囊泡膜融合动力学、DNA纳米机器控制细胞膜胆固醇寡聚化与解聚化、DNA Origami介导细胞连接与细胞cluster内通讯和人工构建胞体-胞体突触间神经递质监测五方面内容。具体内容如下:（1）把DNA修饰到细胞膜上后,利用DNA的碱基互补原则和可编程性来表征、控制细胞膜,进而研究细胞的功能。这些研究的先决条件是要把DNA修饰到细胞膜上,我们利用胆固醇—DNA直接修饰细胞,这种方法不但能对悬浮细胞,而且还能对贴壁细胞实现快速修饰。（2）囊泡的融合是神经类细胞信息传递中的重要过程。我们构建了基于DNA四面体的FNA,它能快速响应pH的变化,并通过与胆固醇-DNA链杂交锚定在PC12细胞膜上。FNA通过胞吞进入细胞囊泡内后,稳定锚定在囊泡内膜上;并且囊泡内含有多个FNA。当囊泡释放时,FNA这些性质使之可以用来实时监测囊泡膜融合的动力学,明确区分囊泡完全融合与部分融合这两种不同模式,并能指示完全融合时囊泡膜的融合速度。（3）细胞膜分子的寡聚化和去寡聚化是其发挥生理功能的普遍机制。我们构建了新型DNA纳米机器,通过支点介导的DNA链置换反应,可以在活细胞膜上实现胆固醇寡聚化（包括二聚化和三聚化）,并能实现其逆过程——解聚化。此外,我们发现胆固醇寡聚化后主要分布在细胞膜脂筏区域,具有生物学应用的潜能。这种DNA纳米技术为细胞膜分子的相互作用研究和调控提供了新的方法。（4）细胞cluster对细胞间通讯、组织和器官形成、免疫反应和癌症转移至关重要。然而,精确控制细胞cluster的形成和研究cluster相互作用仍然是一个巨大的挑战。我们开发了基于DNA Origami这种纳米结构的细胞cluster构建技术,利用DNA Origami的可编程性,我们构建了各种各样的细胞cluster模式。基于简单的细胞cluster模式,我们研究了它们的接触式细胞间通信:基于间隙连接的分子扩散、基于隧道纳米管的膜泡运输和细胞免疫。（5）生物体内具有各种各样的神经突触,然而现在分析单个孤立突触间的递质释放仍然是一个巨大挑战。我们利用DNA Origami在体外构建了孤立的单个胞体-胞体突触,并用碳纤维纳米电极实时监测了突触间的神经递质释放。这种细胞连接和纳米电极耦联的方法为突触间递质监测的研究提供了新的视野。

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摘要

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第1章绪论

1.1 DNA纳米技术

1.2 DNA分子修饰细胞膜的方法

1.2.1 DNA分子共价修饰细胞膜

1.2.2 DNA分子基于特定基团修饰细胞膜

1.2.3 DNA分子基于疏水相互作用修饰细胞膜

1.3 DNA分子功能化细胞膜

1.3.1 DNA分子研究细胞膜分子的相互作用

1.3.2 DNA分子控制细胞膜分子的相互作用

1.3.3 DNA分子监测细胞膜微环境

1.3.4 DNA分子介导细胞连接

1.4 本课题的设计

第2章基于胆固醇—DNA的活细胞膜修饰

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 实验试剂与仪器

2.2.2 实验步骤

2.2.2.1 DNA定量

2.2.2.2 细胞培养

2.2.2.3 DNA修饰细胞膜

2.2.2.4 共聚焦显微镜成像

2.2.2.5 扫描电子显微镜成像

2.3 结果与讨论

2.3.1 胆固醇—DNA修饰悬浮细胞L1210

2.3.2 胆固醇—DNA修饰贴壁细胞PC12

2.3.3 细胞膜被修饰后仍具有流动性

2.4 结论

第3章 FNA监测囊泡膜融合动力学

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 实验试剂与仪器

3.2.2 实验步骤

3.2.2.1 FNA 的合成与 PAGE 表征

3.2.2.2 FNA 的 AFM 与 CD 表征

3.2.2.3 FNA和量子点细胞外荧光光谱表征

3.2.2.4 FNA细胞外单分子荧光表征

3.2.2.5 FNA锚定细胞膜

3.2.2.6 细胞胞吞摄入FNA

3.2.2.7 DNA在细胞中的取代反应

3.2.2.8 囊泡动力学监测

3.3 结果与讨论

3.3.1 FNA在体外的表征

3.3.2 FNA稳定锚定在细胞膜上

3.3.3 FNA胞吞后定位于囊泡中

3.3.4 囊泡膜融合动力学的监测

3.4 结论

第4章 DNA纳米机器介导细胞膜胆固醇寡聚化和解聚化

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 实验试剂与仪器

4.2.2 实验步骤

4.2.2.1 DNA纳米机器的合成

4.2.2.2 DNA纳米机器的荧光光谱表征

4.2.2.3 DNA纳米机器锚定细胞膜

4.3 结果与讨论

4.3.1 DNA纳米机器锚定在细胞膜上

4.3.2 DNA纳米机器诱导细胞膜胆固醇寡聚化

4.3.3 DNA纳米机器诱导细胞膜胆固醇解聚化

4.3.4 胆固醇寡聚化后定位于细胞膜脂筏

4.4 结论

第5章 DNA Origami 介导的细胞连接和细胞 cluster 内通讯

5.1 引言

5.2 实验部分

5.2.1 实验试剂与仪器

5.2.2 实验步骤

5.2.2.1 DNA Origami 的合成

5.2.2.2 DNA 的 AFM、SEM 表征

5.2.2.3 DNA 与 SPDP 交联

5.2.2.4 细胞染色

5.2.2.5 细胞修饰DNA与细胞连接

5.2.2.6 细胞 cluster 内钙黄绿素运输

5.2.2.7 细胞 cluster 内膜泡运输

5.2.2.8 T细胞免疫

5.3 结果与讨论

5.3.1 DNA修饰细胞膜

5.3.2 DNA Origami 介导细胞连接

5.3.3 细胞 cluster 内细胞通讯

5.3.3.1 间隙连接通讯

5.3.3.2 TNT膜泡运输

5.3.3.3 细胞凋亡与拯救

5.3.3.4 细胞免疫

5.4 结论

第6章人工构建胞体—胞体突触及突触间递质释放实时监测

6.1 引言

6.2 实验部分

6.2.1 实验试剂与仪器

6.2.2 实验步骤

6.2.2.1 DNA Origami 的合成与表征

6.2.2.2 细胞染色

6.2.2.3 细胞修饰DNA与细胞连接

6.2.2.4 碳纤维纳米电极CFNE制备与表征

6.2.2.5 突触间递质释放监测

6.3 结果与讨论

6.3.1 细胞连接形成胞体-胞体突触

6.3.2 碳纤维纳米电极CFNE制备与表征

6.3.3 碳纤维纳米电极CFNE插入胞体-胞体突触间隙

6.3.4 胞体-胞体突触间隙递质释放监测

6.4 结论

第7章总结与展望

参考文献

致谢

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果

文章来源

类型: 博士论文

作者: 刘江波

导师: 宋世平

关键词: 纳米技术,细胞膜界面调控,囊泡膜融合,胆固醇寡聚化,细胞连接

来源: 中国科学院大学(中国科学院上海应用物理研究所)

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 中国科学院大学(中国科学院上海应用物理研究所)

分类号: Q241

总页数: 156

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